Um compartimento Multi-glia do SNC Neuron-Co-cultura plataforma microfluídica

A fabricação do dispositivo microfluídico para co-cultivo de neurônios com múltiplos compartimentos começa com a definição de reservatórios no bloco de PMMA utilizando uma máquina de fresagem, seguida da prensagem a quente de matrizes de microcanais que conectam os compartimentos. Uma vez que o molde A-P-M-M-A tenha sido preparado, o molde mestre A-P-D-M-S é replicado a partir do molde de PMMA e revestido com tricloroetileno. O dispositivo final é replicado a partir do molde mestre de PDMS e montado em uma placa de cultura revestida com PDL.

Neurônios primários de ratos E16 a E18 são então carregados no compartimento do soma e cultivados por duas semanas antes de adicionar P um ou dois oligodendrócitos de rato sobre as camadas axonais no interior do compartimento de axônios para co-cultivo. Olá, eu sou J Par do Laboratório de Sistemas Nano Bio, do departamento de Engenharia Elétrica e da Computação da Universidade Texas A&M. Hoje vamos mostrar um procedimento para fabricar uma plataforma de co-cultivo neuronal microfluídica com múltiplos compartimentos.

Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a interação entre neurônios e glia do sistema nervoso central in vitro. Então, vamos começar. Para iniciar este procedimento, use uma fresadora micro para criar compartimentos com profundidade de 3,5 milímetros.

No bloco A-P-M-M-A, defina um compartimento de soma e seis compartimentos de axônio ggl. Após preparar os compartimentos, sonique e use isopropanol por 10 minutos para remover detritos, faça estruturas de microsulcos no lâmina de vidro utilizando litografia convencional e processo de ataque úmido; repouse os padrões de microsulcos do vidro por hot embossing. Deslize sobre o molde mestre de PMMA primeiro, alinhe manualmente o molde mestre de PMMA e o substrato de vidro.

Em seguida, eleve a temperatura para 115 graus Celsius em uma prensa quente. E, uma vez atingida a temperatura, aplique 0,5 tonelada de peso por cinco minutos. Após cinco minutos, resfrie até 40 graus Celsius e libere a pressão.

Agora, comece a preparar o molde de PDMS. Misture o pré-polímero de PDMS com o agente de cura na proporção de 10 para 1 em peso, corte o molde de PMMA em blocos de 50 milímetros por 50 milímetros. Usando uma serra de bancada, coloque-o dentro de um recipiente e despeje a mistura de PDMS sobre o molde de PMMA; coloque o recipiente em um dessecador conectado a uma bomba de vácuo e deixe sob vácuo por 15 minutos.

Para remover as bolhas geradas durante o processo de mistura do PDMS. Uma vez removidas todas as bolhas, coloque o recipiente em uma estufa nivelada a 85 graus Celsius por uma hora para polimerização. Agora que o PDMS está completamente curado, desprenda o molde de PDMS do molde de PMMA e vaporize o molde de PDMS colocando-o dentro de um dessecador com duas a três gotas de tricloroetileno e aplique vácuo por 15 minutos.

O revestimento do molde mestre de PDMS facilita a liberação do dispositivo final de co-cultura de neurônios do molde mestre de PDMS. Após o revestimento, o molde mestre de PDMS é brevemente enxaguado com álcool isopropílico para remover o excesso de tricloroetileno e secado com gás nitrogênio. A fabricação do dispositivo de co-cultura de neurônios a partir do polímero de PDMS é semelhante à preparação do molde mestre de PDMS descrita na seção anterior. Comece misturando o pré-polímero de PDMS com o agente opacificante numa proporção de 10 para 1 em peso e, em seguida, despeje a mistura de PDMS sobre o molde mestre de PDMS. É importante não despejar muito PDMS, de modo que a estrutura de PDMS com 3,5 milímetros de altura no molde mestre não fique totalmente imersa.

DGA dentro de um dessecador conectado a uma bomba de vácuo por 15 minutos. Quando todas as bolhas forem removidas, coloque o PDMS dentro de uma estufa nivelada a 85 graus Celsius por uma hora para polimerização. Após uma hora, retire o PDMS da estufa e deixe-o à temperatura ambiente para esfriar. Em seguida, desprenda cuidadosamente os dispositivos de cultura de neurônios de PDMS do molde mestre de PDMS.

Cubra os dispositivos de PDMS com parafórmio para protegê-los de poeira ou detritos. Finalize cortando o PDMS envolto em parafórmio em peças individuais usando uma furadeira de bancada equipada com uma lâmina; os dispositivos de PDMS para co-cultura de neurônios estão quase prontos para uso em placas de cultura celular. Antes de colocar o dispositivo de PDMS para co-cultura de neurônios em uma placa de cultura celular, coloque o dispositivo dentro do limpador de plasma e exponha ao plasma de ar por 90 segundos para tornar a superfície hidrofílica.

Este tratamento facilitará o preenchimento dos microcanais com meio de cultura após a montagem em placas revestidas com poli-l-lisina. Para esterilizar o dispositivo tratado com plasma, imerja-o em etanol 70% por 30 minutos e transfira o recipiente para a cabine de fluxo laminar estéril. Após 30 minutos, retire o dispositivo e seque com gás nitrogênio filtrado por um filtro Millipore de 0,2 mícrons.

Em seguida, coloque os dispositivos secos sobre uma placa de cultura de seis poços de poliestireno revestida com poli-D-lisina e aplique pressão suave para garantir um selamento adequado entre a superfície da placa de cultura e o dispositivo de gelo. Agora, preencha o compartimento do corpo celular com meio de cultura. Aguarde um ou dois minutos para garantir que não haja bolhas aprisionadas nos microcanais.

Em seguida, preencha os seis compartimentos axônio-glia. Por fim, incube os dispositivos preenchidos com meio de cultura em uma estufa a 37 graus Celsius durante a noite para remover qualquer resíduo tóxico ou detrito possível. Após a incubação noturna, a cultura pode ser iniciada para preparar o carregamento celular no dispositivo.

Utilize uma pipeta para aspirar o meio de cultura dos compartimentos de Soma e Axônio. Em seguida, carregue 40 microlitros de células neuronais primárias do cérebro anterior de ratos do dia embrionário 16 a 18 no compartimento do soma ao redor das entradas dos microcanais, com uma densidade aérea de 500 células por milímetro quadrado. É importante não tocar o dispositivo de PDMS durante o carregamento das células, pois isso pode romper o selo entre o dispositivo e a placa de cultura celular.

Essas imagens microscópicas mostram células neuronais coradas com amido de cálcio. Dentro do compartimento do corpo celular, as células estão uniformemente carregadas dentro do compartimento e localizadas próximas aos canais microfluídicos. Incube os dispositivos carregados com as células por 30 minutos em um incubador a 37 graus Celsius para melhorar a adesão celular ao substrato.

Após essa incubação, preencha todos os compartimentos com meio de cultura. Mantenha as células crescendo no dispositivo a 37 graus Celsius em uma estufa úmida com 5% de CO₂, trocando apenas metade do meio de cultura a cada três ou quatro dias. Uma rede axonal densa deve se formar dentro dos compartimentos de axônio e glia.

Após duas semanas de cultivo, após 14 dias de cultivo, as células CLIA de neurônios primários in vitro são adicionadas antes do carregamento; aspire aproximadamente 60% do meio de cultura dos compartimentos. Os oligodendrócitos foram dissecados dos hemisférios cerebrais de ratos Sprague Dawley no período pós-natal. No primeiro ou segundo dia, adicione cinco microlitros de células de oligodendrócitos a cada compartimento axônio-glia, com uma densidade areal de 1000 células por milímetro quadrado. Deve-se ter cuidado para não tocar o substrato inferior com a pipeta durante o carregamento, pois isso pode danificar a rede axonal formada sobre o substrato. Após a adição dos oligodendrócitos, incube as células por uma hora a 37 graus Celsius e, em seguida, complete os compartimentos.

Com o meio de cultura, continue a cultivar os neurônios como antes da adição do CLIA, trocando apenas metade do meio de cultura a cada três ou quatro dias, durante mais duas semanas, enquanto estuda o sistema nervoso central de mamíferos. A interação axônio-glial ocorre quando os experimentos são realizados corretamente. As células neuronais carregadas no compartimento do soma se localizam próximas às entradas dos microcanais, e uma camada axonal começa a se formar dentro dos compartimentos de axônio Ggl.

Após uma semana de cultivo, sinais de agregação de células neuronais dentro do compartimento do corpo celular podem indicar que as células não estão saudáveis ao carregar oligodendrócitos. Após duas semanas de cultivo neuronal, os compartimentos axonais devem estar cobertos por uma camada densa de axônios, e os oligodendrócitos devem ser carregados sobre a camada axonal. Acabamos de mostrar como fabricar uma plataforma de cultivo neurológico multicompartmental e como utilizá-la para estudar a interação entre neuroglia e sistema nervoso central in vitro.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de proteger os dispositivos da poeira e de não esterilizá-los em etanol por muito tempo, pois isso pode comprometer a ligação. É isso. Obrigado por assistir e boa sorte em seus experimentos.