Name: Purificação de mitocôndrias de células de levedura (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-24T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Aprenda a purificar mitocôndrias de Saccharomyces cerevisiae usando homogeneização e centrifugação em gradiente de sacarose. Este método rápido garante alta pureza e integridade estrutural para estudos bioquímicos.

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Este trabalho foi financiado por concessões do CIHR e NSERC do Canadá. VIT é um CIHR New Investigator e Concordia University, em Cátedra de Investigação Genómica, Biologia Celular e Envelhecimento.

Materiais e métodos Cepas de leveduras e condições de crescimento A cepa do tipo selvagem BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) foi cultivado em meio YEPD rica (1% extrato de levedura, peptona 2%, 2% de glicose). Células foram cultivadas a 30 ° C com rotação agitação a 200 rpm em Erlenmeyers em um &quot;volume frasco de volume / médio&quot; proporção de 5:1. Isolamento da fração mitocondrial crude <ol><li> Crescer 1 L da cultura BY4742 tipo selvagem tensão por 48 h. </li><li> Despeje cultura em 500 ml tubos de centrífuga Nalgene. Equilibrar a carga e células de colheita por centrifugação por 5 min a 3000 xg à temperatura ambiente. </li><li> Decantar o sobrenadante e ressuspender as células peletizadas em 250 ml de dH2O. Pellet células por centrifugação por 5 min a 3000 xg à temperatura ambiente. </li><li> Decantar o sobrenadante e ressuspender as células peletizadas em 250 ml de dH2O. Pellet células por centrifugação por 5 min a 3000 xg à temperatura ambiente. </li><li> Determinar o peso úmido de pellet celular. </li><li> Ressuspender as células peletizada na TDT buffer [2 ml de células (peso úmido) buffer / g]. </li><li> Transferir a suspensão de célula para 50 ml, tubos de plástico Falcon. </li><li> Girar os tubos a 70 rpm em um agitador por 20 min a 30 ° C. </li><li> Células colheita por centrifugação por 5 min a 3000 xg à temperatura ambiente. </li><li> Ressuspender as células em tampão Zymolyase peletizadas sem Zymolyase [7 ml de células (peso úmido) buffer / g]. </li><li> Pellet células por centrifugação por 5 min a 3000 xg à temperatura ambiente. </li><li> Ressuspender as células em tampão Zymolyase peletizadas sem Zymolyase [7 ml de células (peso úmido) buffer / g]. </li><li> Transferência de suspensão de células para um balão de vidro. </li><li> Adicionar o pó de Zymolyase-100T [1 mg de células (peso úmido) Zymolyase-100T / g] para a suspensão de células. </li><li> Gire o frasco com suspensão de células em 70 rpm em um agitador por 30 min a 30 ° C. </li><li> Esferoplastos transferência formado devido à digestão da parede celular com Zymolyase-100T de 50 ml, tubos de centrífuga de plástico. </li><li> Pellet esferoplastos por centrifugação por 8 min a 2200 xg, a 4 ° C. </li></ol> ** Todas as etapas subseqüentes devem ser realizados a 4 ° C ou em gelo. Suspensões de esferoplastos devem ser manuseados com cuidado usando pipetas com pontas cortadas para evitar a quebra organelas .** <ol start="18"><li> Ressuspender esferoplastos peletizada na gelada tampão de homogeneização [6,5 ml de células (peso úmido) buffer / g]. </li><li> Pellet esferoplastos por centrifugação por 8 min a 2200 xg, a 4 ° C. </li><li> Ressuspender esferoplastos peletizada na gelada tampão de homogeneização [6,5 ml de células (peso úmido) buffer / g]. </li><li> Transferência de células para um pré-refrigeradas em gelo copo homogeneizador. </li><li> Usando um pilão apertado, homogeneizar as células, fazendo 15 batidas do pilão. </li><li> Adicionar um volume de gelada tampão de homogeneização. </li><li> Transferência esferoplastos homogeneizada a 50 ml tubos de centrífuga de plástico. </li><li> Pellet as células intactas, núcleos e partículas grandes por centrifugação por 5 min a 1500 xg, a 4 ° C. </li><li> Centrifugar o sobrenadante resultante para 5 min a 3000 xg, a 4 ° C. </li><li> Centrifugar o sobrenadante por 15 min a 12000 xg, a 4 ° C. </li><li> Decantar o sobrenadante e ressuspender em pellet gelada tampão de homogeneização [6,5 ml de células (peso úmido) buffer / g]. </li><li> Centrifugar por 5 min a 3000 xg, a 4 ° C. </li><li> Centrifugar o sobrenadante por 15 min a 12000 xg, a 4 ° C. </li><li> Decantar o sobrenadante e ressuspender pellet em 3 ml de gelado de buffer SEM. </li></ol> ** Embora esta suspensão é enriquecido na mitocôndria, que também contém outras organelas como o retículo endoplasmático (microssomos), Golgi e vacúolos. Para obter a mitocôndria pura, esta fração de petróleo mitocondrial pode ser submetido a fracionamento ainda, conforme descrito abaixo .** Purificação de mitocôndrias desprovida de contaminação por outras organelas <ol><li> Ml lugar de 1,5 gelada 60% (w / v) de sacarose na EM tampão em um tubo de centrífuga Beckman Ultra-Clear. </li><li> Sobreposição de 60% (w / v) de sacarose, com 4 ml de 32%, 1,5 ml de 23%, 1,5 ml de sacarose 15% (todos tampão wt / v em EM). </li><li> Coloque 3 ml da fração mitocondrial em bruto SEM tampão em cima de 15% (w / v) de sacarose. </li><li> Centrífuga em uma Ti SW41 rotor Beckman balançando-balde por 1 hora a 134.000 xg (33.000 rpm) a 4 ° C. </li><li> A mitocôndria forma intacta uma faixa marrom na interface de sacarose 60% / 32%. </li><li> Remova cuidadosamente sacarose até chegar a banda mitocondrial. </li><li> Retire a banda mitocondrial utilizando uma pipeta com uma ponta de corte e colocá-lo em um tubo de centrífuga Beckman para um rotor-5 MLS. </li><li> Encha o tubo com tampão de SEM. </li><li> Pellet as mitocôndrias pura por centrifugação em um rotor MLS-5 para 30 min a 10.000 xg (31.000 rpm) durante 30 minutos a 4 ° C. </li><li> Decantar o sobrenadante usandouma pipeta. </li><li> Use as mitocôndrias pura para a análise de funções mitocondriais, proteoma mitocondrial e lipidome e DNA mitocondrial. </li></ol> Reagentes <ol><li> TDT buffer [100 mM Tris/H2SO4 (pH 9,4), 10 mM ditiotreitol] (para 15 ml) <ul style="list-style-type:none;"><li> 1,5 ml de um tampão Tris/H2SO4 M (pH 9,4) </li><li> 150 mL de 1 M DTT </li><li> Volume para 15 ml </li></ul></li><li> Zymolyase tampão [20 mM fosfato de potássio (pH 7,4), 1,2 M sorbitol] (para 100 ml) <ul style="list-style-type:none;"><li> 2 ml de um tampão fosfato de potássio M (pH 7,4) </li><li> 60 ml de 2 M sorbitol </li><li> Volume de 100 ml </li></ul></li><li> Tampão de homogeneização [10 mM Tris / HCl (pH 7,4), 0,6 M sorbitol, 1 mM EDTA, 0,2% (w / v) BSA] (para 250 ml] <ul style="list-style-type:none;"><li> 2,5 ml de 1 M Tris / HCl (pH 7,4) </li><li> 75 ml de 2 M sorbitol </li><li> 500 mL de 500 mM EDTA </li><li> 0,5 g de BSA </li><li> Volume para 250 ml </li></ul></li><li> SEM buffer [10 mM MOPS / KOH (pH 7,2), 250 mM de sacarose, 1 mM EDTA] (para 250 ml) <ul style="list-style-type:none;"><li> 2,5 ml de 1 MOPS M / buffer KOH (pH 7,2) </li><li> 31,25 ml de 2 M de sacarose </li><li> 500 mL de 500 mM EDTA </li><li> Volume para 250 ml </li></ul></li><li> EM buffer [10 mM MOPS / KOH (pH 7,2), 1 mM EDTA] (para 250 ml) <ul style="list-style-type:none;"><li> 2,5 ml de 1 MOPS M / buffer KOH (pH 7,2) </li><li> 500 mL de 500 mM EDTA </li><li> Volume para 250 ml </li></ul></li></ol>

<ol><li>Voet, D., Voet, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Biochemistry.</a> , 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. (2004).</li>
<li>Suen, D. -F., Norris, K. L., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dynamics+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dynamics and apoptosis.</a> Genes Dev. 22, 1577-1590 (2008).</li>
<li>Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F. &amp, Hardwick, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+factors+with+dual+roles+in+death+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial factors with dual roles in death and survival.</a> Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).</li>
<li>Detmer, S. A., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+and+dysfunctions+of+mitochondrial+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Functions and dysfunctions of mitochondrial dynamics.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 870-879 (2007).</li>
<li>McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+more+than+just+a+powerhouse%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: more than just a powerhouse.</a> Curr. Biol. 16, R551-R560 (2006).</li>
<li>Balaban, R. S., Nemoto, S., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%2C+oxidants%2C+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria, oxidants, and aging.</a> Cell. 120, 483-495 (2005).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a declarar.

Este método permite o isolamento de alto rendimento de mitocôndrias puro de células de levedura. Mitocôndrias purificadas por esse método são essencialmente livres de contaminação por outras organelas e manter sua integridade estrutural e funcional após a sua purificação. O método descrito rendimentos mitocôndrias, que são adequados para células livres reconstituição de processos essenciais mitocondrial. Estas mitocôndrias altamente puro pode também ser usado para a análise da estrutura mitocondrial e funções, proteoma ...

purificação de mitocôndrias de células de levedura

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

As mitocôndrias são o principal local de produção de ATP durante o metabolismo aeróbico em eucariotas não fotossintéticos células<sup&gt; 1</sup&gt;. Essas organelas complexo também desempenham um papel essencial na morte celular por apoptose<sup&gt; 2</sup&gt; Sobrevivência da célula,<sup&gt; 3</sup&gt; Desenvolvimento, mamíferos<sup&gt; 4</sup&gt; Desenvolvimento, e função neuronal<sup&gt; 4</sup&gt; Sinalização, intracelular<sup&gt; 5</sup&gt;, Longevidade e regulação<sup&gt; 6</sup&gt;. Nosso entendimento desses processos biológicos complexos controlados pela mitocôndria depende métodos robustos para avaliar sua morfologia, sua proteína e composição lipídica, a integridade de seu DNA, e suas numerosas funções vitais. A levedura de brotamento<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;, Uma geneticamente e bioquimicamente eukaryote manipuláveis ​​unicelulares com genoma anotado e bem definidos, proteoma, é um modelo valioso para estudar os mecanismos moleculares e celulares subjacentes funções biológicas essenciais da mitocôndria. Para estes tipos de estudos, é crucial ter mitocôndrias de alta pureza. Aqui nós apresentamos uma descrição detalhada de um método rápido e eficaz para a purificação de levedura mitocôndrias. Este método permite o isolamento de mitocôndrias altamente puros que são essencialmente livres de contaminação por outras organelas e manter sua integridade estrutural e funcional após a sua purificação. Mitocôndrias purificadas por esse método são adequados para células livres reconstituição de processos essenciais mitocondrial e pode ser usado para a análise da estrutura mitocondrial e funções, proteoma mitocondrial e lipidome e DNA mitocondrial.

Nós descrevemos um método rápido e eficaz para a purificação de mitocôndrias da levedura<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;. Este método permite o isolamento de alto rendimento de mitocôndrias puro que são essencialmente livres de contaminação por outras organelas e manter sua integridade estrutural e funcional após a sua purificação.

Purificação de mitocôndrias de células de levedura

As mitocôndrias são o principal local de produção de ATP durante o metabolismo aeróbico em células eucarióticas não fotossintéticas1. Essas organelas complexas também desempenham...

Este protocolo começa convertendo células de levedura em esferoplastos por meio da digestão da parede celular com lisase, sendo os esferoplastos então homogeneizados utilizando um homogeneizador de vidro e teflon. O homogenato resultante é submetido duas vezes à centrifugação, para formar um sedimento de células não rompidas, núcleos e grandes detritos. Em seguida, o sobrenadante resultante é centrifugado por 15 minutos a 12.000 Gs para sedimentar as mitocôndrias.Finalmente, a fração mitocondrial bruta, que ainda contém outras organelas, é submetida à centrifugação por 60 minutos a 134.000 Gs em um gradiente de densidade de sacarose; mitocôndrias puras, livres de contaminação por outras organelas, são recuperadas na interface entre as camadas de sacarose a 60% peso por volume e 32% peso por volume. Olá, sou o Dr. Christopher Greg, do laboratório do Dr. Vladimir Tko, do departamento de biologia da Universidade Concordia. Hoje vou mostrar como isolar mitocôndrias da levedura Saccharomyces cerevisiae.Fazemos isso para estudar a dinâmica e as alterações relacionadas à idade que ocorrem nas mitocôndrias. Conforme as células envelhecem, vamos analisar as alterações no proteoma, no lipido e no DNA das mitocôndrias. Então, vamos começar.Inicie este protocolo cultivando a linhagem de levedura em dez frascos de duzentos e cinquenta mililitros, cada um contendo 50 mililitros de meio YP a 30 graus Celsius com agitação rotacional por 48 horas. Em seguida, transfira o cultivo para tubos de centrífuga Nalgene de 500 mililitros.Recolha as células por centrifugação durante cinco minutos a 3000 Gs à temperatura ambiente, decante o sobrenadante e ressuspenda as células em pelotas em 250 mililitros de água destilada; centrifugue as células durante cinco minutos a 3000 Gs à temperatura ambiente. Repita este passo: ressuspenda as células em pelotas em 250 mililitros de água destilada e centrifugue por cinco minutos.A 3000 Gs, à temperatura ambiente, pese o pellet celular úmido resultante, então re-suspenda as células sedimentadas no tampão DTT e transfira a suspensão celular para um frasco de 250 mililitros. Incube o frasco sob rotação a 70 RPMs, a 30 graus Celsius, por 20 minutos. Após os 20 minutos, recolha as células por centrifugação durante cinco minutos a 3000 Gs, à temperatura ambiente, re-suspenda as células no pellet no tampão Xs sem Xs e centrifugue por cinco minutos.A 3000 Gs, à temperatura ambiente, ressuspenda as células em pellet em tampão Zy sem Xs novamente e transfira a suspensão celular para um frasco de vidro. Adicione o pó de zy liase 100 T à suspensão celular e incube com rotação a 70 RPM em banho térmico a 30 graus Celsius por 30 minutos; a zy liase 100 T digerirá as paredes celulares para formar esferoplatas. Todas as etapas subsequentes à digestão de X previamente mostrada devem ser realizadas a quatro graus Celsius ou sobre gelo.As suspensões de esferoplastos devem ser manipuladas com cuidado, utilizando pipetas com ponteiras cortadas para evitar a ruptura de organelas. Após a conclusão da digestão de 30 minutos com XMO, transfira os esferoplastos para tubos plásticos de centrífuga de 50 mililitros, centrifugue por oito minutos a 2200 ×g a quatro graus Celsius, ressuspenda o pellet de esferoplastos S no tampão de homogeneização gelado e, em seguida, centrifugue os esferoplastos S por oito minutos a 2200 ×g a quatro graus Celsius.Resuspenda o pellet de esferoplastos em gelo. Adicione tampão de homogeneização frio e transfira as células para um homogeneizador de vidro previamente resfriado. Usando um pistilo ajustado, homogeneíze as células realizando 15 movimentos do pistilo.Adicione um volume igual de tampão de homogeneização gelado aos "splats" homogeneizados de S, e transfira-os para tubos plásticos de centrífuga de 50 mililitros. Centrifugue os "splats" homogeneizados por cinco minutos a 1500 Gs a quatro graus Celsius para formar um pellet de células não rompidas, núcleos e detritos grandes. Despeje o sobrenadante resultante em tubos novos e centrifugue por cinco minutos.A 3000 Gs a quatro graus Celsius. Após essa centrifugação, o sobrenatante resultante por 15 minutos a 12.000 Gs a quatro graus Celsius, decante o sobrenatante e ressuspenda o pellet em tampão de homogenização frio na presença de gelo.Reuspenda o precipitado por cinco minutos a 3000 Gs a quatro graus Celsius. Por fim, centrifugue o sobrenadante resultante por 15 minutos a 12.000 Gs a quatro graus Celsius, decante o sobrenadante e reuspenda o precipitado em três mililitros de solução gelada.Tampão SEM. Essa suspensão é a fração mitocondrial bruta. Embora esteja enriquecida em mitocôndrias, também contém outras organelas, como o retículo endoplasmático ou microssomos GOGI e VAs, para obter mitocôndrias puras.A suspensão será submetida a uma fração adicional, conforme descrito na próxima seção. Para iniciar a fracionamento da suspensão mitocondrial bruta e obter mitocôndrias puras, coloque 1,5 mililitros de sacarose a 60% peso por volume, fria em gelo, em tampão em um tubo de centrífuga Beckman UltraClear.Em seguida, sobreponha suavemente a sacarose a 60% com quatro mililitros de sacarose a 32%, 1,5 mililitro de sacarose a 23% e 1,5 mililitro de sacarose a 15%, todos em peso por volume em tampão SEM. Coloque três mililitros da fração mitocondrial bruta em tampão SEM sobre a sacarose a 15% em peso por volume. Centrifugue em um rotor oscilante Beckman SW 41 TI por uma hora a 134.000 ×g ou 33.000 RPM a quatro graus Celsius.Após a centrifugação, as mitocôndrias intactas formarão uma faixa marrom na interface entre 60% e 32% de sacarose. Remova cuidadosamente a sacarose até atingir a faixa mitocondrial utilizando uma pipeta com ponteira cortada, retire a faixa mitocondrial e coloque-a em um tubo de centrífuga Beckman. Para um rotor MLS cinco, encha o tubo com tampão SEM, pelotize as mitocôndrias puras por centrifugação em um rotor MLS cinco a 10.000 ×g ou 31.000 rpm por 30 minutos a quatro graus Celsius e despreze o sobrenadante.Essas mitocôndrias puras podem agora ser utilizadas para as análises de funções mitocondriais, proteoma mitocondrial e DNA mitocondrial. A fração mitocondrial crua nas fitas da esquerda e as mitocôndrias purificadas por centrifugação em gradiente de densidade de sacarose nas fitas da direita foram submetidas à eletroforese SDS-PAGE e imunoblotagem com anticorpos contra marcadores proteicos de várias organelas. A presença de mitocôndrias em ambas as preparações foi confirmada pela imunorreatividade de PO1P e COX1P. A imunoblotagem indicou a presença de DPM1P, FO13P e VPS10P, representando proteínas do retículo endoplasmático, lisossomos e complexo de Golgi, respectivamente, na fração mitocondrial crua.Em contraste, essas proteínas marcadoras não foram detectadas nas mitocôndrias purificadas, confirmando que o protocolo resultou em mitocôndrias livres de contaminação por outras organelas. Acabamos de mostrar como isolar mitocôndrias da levedura sace visier. Lembre-se apenas, ao realizar este experimento, de não deixar as células incubarem em zy lies 100 T por mais de meia hora, pois há o risco de degradar as proteínas de membrana ou proteínas de organelas que possam estar presentes nas células.Isso pode ser devido a proteases presentes no reagente. Além disso, quando você estiver prestes a isolar as mitocôndrias e o gradiente de sacarose, é possível congelar essas mitocôndrias a menos 20 graus antes de fazê-lo e depois descongelá-las antes de estar pronto para realizar efetivamente a etapa de centrifugação. É isso.Boa sorte com seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Contaminação de preparações dos ribossomos eucarióticos purificado por métodos tradicionais de co purificação de proteases e nucleases negativamente impactos sobre a jusante análises bioquímicas e estruturais. Um método de purificação cromatográfica rápida e simples é usado para resolver esse problema usando os ribossomos de levedura como um sistema modelo.

Purificação cromatográfica de Ribossomos Yeast Highly Active

Muitos mRNAs que codificam as proteínas mitocondriais são associados com a membrana exterior mitocondrial. Descreve-se um processo de fracionamento subcelular que visa o isolamento de mitocôndrias de levedura com seus mRNAs e ribossomos associados. Este protocolo pode ser aplicado a células cultivadas sob diversas condições, a fim de revelar os mecanismos de localização de mRNA e tradução localizada perto das mitocôndrias.

Isolamento de mRNAs Associated com mitocôndrias de levedura para estudar mecanismos de regionalização de Tradução

Aqui nós apresentamos um protocolo para expressar, solubilizar e purificar vários transportadores de borato eucarióticas com homologia à família de transportador de SLC4 usando o fermento. Também descrevemos um ensaio químico do cross-linking para avaliar as proteínas homomeric purificado para assembly multiméricas. Esses protocolos podem ser adaptados para outras proteínas de membrana desafiador.

Expressão, solubilização e purificação de transportadores eucarióticas borato

O genoma mitocondrial da levedura de Baker codifica oito polipeptídeos. O objetivo do protocolo atual é rotular todos eles e, posteriormente, visualizá-los como bandas separadas.

Rotulagem e Visualização de Produtos de Expressão do Genoma Mitocondrial no Saccharomyces cerevisiae de Levedura de Baker

Apesar dos avanços recentes, muitas proteínas mitocondriais de levedura ainda permanecem com suas funções completamente desconhecidas. Este protocolo fornece um método simples e confiável para determinar a localização subocondrial das proteínas, o que tem sido fundamental para a elucidação de suas funções moleculares.

Avaliação da Localização da Proteína Subocondrial em Budding Levedura Saccharomyces cerevisiae

Apresentamos um protocolo em duas etapas para isolamento de mitocôndrias de alta qualidade que é compatível com a descoberta e quantificação de proteínas em escala de proteoma. Nosso protocolo não requer engenharia genética e, portanto, é adequado para estudar mitocôndrias de quaisquer células e tecidos primários.

Isolamento sem etiquetas em duas etapas de mitocôndrias para melhor descoberta e quantificação de proteínas

Os sítios de contato mitocondrial são complexos proteicos que interagem com proteínas da membrana interna e externa mitocondriais. Esses sítios são essenciais para a comunicação entre as membranas mitocondriais e, portanto, entre o citosol e a matriz mitocondrial. Aqui, descrevemos um método para identificar candidatos que se qualificam para esta classe específica de proteínas.

Um método aprimorado para isolar locais de contato mitocondrial

Este trabalho explica como transformar mitocôndrias de levedura usando um método biolístico. Também mostramos como selecionar e purificar os transformantes e como introduzir a mutação desejada na posição alvo dentro do genoma mitocondrial.

Transformação mitocondrial em Baker

A respiração mitocondrial em células inteiras de levedura é um indicador valioso da bioenergética celular. Aqui, apresentamos um protocolo para quantificar esse fenótipo aplicável a diferentes espécies de leveduras.

Quantificação da respiração mitocondrial em células inteiras de levedura

A levedura de fissão Schizosaccharomyces pombe está emergindo como um modelo atraente para o estudo de mitocôndrias. Aqui, descrevemos um protocolo para analisar a abundância e montagem dos complexos respiratórios mitocondriais em S. pombe. Isso permite a caracterização das novas funções dos genes conservados na cadeia respiratória mitocondrial.

Análise da Expressão e Montagem de Complexos das Proteínas da Cadeia Respiratória Mitocondrial na Levedura de Fissão Schizosaccharomyces pombe

Aprenda a purificar mitocôndrias de Saccharomyces cerevisiae usando homogeneização e centrifugação em gradiente de sacarose. Este método rápido garante alta pureza e integridade estrutural para estudos bioquímicos.

Purificação de mitocôndrias de células de levedura

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