Name: Rápido e sensível Colloidal Coomassie G-250 coloração para proteínas em gel de poliacrilamida (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-03T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Aprenda um protocolo modificado de coloração com Coomassie G-250 coloidal para detectar níveis nanograma de proteínas em géis de poliacrilamida. Este método rápido e sensível é ideal para aplicações em proteómica analítica.

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Agradecemos ao Dr. Nicola Wiethölter para a preparação e coloração de 1-D gels. Este trabalho foi financiado por uma doação da Deutsche Forschungsgemeinschaft (GRK 1089/project 5 a ND e SM) e apoiado por uma bolsa de pesquisa do Manchot Jürgen Stiftung para ND.

Parte 1: Two-dimensional eletroforese em gel (2-D), utilizando taça de carregamento <ol><li> IPG strip-reidratação e focalização isoelétrica (IEF) <ul><li> Reidratar géis DryStrip Immobiline, pH 6-11 (7 cm) em 125 mL de solução de reidratação [7 M uréia, 2 M tiouréia, 4% CHAPS, 50 hydroxyethyldisulfide mM e 2% IPG tampão pH 6-11] usando a bandeja DryStrip Immobiline Reswelling para pelo menos 10 horas. </li><li> Dissolver amostra de proteína precipitado em IEF tampão de amostra [7 M uréia, tiouréia 2 M, CHAPS 2%, 2% ASB-14, hydroxyethyldisulfide mM 50 e 2% IPG tampão pH 6-11] correspondente a 60-100 mg de proteína por 100 ml . </li><li> Após solubilização (pelo menos 30 minutos em temperatura ambiente), aplicar amostra de proteína via anódica xícara de carga, utilizando copos de amostras. O volume do copo é de 100 l (cups Manifold permitem até 150 mL). Nota: você pode carregar grandes quantidades de amostra, se você inserir um passo de baixa tensão no início do protocolo de foco e encher os copos enquanto ainda há uma película de líquido no copo! </li><li> Realizar focalização isoelétrica para 11,1 KVH no modo gradiente na Unidade de Eletroforese Multiphor II. </li></ul></li><li> Equilíbrio e SDS-PAGE <ul><li> Depois IEF, as tiras IPG foram submetidos a uma redução e alquilação, cada tempo de 15 minutos em um agitador, usando ditiotreitol 1% e 2,5% respectivamente iodoacetamida em solução de equilíbrio [50 mM Tris-HCl/pH 8.8, 6 M de uréia, glicerol 30% e 2% SDS]. </li><li> Lave as tiras equilibrada com H 2 O e exterminá-los em papel Whatman para remover excesso de tampão de equilíbrio. Depois mergulhar as tiras em SDS-tampão de corrida (1X). </li><li> Segunda dimensão é realizada por SDS-PAGE em um sistemas de eletroforese vertical, com uma concentração de acrilamida total de 12%. As tiras IPG foram equilibradas colocados no topo dos géis de separação e fixados com solução de agarose quente [agarose 0,5% em tampão de corrida contendo azul de bromofenol]. </li><li> Proteínas foram separadas por 2,5 horas, a partir de 80 V por 15 minutos, seguida de 120 V até a frente de corante atinge o fundo da gaveta gel. </li></ul></li></ol> Parte 2: coloração Coomassie coloidal com CBB G-250 1. Soluções de coloração Nota: para a preparação das soluções de coloração, utilize produtos químicos com alta qualidade, tais como grau analítico (pa) e água de alta pureza como você começa a partir Millipore sistemas (água Milli-Q). <table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Solução de Coomassie: </td><td> ad 2000 ml H 2 O </td></tr><tr><td> 0,02% (w / v) </td><td> CBB G-250 </td><td> 0,4 g </td></tr><tr><td> 5% (w / v) </td><td> sulfato de alumínio (14-18)-hidrato </td><td> 100 g </td></tr><tr><td> 10% (v / v) </td><td> etanol (96%) </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> 2% (v / v) </td><td> ácido ortofosfórico (85%) </td><td> 47 ml </td></tr></tbody></table> Nota: para a preparação da solução de coloração, a adição seqüencial dos componentes na seguinte ordem tem de ser mantido: <ol><li> dissolver primeiro sulfato de alumínio em água Milli-Q </li><li> depois adicionar etanol, homogeneizar e mix CBB G-250 para a solução </li><li> recentemente, a solução é totalmente dissolvido, acrescentar ácido fosfórico (a incorporação do ácido para a mídia alcoólicas permite que as moléculas de Coomassie agregar em seu estado coloidal) </li><li> finalmente, encher com água Milli-Q </li></ol> Nota: a solução de coloração final tem uma aparência verde-azulado escuro e está cheio de partículas de natação ao redor: <ul><li> Não filtrado esta solução! </li><li> Se você alterou a ordem de preparação, você teria uma solução mais violeta-azulada que é menos sensível. </li></ul><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Descoloração solução: </td><td> ad 2000 ml H 2 O </td></tr><tr><td> 10% (v / v) </td><td> etanol (96%) </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> 2% (v / v) </td><td> ácido ortofosfórico (85%) </td><td> 47 ml </td></tr></tbody></table> 2. Processo de coloração <ul><li> Após a separação segunda dimensão, remova cuidadosamente os géis das placas de vidro e transferi-los para um prato cheio de coloração água Milli-Q. </li><li> Lave o gel três vezes com água Milli-Q por 10 minutos em um agitador horizontal (lavagem insuficiente causa sensibilidade pobres porque a SDS restante no gel perturba o delimitadora do corante à proteína). </li><li> Agitar a solução Coomassie antes do uso para dispersar as partículas coloidais uniformemente. </li><li> Incubar o gel bem coberto com a solução de Coomassie por agitação em um agitador de 12/02 horas. Esta coloração gera marginais de fundo para que você possa observar o progresso coloração no meio. Nota: após 10 minutos você pode ver manchas primeira proteína que aparece, dentro de 2 horas de incubação de cerca de 80% da coloração a elas nível máximo é concluída. Por quase 100% de coloração, a incubação durante a noite é recomendado. Em alguns casos, quando a quantidade de proteína a ser manchado é enorme ea solução se transforma em um azul brilhante, uma atualização da solução de coloração é necessário. </li><li> Após o procedimento de coloração remover a solução Coomassie e lavar o gel duas vezes com água Milli-Q. Nota: você pode reutilizar a solução de coloração, desde que as partículas são ainda remanescentes, caso contrário, descarte-o (lembre-se que o seu laboratório pode ter regras especiais para a eliminação de resíduos). </li><li> Remover partículas de corante degola do prato com uma coloração que não solte fiapos toalha de papel e destain para 10-60 minutos. Nota: Você também pode lavar o gel apenas com água Milli-Q, mas isso recomendamos apenas para preparativa géis porque não vai durar um irregular, o filme de Coomassie fraco no gel que irão surgir durante o processo de digitalização. </li><li> Finalmente lavar o gel duas vezes com água Milli-Q: o gel chegará a sua espessura original (a mídia álcool-ácido faz o encolhimento géis) e neutralização em água, adicionalmente, aumenta a intensidade de cor Coomassie. </li></ul> Parte 3: Os resultados representativos Se você seguir o protocolo descrito acima, você receberá em seu gel 2-D distintas e bem resolvida manchado manchas escuras proteína azul. Mesmo comparado a um gel 2-D corados com prata de acordo com Shevchenko et al. 5, um protocolo alegando boa sensibilidade e compatibilidade com espectrometria de massa, conseguimos resultados de coloração igual. <img src="/files/ftp_upload/1431/fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: Resultado das experiências descritas acima. Coomassie Kang protocolo (A) realiza fortemente como a coloração pela prata de acordo com Shevchenko et al. (B) na detecção de proteínas após o 2-D eletroforese em gel. Parte 4: Dicas e truques <ul><li> Executar algumas colorações teste antes de processar suas próprias amostras. Por razões inexplicáveis, por vezes, nós informamos que uma proteína de interesse não pode ser detectado com sucesso, mesmo quando miligramas foram aplicados. Neste caso, recomendamos a preparar algumas séries de diluição para teste de sensibilidade. </li><li> Se você tem baixa em gel de detecção da proteína (s) na transferência, em geral mal sucedidas do empilhamento para o gel de separação durante a SDS-PAGE será possivelmente a razão. Você pode verificar essas proteínas adesivas através da coloração do gel completo, incluindo a área de empilhamento. </li><li> Para uma verificação rápida dos seus resultados com foco isoelétrico, você pode diretamente mancha as tiras IPG, sem qualquer separação outra dimensão segundo. </li><li> Ocasionalmente, por sua vez o gel durante o procedimento de coloração para que eles sejam manchadas por igual de ambos os lados (se você manter o gel imóvel, o corante liga-se a apenas um lado do gel). </li><li> Fizemos a experiência de que o armazenamento da solução de coloração em uma garrafa escura aumenta sua vida útil (em garrafas transparentes até 4 meses). </li><li> Após a coloração e documentar você pode manter o gel na geladeira por vários anos (se você adicionar solução ácida a evitar contaminações por fungos). </li><li> Descoloração de plugues gel para uma digestão tríptica pode ser acelerado pelo aquecimento em um aquecedor de bloco. </li></ul>

<ol><li>Fazekas de St Groth, S., Webster, S. R. G., Datyner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+new+staining+procedures+for+quantitative+estimation+of+proteins+on+electrophoretic+strips%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Two new staining procedures for quantitative estimation of proteins on electrophoretic strips.</a> Biochim. Biophys. Acta. 71, 377-391 (1963).</li>
<li>Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels+including+isoelectric+focusing+gels+with+clear+background+at+nanogram+sensitivity+using+Coomassie+Brilliant+Blue+G-250+and+R-250%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250.</a> Electrophoresis. 9, 255-262 (1988).</li>
<li>Candiano, G., Bruschi, M., Musante, L., Santucci, L., Ghiggeri, G. M., Carnemolla, B., Orecchia, P., Zardi, L., Rigetti, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+Silver%3A+A+very+sensitive+colloidal+Coomassie+G-250+staining+for+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Blue Silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis.</a> Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).</li>
<li>Kang, D., Gho, S. G., Suh, M., Kang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Sensitive+and+Fast+Protein+Detection+with+Coomassie+Brilliant+Blue+in+Sodium+Dodecyl+Sulfate-Polyacrylamide+Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Bull.+Korean+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Highly Sensitive and Fast Protein Detection with Coomassie Brilliant Blue in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis.</a> Bull. Korean Chem. Soc. 11, 1511-1512 (2002).</li>
<li>Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+sequencing+of+proteins+silver-stained+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels.</a> Anal. Chem. 68, 850-858 (1996).</li>
</ol>

Inovadora ou apenas outro protocolo Coomassie? No momento existem vários protocolos para a coloração de procedimentos com Coomassie Brilliant Blue. A maioria deles o resultado de modificações maiores ou menores de um dos protocolos mais comumente usados ​​por Neuhoff e colegas 2. Também protocolo Kang é baseado na fórmula de Neuhoff. Mas é realmente um método de coloração Coomassie alternativa para a pesquisa proteômica? Vamos imagem duas questões principais, limite de detecção e ...

<table border="1" ><tr><td> Nome do produto </td><td> Companhia </td><td> No. de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Para IEF e SDS-PAGE: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Immobiline DryStrip géis </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-6001-94 </td><td> Pode até ser usado dois anos após a data expirar. </td></tr><tr><td> Immobiline DryStrip Bandeja Reswelling </td><td> GE Healthcare </td><td> 80-6371-84 </td><td> Não devem ser limpos com solventes orgânicos. Projetado para 7-18 centímetros IPG-tiras. </td></tr><tr><td> Immobiline DryStrip Kit </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1004-30 </td><td> Inclui uma bandeja, porta-eletrodo anodo e catodo de eletrodos, alinhador e bar copo de amostra e copos de amostra. </td></tr><tr><td> EPS 3501 Alimentação XL </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1130-05 </td><td> Fontes de tensão até 3500 V. </td></tr><tr><td> Multiphor Unidade II Eletroforese </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1018-06 </td><td> Eletrodos móveis permitem IEF em tiras IPG de todo o comprimento (7-24 centímetros IPG strips) </td></tr><tr><td> Perfectblue gel sistema Twin S </td><td> Peqlab </td><td> 45-1010-C </td><td> SDS-PAGE em formato 10x10 cm mini-gel. Gel câmara inclui um sistema de refrigeração. </td></tr><tr><td> Para coloidal Coomassie G-250 coloração: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> coloração pratos com tampas </td><td> VWR </td><td> 216-3412 </td><td> Se encaixa para mini-géis. Empilhável em shaker. </td></tr><tr><td> sulfato de alumínio-18-hidrato </td><td> Merck </td><td> 1.01102.5000 </td><td> Fizemos melhor experiência com a Merck. Apenas disponível em 5 pacote kg. </td></tr><tr><td> ácido ortofosfórico </td><td> Prolabo </td><td> 20 624.295 </td><td> Vendidas em garrafas de vidro. </td></tr></table>

rápido e sensível colloidal coomassie g-250 coloração para proteínas em gel de poliacrilamida

Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in Polyacrylamide Gels

Coomassie Brilliant Blue (CBB) é um corante comumente usado para a visualização de proteínas separadas por SDS-PAGE, oferecendo um processo de coloração simples e quantificação de altura. Além disso, é totalmente compatível com identificação de proteínas espectrometria de massa. Mas, apesar dessas vantagens, a CBB é considerado para ser menos sensível do que a prata ou colorações de fluorescência e, portanto, raramente usado para a detecção de proteínas em gel analítica abordagens baseadas em proteômica. Várias melhorias do original Coomassie protocolo 1 foram feitas para aumentar a sensibilidade da CBB. Duas grandes modificações foram introduzidas para aumentar a detecção de proteínas de baixa abundância, convertendo as moléculas de corante em partículas coloidais: Em 1988, Neuhoff e colegas aplicaram 20% de metanol e maiores concentrações de sulfato de amônio no G-250 CBB solução corante com base 2, e em 2004 Candiano et al. estabelecida Prata Azul usando CBB G-250 com ácido fosfórico na presença de sulfato de amônio e metanol 3. No entanto, todas estas modificações apenas permitem uma detecção de aproximadamente 10 ng de proteína. Um protocolo muito obscuro para a coloração Coomassie coloidal foi publicado por Kang et al. Em 2002, onde eles modificaram Neuhoff protocolo de coloração coloidal CBB sobre as substâncias complexantes. Em vez de sulfato de amônio que usaram sulfato de alumínio e metanol foi substituído pelo 4 etanol menos tóxicos. A base de alumínio romance coloração em estudo Kang mostrou sensibilidade superior que detecta tão baixos como 1 ng / banda (fosforilase b) com variação pouca sensibilidade dependendo proteínas. Aqui, nós demonstrar a aplicação do protocolo de Kang para rápido e sensível coloração Coomassie coloidal de proteínas em fins analíticos. Vamos ilustrar o protocolo rápido e fácil usando géis bi-dimensional realizada rotineiramente em nosso grupo de trabalho.

Este vídeo é popularizar uma coloidal Coomassie G-250 protocolo de coloração de acordo com Kang<em&gt; Et al.</em&gt; Para a detecção de proteínas ng média de 4 em géis. A coloração é concluída dentro de duas horas e sem qualquer esforço. Rotineiramente utilizam o protocolo Kang para fins analíticos, de gel com base em proteômica.

Rápido e sensível Colloidal Coomassie G-250 coloração para proteínas em gel de poliacrilamida

O Coomassie Brilliant Blue (CBB) é um corante comumente utilizado para a visualização de proteínas separadas por SDS-PAGE, oferecendo um procedimento de coloração simples e ...

Neste vídeo, demonstraremos o poder de um protocolo modificado de coloração kumasi para detectar várias nanogramas de proteína em géis de poliacrilamida. Usando como exemplo a eletroforese em gel bidimensional antes da separação na primeira dimensão. Tiras com gradiente de pH imobilizado são reidratadas em condições de tampão desnaturante.Após a reumidificação noturna das tiras, as amostras proteicas são aplicadas por meio de carga em copo anódico. Durante o processo de focalização, as proteínas são separadas de acordo com seus pontos isoelétricos. A separação na segunda dimensão é realizada por eletroforese SDS-PAGE.O gel é então transferido para um recipiente de coloração e as proteínas são detectadas por coloração com azul de comassie coloidal. Olá, sou Nadine de Bala do laboratório de Sabina Meka no centro de pesquisa biomédica da Universidade de Olor. Hoje chamarei sua atenção para um procedimento amplamente não famoso segundo colegas de Kangan: o Azul Brilhante de Coomassie é um corante comumente utilizado para a visualização de proteínas após separações eletroforéticas, mas muitas vezes considera-se que é menos aplicável à proteômica comparativa.No entanto, a coloração coloi

fast-sensitive-colloidal-coomassie-g-250-staining-for-proteins

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Após a separação por métodos eletroforéticos, proteínas em um gel pode ser detectado por vários métodos de coloração. Coloração de proteínas com Coomassie Blue, coloração pela prata, Orange SYPRO, Ruby SYPRO são demonstradas neste vídeo.

Coloração Proteínas em Gel

Um protocolo curto para a coloração de proteínas com Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 em gel de poliacrilamida é descrito sem o uso de solventes orgânicos ou em ácido acético como nos procedimentos de coloração clássica com CBB.

Coloração de proteínas em géis com Coomassie G-250 sem ácido acético e Solventes Orgânicos

Neste vídeo, descrevemos a caracterização de complexos multiprotein (PPM) por eletroforese em gel de poliacrilamida nativo azul (BN-PAGE). Em uma primeira dimensão, dialisadas lisados ​​celulares são separados por BN-PAGE para identificar PPM individual. Em uma segunda dimensão SDS-PAGE, PPM de interesse são subdivididos para analisar os seus constituintes por immunoblotting.

Eletroforese em Gel de Poliacrilamida azul Nativo (BN-PAGE) para Análise de Complexos Multiproteicos de Lisados ​​Celular

Neste vídeo, demonstramos um método de coloração de prata de géis de poliacrilamida para a visualização da proteína total usando sondas fluorogênicas.

Coloração fluorescente de prata: uma técnica para visualizar a proteína total em géis de poliacrilamida

Este vídeo demonstra uma técnica de separação desnaturante baseada em poliacrilamida para proteínas. Essa técnica auxilia na identificação preliminar de proteínas com base em seus pesos moleculares.

Eletroforese em gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sódio para análise de proteínas: uma técnica para separar e visualizar proteínas com base no peso molecular

Neste vídeo, demonstramos um método de eletroforese em gel bidimensional que separa proteínas individuais de uma mistura complexa de proteínas obtida de tecidos tumorais de adenoma hipofisário humano não funcional (NFPA). As proteínas são separadas com base em sua carga elétrica na primeira dimensão e posteriormente separadas com base em pesos moleculares na segunda dimensão.

Eletroforese em gel de poliacrilamida bidimensional: uma técnica de separação para análise de proteínas em mistura de proteínas complexas com base na carga e no peso molecular

Aqui, apresentamos uma eletroforese em gel bidimensional (2DE) acoplada com espectrometria de massa (MS) para separar e identificar adenoma de hipófise humana tecido proteome, que apresenta um padrão de 2DE bom e reprodutíveis. Muitas proteínas são observadas em cada ponto de 2DE quando analisando proteome complexo de câncer com o uso de MS de alta sensibilidade.

Eletroforese em Gel bidimensional juntamente com métodos de espectrometria de massa para uma análise do proteoma de tecido humano Adenoma de hipófise

Aqui, nós relatamos uma prata simples e de baixo custo que mancha o protocolo que requer apenas três reagentes e 7 min de processamento e é apropriado para a geração rápida de dados do SSR de alta qualidade em análise genética.

Um rápido prata coloração protocolo permitindo simples e eficiente deteção de SSR marcadores usando um Gel de Polyacrylamide Non-desnaturação

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado descrevendo uma fluorescente nova técnica para detecção de proteínas totais em gel de poliacrilamida de coloração. O protocolo utiliza uma sonda de excitante prata íon-específicos de fluorescência, que detecta Ag+-complexos de proteínas e elimina determinadas limitações de manchas de prata cromogênica tradicionais.

Coloração fluorescente de prata das proteínas em gel de poliacrilamida

Para superar as limitações da mutagênese clássica dirigida ao local, os análogos proline com modificações específicas foram incorporados em várias proteínas fluorescentes. Mostramos como a substituição do hidrogênio por flúor ou do single por dupla ligação em resíduos de prolina ("cirurgia molecular") afeta propriedades proteicas fundamentais, incluindo sua dobra e interação com a luz.

Troca específica de resíduo de Proline por Análogos Proline em Proteínas Fluorescentes: Como a "Cirurgia Molecular" da espinha dorsal afeta o dobrável e a estabilidade

Este protocolo descreve uma técnica para a análise de supercomplexos respiratórios quando apenas pequenas quantidades de amostras estão disponíveis.

Isolamento de mitocôndrias para análise de supercomplexos mitocondriais a partir de pequenas amostras de cultura de tecidos e células 

Aprenda um protocolo modificado de coloração com Coomassie G-250 coloidal para detectar níveis nanograma de proteínas em géis de poliacrilamida. Este método rápido e sensível é ideal para aplicações em proteómica analítica.

Rápido e sensível Colloidal Coomassie G-250 coloração para proteínas em gel de poliacrilamida

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