Tecido alvo quimeras embrionárias: Zebrafish celular Gástrula Transplante

Este procedimento começa alinhando embriões de peixe-zebra de célula única em uma placa de microinjeção. Microinjete uma solução fluorescente de dextrina no vitelo. Logo abaixo das células, os embriões injetados são os doadores para transplante.

Prepare os embriões doadores e hospedeiros e cultive-os até a fase escudo; coloque dois embriões injetados com dextrina revestida com DEC lado a lado em um poço de uma placa de transplante. Repita abaixo de cada par de doadores. Adicione um embrião hospedeiro por poço para direcionar as células transplantadas à região futura do diencéfalo do prosencéfalo, transplantando células de e para a linha média.

No ponto médio entre o polo animal e o escudo. Transplante células do gasa do doador para o Gasa do hospedeiro. Incube até 30 horas e fixe.

Realize a imunoquímica, se necessário, monte e image. Alternativamente, monte o espécime vivo e realize imagens com lapso de tempo. Olá, meu nome é Elizabeth De Shane do laboratório do Dr. Michael ESI do Departamento de Ciências Biológicas do Smith College em Northampton, Massachusetts.

E sou o pesquisador principal do laboratório, Dr. Michael Besi. Hoje vamos mostrar como criar embriões quiméricos realizando transplantes de células na fase de gástrula utilizando o sistema modelo de peixe-zebra. Utilizamos este procedimento em meu laboratório para estudar a função de genes específicos no desenvolvimento da comissura do prosencéfalo, bem como o processo de interações axônio-glial durante a formação da comissura.

Então vamos começar. Para iniciar, prepare moldes de canaletas para as placas de microinjeção quebrando cuidadosamente ao meio três capilares não filamentosos de um milímetro de diâmetro e quatro polegadas de comprimento. Usando cola supercola, cole duas das metades dos capilares lado a lado sobre uma superfície plana de cola.

O terceiro capilar, posicionado sobre esses dois, encaixa-se no sulco para formar uma forma de pirâmide. Com os três capilares, deixe o molde secar. Você deve fazer cerca de três a cinco moldes para cada placa de injeção.

Em seguida, prepare as placas de injeção despejando de 20 a 25 mililitros de aros fundido a 1,5% em meio embrionário em uma placa de Petri de 100 milímetros. Imediatamente coloque de três a cinco moldes de canaletas preparados no fundo da placa, garantindo que o lado plano do molde esteja encostado no fundo da placa de Petri e completamente coberto pelo aros. Quando o aros solidificar, remova os moldes de canaleta cortando um quadrado grande de aros que os contenha.

Remova suavemente o ágar da periferia do quadrado cortado e descarte-o. Vire a peça quadrada de ágar e, usando pinças finas, remova completamente os moldes de sulco. Despeje aros fundidos na placa de Petri ao redor do quadrado para manter os poços recém-moldados no lugar.

Deixe endurecer. As placas podem ser vedadas com parafilm e armazenadas por semanas a quatro graus Celsius. Devem ser descartadas se houver qualquer sinal de crescimento no ágar.

Por fim, para preparar as agulhas de injeção, utilize um puxador de capilares de micropipeta para fabricar as agulhas a partir de capilares de vidro de um milímetro e quatro polegadas com filamentos internos, com a placa de microinjeção e as agulhas já preparadas. Vamos agora observar a coleta de embriões e a montagem do aparelho de microinjeção. Os ovos fertilizados são coletados imediatamente após serem postos e mantidos em uma placa de Petri contendo meio embrionário.

Usando uma pipeta de vidro com ponta larga, expulse os embriões nos poços de uma placa de injeção mantida à temperatura ambiente, preenchida com meio para embriões. Use pinças rombas e fechadas para inserir suavemente os embriões no fundo das canaletas; descarte os embriões cujo córion ou vitelo tenham sido comprometidos.

Em seguida, carregue a agulha de injeção com um a dois microlitros de solução diluída de dextrina fluorescente Alexa 5 9 4. Deixe a dextrina deslocar-se até a ponta da agulha de injeção por ação capilar. Fixe a agulha de injeção ao suporte de capilar de um micromanipulador estereotáxico e ajuste a pressão no aparelho de microinjeção para começar.

40 a 50 PSI e uma duração de pulso de 500 milissegundos. Use pinça para suavemente raspar ou cortar a ponta da agulha de injeção e romper o selo. Idealmente, o diâmetro deve ser de 0,05 a 0,15 milímetros.

Para calibrar a agulha, utilize um microscópio estereoscópico e expulse a dextrina sobre um micrômetro com óleo mineral na superfície. Modifique o tamanho do bolo ajustando a duração da pressão de ar do pulso e o tamanho da agulha. Dica. Um tamanho de bolo equivalente a um volume de 0,8 a um nanolitro deve ser mantido durante todas as injeções.

Agora podemos iniciar a microinjeção de dextrina utilizando uma ampliação de aproximadamente 3,2 x em um microscópio estereoscópico. Comece as injeções nos embriões a partir de uma extremidade do sulco, perfurando suavemente o córion e a membrana celular dos embriões para penetrar no vitelo. Injete a solução de dextrina logo abaixo da célula.

Certifique-se de remover a agulha de injeção com o mesmo movimento suave utilizado para penetrar no embrião. Mova o recipiente de Petri para posicionar o próximo embrião em sequência e continue injetando ao longo do comprimento do sulco. Verifique periodicamente a pressão e o tamanho do bolo.

Agora, use uma pinça para empurrar suavemente os embriões para fora dos sulcos. Transfira-os para uma placa de Petri contendo meio para embriões com antibiótico. Incube os embriões a 28,5 graus Celsius e monitore-os quanto a ovos não fertilizados ou morte.

Os embriões estão agora prontos para futuros transplantes. Antes da conclusão de um poli durante a distribuição de gás, partes da gema permanecem expostas. A gema é extremamente frágil e aderirá, rasgando-se facilmente no plástico da placa de Petri.

Portanto, os embriões precisam ser recobertos em placas recobertas um dia antes de os transplantes serem realizados. Prepare essas placas de decoração despejando de cinco a 10 mililitros de aros fundido em uma placa de Petri de 100 milímetros. Apenas uma fina camada de aros, de cerca de dois a três milímetros, é necessária para amortecer os embriões durante a decoração.

Deixe as placas esfriarem. Em seguida, prepare placas separadas para transplante despejando 30 mililitros de solução de aros 1,5% em uma placa de Petri de 100 milímetros e insira um molde de poços para transplante. O molde deve conter 104 reentrâncias triangulares, cada uma composta por três lados de 90 graus e um lado inclinado de 45 graus.

Os poços são projetados para acomodar dois embriões lado a lado. Tenha cuidado para não aprisionar bolhas de ar sob o molde e deixe a agarose endurecer. A remoção do molde revela uma área rebaixada contendo os poços quadrados com uma borda inclinada.

Para preparar embriões receptores e doadores para transplante, seu desenvolvimento precisa ser monitorado para manter pareamentos com idades semelhantes. Para isso, os embriões podem ser criados em temperaturas variadas entre 23 e 31 graus Celsius para desacelerar ou acelerar o desenvolvimento. Tanto os embriões receptores quanto os doadores devem ser manipulados manualmente e revestidos em uma placa de revestimento revestida uma hora antes da idade desejada.

No caso de transplantes no estágio gastrula, isso precisaria ser concluído até cinco horas pós-fertilização ou HPF, antes do estágio de escudo em 5,5 HPF. Use uma pipeta de vidro para carregar os embriões hospedeiros e doadores em uma placa de transplante preenchida com meio embrionário contendo antibiótico. Aqui, a primeira linha é preenchida com embriões doadores, com dois embriões por poço, e as duas linhas seguintes são preenchidas com um único embrião hospedeiro por poço.

Para os transplantes, utilizamos um microscópio estereoscópico fluorescente Zeiss luer com zoom e controle de foco totalmente automatizados por joystick. Embora este microscópio automatizado não seja obrigatório, ele aumenta significativamente a facilidade e a eficiência desses transplantes cirúrgicos delicados, especialmente quando se deseja um grande número de transplantes. Para montar o aparelho de transplante, posicione o tram de ar einor na posição central de sua escala, conecte a tubulação do tram de ar ao suporte de capilar e fixe o suporte ao micro manipulador automatizado einor. Com os embriões e o aparelho de transplante preparados, podemos agora prosseguir para os transplantes de células em estágio gastro.

A habilidade mais crítica na realização de transplantes de células na fase gastrular é a capacidade de reconhecer a anatomia celular do lábio do blastóporo dorsal, também conhecido como escudo em peixes-zebra. Aqui apresentamos um filme sequencial da gástrula a partir de diferentes pontos de vista e destacamos onde o escudo está localizado nesta visão lateral. O escudo ou lado dorsal está à direita, dentro do contorno vermelho, para direcionar as células aos transplantes de cérebro anterior e à linha média.

Exatamente na metade entre o polo animal e o escudo, começaremos a girar o embrião primeiro em sua direção para visualizar o polo animal, destacando o escudo e o local de transplante ao longo do caminho. Em seguida, o embrião gira em torno de seu eixo para posicionar o escudo na parte inferior. O gasto agora gira novamente para cima, apresentando uma visão dorsal direta.

O embrião é agora girado novamente sequencialmente para uma vista lateral aos seis HPF. Usando o micromanipulador, toque suavemente o embrião com a ponta da micropipeta para posicioná-lo de modo que sua linha média e escudo sejam visíveis e fiquem opostos à ponta da micropipeta; embriões doadores são facilmente verificados alternando da iluminação em campo claro para a iluminação fluorescente. Aqui, as células do gastro fluorescem em vermelho; aspire uma pequena quantidade de meio do embrião para dentro da micropipeta para eliminar qualquer possibilidade de as células entrarem em contato com a interface ar-água, o que as danificaria.

Fure suavemente o ectoderma do embrião doador na linha média, exatamente entre o polo animal e o escudo. Havia apenas cerca de 20 micrômetros de células entre o ectoderma superficial e o vitelo subjacente na região gasa. Portanto, tenha cuidado para não perfurar o vitelo, pois isso frequentemente leva à morte em algumas horas.

Usando o trilho aéreo, aspire lentamente as células para dentro da capilar. Mantenha sempre visível a linha d'água, agitando levemente a ponta. Enquanto estiver dentro do doador, isso ajudará a soltar os contatos entre célula e célula.

Devem ser extraídas aproximadamente 10 a 50 células do embrião doador. Em seguida, remova a capilar do doador. Oriente de forma semelhante o hospedeiro e perfure, expelindo as células na mesma localização exata. Em um embrião hospedeiro, a troca da iluminação em campo claro para a iluminação fluorescente revela o movimento das células marcadas com dextrina na agulha capilar para dentro do embrião hospedeiro.

Por fim, após o transplante, remova os embriões doadores e hospedeiros dos poços. Separe-os e coloque-os suavemente em uma placa de Petri revestida com A, preenchida com antibiótico para embrião. Incube os embriões em meio a 28,5 graus Celsius com os transplantes completos.

Vamos começar a visualização e o imageamento. Os embriões são inicialmente fixados no estágio apropriado para imageamento, utilizando um conservante verificado para imunoquímica. No nosso caso, isso seria em formaldeído 4% por duas horas à temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius com rotação.

A seguir, lave os embriões fixados duas vezes e depois os lave por três a cinco minutos em PB 0,1 molar. Realize a imunomarcação adequada, se necessário.

Coloque os embriões em glicerol 75%, afunde-os à temperatura ambiente e armazene-os a quatro graus Celsius. Prepare uma lâmina para montar dois embriões criando dois contornos quadrados de vaselina na lâmina que correspondam ao diâmetro interno de um quadrado. Cubra cada embrião com uma lamínula e realize as dissecações necessárias para obter uma visão frontal do prosencéfalo.

Disseque o cérebro anterior cortando perpendicularmente através do mesencéfalo. Coloque este tecido com uma quantidade mínima de glicerol dentro do petróleo. Oriente adequadamente o tecido na posição apropriada e coloque uma lamínula sobre o espécime.

Alternativamente, para embriões vivos, monte-os em uma solução de agar a 0,75% sobre lâmina de vidro. Antes de o agar solidificar, utilize uma agulha de tungstênio para manipular o embrião e posicionar corretamente para a aquisição de imagens. Tanto os espécimes fixados quanto os vivos são submetidos à aquisição de imagens.

Utilizando o microscópio confocal de varredura a laser Leica SP, são adquiridas pilhas Z e é realizado o processamento de imagens tridimensional ou quadridimensional com o software Velocity para gerar embriões quiméricos nos quais alguma parte da população de astróglia dentro do embrião difere por genótipo ou fenótipo. Utilizamos uma abordagem multifacetada que combina o uso de embriões transgênicos GFP, que marcam a astróglia, com o transplante de células em estágio gastrular para direcionar especificamente nossos clones ao cefalão. Utilizamos o mapa de destino gastrular do peixe-zebra para extrair seletivamente células na linha média, equidistantes do polo animal e do escudo.

Essas células extraídas foram então transplantadas para o mesmo local em um hospedeiro do tipo selvagem gasa, que foi posteriormente criado até 30 HPF e imunomarcado para todos os axônios como referências anatômicas do cérebro anterior. No exemplo mostrado aqui, a imagem confocal de um embrião hospedeiro revela células isoladas positivas para GFP espalhadas por todo o cefalão e cefalão. A morfologia completa dessas células positivas para GFP pode ser observada neste ensaio clonal, revelando que a maioria dessas células adota a morfologia característica de gliócitos radiais, onde o corpo celular está localizado adjacente à zona ventricular e um grande pé terminal termina um processo radial na superfície externa.

A renderização tridimensional do Zack dessas fatias ópticas coletadas mostra claramente a posição dessas células em relação aos axônios marcados. Outra abordagem comumente utilizada para visualizar células transplantadas consiste em microinjetar inicialmente um corante fluorescente de linhagem celular no vitelo de um embrião selvagem de estágio de uma célula ou transgênico para GFP. Neste exemplo, injetamos dextrina Alexa 594 em embriões selvagens.

No estágio de uma célula, permitimos que se desenvolvessem até o estágio de escudo gasa e, em seguida, realizamos quatro transplantes direcionados ao cérebro conforme mencionado anteriormente. Contudo, em vez disso, transplantamos em embriões hóspedes transgênicos no estágio de gastrulação, realizando a imagem do céfalo dorsal por varredura a laser. A microscopia confocal revelou aglomerados fluorescentes vermelhos de células doadoras entre núcleos positivos para GFP dentro do prosencéfalo.

Analisamos ainda mais este hospedeiro coletando imagens do Zacks a cada três minutos ao longo de duas horas com o microscópio confocal de varredura a laser. A renderização quadridimensional deste lapso de tempo, utilizando o software Velocity da IMP Provision, mostra movimentos celulares dinâmicos das membranas celulares do domínio em forma de bastão e dos núcleos positivos para GFP. Acabamos de mostrar como preparar todos os aparelhos e reagentes necessários para transplantes celulares em embriões de peixe-zebra.

Specificamente, demonstramos a técnica no estágio gástrula. No entanto, ela também é aplicável a transplantes no estágio de blástula. Ao utilizar este procedimento, é importante correlacionar precisamente a localização final desejada das células transplantadas com a localização no mapa de destino precoce dessas células na gástrula. Consulte o estudo detalhado do Dr. Scott Frazier de 1995 sobre mapas de destino em peixe-zebra, intitulado Fate Maps of the Zebrafish Embryo, para orientação adicional.

É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.