Rápido e sensível Colloidal Coomassie G-250 coloração para proteínas em gel de poliacrilamida

Neste vídeo, demonstraremos o poder de um protocolo modificado de coloração kumasi para detectar várias nanogramas de proteína em géis de poliacrilamida. Usando como exemplo a eletroforese em gel bidimensional antes da separação na primeira dimensão. Tiras com gradiente de pH imobilizado são reidratadas em condições de tampão desnaturante.

Após a reumidificação noturna das tiras, as amostras proteicas são aplicadas por meio de carga em copo anódico. Durante o processo de focalização, as proteínas são separadas de acordo com seus pontos isoelétricos. A separação na segunda dimensão é realizada por eletroforese SDS-PAGE.

O gel é então transferido para um recipiente de coloração e as proteínas são detectadas por coloração com azul de comassie coloidal. Olá, sou Nadine de Bala do laboratório de Sabina Meka no centro de pesquisa biomédica da Universidade de Olor. Hoje chamarei sua atenção para um procedimento amplamente não famoso segundo colegas de Kangan: o Azul Brilhante de Coomassie é um corante comumente utilizado para a visualização de proteínas após separações eletroforéticas, mas muitas vezes considera-se que é menos aplicável à proteômica comparativa.

No entanto, a coloração coloidal de Coomassie oferece vantagens superiores em relação à sensibilidade, custos e praticidade. Utilizamos o protocolo de coloração com K em nosso laboratório para quase todas as aplicações baseadas em géis, mas especialmente em proteômica analítica, para determinar alterações na expressão de proteínas miocárdicas. Demonstro aqui o uso deste método para detectar proteínas miocárdicas na faixa de pH alcalino de géis de eletroforese bidimensional.

Então vamos começar. Entendido. A primeira dimensão da eletroforese em gel bidimensional é a focalização isoelétrica ou FIE, e fitas com gradiente de pH imobilizado ou fitas IPG são utilizadas para esta análise.

Antes da EIE, quatro tiras IPG são reidratadas individualmente em 125 microlitros de solução de reidratação utilizando a bandeja de hidratação IM Mobilly para tiras secas por pelo menos 10 horas, período após o qual as tiras IPG estarão reidratadas e prontas para a aplicação da amostra proteica. Amostras proteicas precipitadas com TCA provenientes de quatro preparações cardíacas diferentes são dissolvidas em tampão de amostra para EIE até uma concentração de 100 microgramas de proteína por 100 microlitros. A solubilização das amostras proteicas levará pelo menos 30 minutos à temperatura ambiente em vórtex.

Enquanto isso, prepare os componentes adicionais do kit seco IM Molene para realizar a IEF na unidade de eletroforese multi quatro. Primeiro, ajuste a temperatura da unidade de refrigeração para 20 graus Celsius, pipete três a quatro mililitros de fluido de cobertura sobre a placa de refrigeração e posicione a bandeja para fitas secas Immobilien sobre ela, com a conexão vermelha do eletrodo voltada para o ânodo. Despeje cerca de 10 mililitros de óleo de cobertura na bandeja para fitas secas Immobilien e coloque o alinhador de fitas secas Immobilien com o lado do sulco virado para cima sobre a bandeja coberta com óleo.

Em seguida, remova a tira reidratada da bandeja de reumidificação e transfira-a, com o lado do gel voltado para cima, para as ranhuras do alinhador. A extremidade ácida da tira deve ficar voltada para o ânodo. Ao final, todas as tiras devem estar alinhadas com suas bordas anódicas.

Coloque tiras de eletrodos saturadas com água destilada lateralmente nas extremidades das tiras de gel, certificando-se de que as tiras de eletrodo entrem em contato, pelo menos parcialmente, com a superfície do gel. Por fim, posicione os eletrodos sobre as tiras de eletrodo de modo que a marca colorida esteja voltada para o contato eletrônico correspondente. Posicione a barra com copos de amostra próximo ao ânodo na bandeja seca de tiras IPG e coloque um copo de amostra acima de cada tira IPG.

Pressione suavemente as copas de amostra para baixo para garantir um bom contato com a fita IPG. Despeje de 70 a 80 mililitros de óleo de cobertura na bandeja para cobrir as fitas IPG. Nenhum óleo deve vazar para dentro das copas de amostra.

Se o óleo vazar para dentro do copo, remova-o com uma pipeta e ajuste os copos novamente. Por fim, adicione cerca de 150 mililitros de óleo de cobertura para cobrir completamente os copos de amostra. Agora, aplique as amostras de proteína nos copos de amostra pipetando sob a superfície do fluido de cobertura.

O volume do copo é de 100 microlitros. Após todas as amostras de proteína terem sido aplicadas, conecte todos os cabos. Ligue a unidade múltipla de quatro saídas à fonte de alimentação e realize a eletroforese isoelétrica por 11,1 quilovolt-horas no modo gradiente. Após a eletroforese isoelétrica, as tiras IPG são colocadas em uma bandeja com o lado do gel voltado para cima e submetidas à redução e alquilação durante a etapa de equilíbrio.

Para a redução, utilize 2,5 mililitros da solução de equilibração 1% DI três et all por tira. Em seguida, agite por 15 minutos e então substitua completamente a solução de DTT e alquile as tiras na solução de equilibração com 2,5% de iodoacetamida, agitando por mais 15 minutos. Enxágue as tiras equilibradas uma vez em um béquer contendo água e seque-as em papel de filtro para remover o excesso de tampão de equilibração.

Em seguida, transfira as tiras para um tampão de corrida XSDS. As proteínas nas tiras estão agora prontas para a segunda dimensão da eletroforese em gel 2D. A segunda dimensão é realizada por SDS-PAGE em um sistema de eletroforese vertical.

Um número apropriado de géis de acrilamida a 12%, com espessura de um milímetro, é confeccionado um dia antes do uso e mantido coberto com papel úmido. Em temperatura ambiente, as tiras IPG equilibradas são colocadas sobre a parte superior dos géis de separação e fixadas com solução de agarose quente; as proteínas são então separadas por 2,5 horas, iniciando-se em 80 volts durante 15 minutos, seguido de 120 volts até que a frente do corante alcance a base da cassete do gel.

Enquanto as proteínas estão sendo separadas por eletroforese em gel de SDS, prepare as soluções para a coloração coloidal com kumasi no gel. Ao preparar a solução de coloração, é muito importante manter a adição sequencial dos componentes na seguinte ordem. Primeiro, dissolva 100 gramas de sulfato de alumínio e aproximadamente 1,5 litro de água millicubo em um béquer e agite. Após a dissolução do sulfato de alumínio, misture 200 mililitros de etanol e adicione 0,4 gramas de CBG 250 à solução.

Assim que o CBB G dois 50 estiver completamente dissolvido, adicione 47 mililitros de ácido ortofosfórico. Esta etapa permite que as moléculas de kamasi se agreguem em seu estado coloidal. Por fim, adicione água milli Q até um volume final de dois litros.

A solução final em repouso terá partículas nadando ao redor. Não filtre esta solução. A solução de coloração também pode ser preparada com antecedência e armazenada no escuro até o uso.

Quando a eletroforese em gel de SDS for concluída, retire cuidadosamente o gel das placas de vidro e transfira-o para um recipiente contendo água Milli Q. Coloque o recipiente com o gel em um agitador horizontal e agite por 10 minutos.

Repita a lavagem mais duas vezes por cerca de cinco a 10 minutos. Com água fresca de milicubo, é importante lavar bem o gel, pois o SDS remanescente no gel pode interferir na ligação do corante à proteína e causar baixa sensibilidade. Ao final da terceira lavagem, despeje a água do recipiente.

Agora o gel está pronto para ser corado. Primeiro, agite a solução Kumasi para dispersar uniformemente as partículas coloidais. Em seguida, adicione quantidade suficiente da solução para cobrir o gel.

Coloque a placa com a solução Kumasi tampada. Deixe o gel em agitação por duas a doze horas. Após 10 minutos, você verá os primeiros pontos proteicos surgindo.

De 80 a cem por cento da coloração pode ser obtido em até duas horas de incubação. No entanto, recomendamos uma incubação durante a noite para atingir uma coloração próxima a 100%. Quando a coloração estiver completa, remova a solução de Kamasi e lave o gel duas vezes com água Milli Q.

Após lavar o gel, remova as partículas de corante aderidas ao recipiente de coloração com um papel toalha sem fiapos. Adicione a solução de descoloração ao gel e mantenha por 10 a 60 minutos em agitação. Por fim, lave o gel duas vezes com água Milli Q.

O gel recuperará sua espessura original e a intensidade da cor da coloração com kumasi também será realçada. Se você seguir este protocolo, seu gel 2D deverá apresentar resolução distinta e coloração adequada, com manchas proteicas azul-escuras. O resultado de nossa coloração com kumasi em géis 2D é comparável ao da coloração com prata.

De acordo com o protocolo de Chef Chenko et al., que é relatado como de alta sensibilidade e compatibilidade com espectrometria de massa. Usando o exemplo da eletroforese em gel bidimensional, acabamos de mostrar como o sustentamento de kangs cooma é rápido, simples e sensível. Para detectar proteínas em géis de acrilamida po, o sustentamento pode ser concluído em até duas horas.

O próprio procedimento exige pouco trabalho. E, por último, mas não menos importante, talvez você consiga detectar tão pouco quanto um nanograma de proteína. Portanto, este protocolo é definitivamente uma boa alternativa aos métodos não marcadores de proteômica baseada em gel.

Ao utilizar o procedimento de manutenção, é importante lembrar de usar produtos químicos de grau analítico e água de máxima pureza. Além disso, a adição sequencial dos componentes à solução de coloração é uma etapa crítica na preparação. Por fim, não se esqueça de lavar eficientemente os resíduos de SDES dos géis após a separação eletroforética.

Caso contrário, você não verá nada nos seus géis. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.