Rápido e sensível Colloidal Coomassie G-250 coloração para proteínas em gel de poliacrilamida

Neste vídeo, demonstraremos o poder de um protocolo de coloração kumasi modificado para detectar vários nanogramas de proteína em géis de poliacrilamida. Usando o exemplo de eletroforese em gel bidimensional antes da separação da primeira dimensão. As tiras de gradiente de pH imobilizadas são reidratadas em condições tampão desnaturantes.

Após o inchaço noturno das tiras, as amostras de proteína são aplicadas por meio do carregamento do copo anódico. Durante o processo de focalização, as proteínas são separadas de acordo com seus pontos isoelétricos. A separação da segunda dimensão é realizada pela página SDS.

O gel é então transferido para uma placa de coloração e as proteínas são detectadas por coloração com kumasi coloidal. Olá, sou Nadine de Bala, do laboratório de Sabina Meka no centro de pesquisa médica biológica da Universidade de Olor. Hoje vou chamar sua atenção para um procedimento amplamente não famoso de acordo com colegas de Kangan, Cy Brilliant Blue é um dique comumente usado para a visualização de proteínas após separações eletroforéticas, mas muitas vezes é considerado menos aplicável para proteômica comparativa.

No entanto, a coloração coloidal de cos oferece características superiores em relação à sensibilidade, custos e praticidade. Usamos o protocolo de coloração K em nosso laboratório para aplicação quase média baseada em gel, mas especialmente em proteômica analítica para determinar as alterações na expressão de proteínas miocárdicas. Demonstrarei o uso deste método para detectar proteínas miocárdicas na faixa de pH alcalino de géis de eletroforese bidimensionais.

Então vamos começar. Peguei. A primeira dimensão da eletroforese em gel 2D é a focalização isoelétrica ou IEF e tiras de gradiente de pH imobilizado ou tiras IPG são usadas para esta análise.

Antes do IEF, quatro tiras de IPG são reidratadas individualmente em 125 microlitros de solução de reidratação usando a bandeja de inchamento de tiras secas IM Mobilly por pelo menos 10 horas quando as tiras de IPG são reidratadas e prontas para aplicação de amostra de proteína. As amostras de proteínas precipitadas com TCA de quatro preparações cardíacas diferentes são dissolvidas no tampão de amostra IEF até uma concentração de 100 microgramas de proteína por 100 microlitros. A solubilização das amostras de proteína levará pelo menos 30 minutos à temperatura ambiente em um vórtice.

Enquanto isso, prepare os componentes adicionais do kit de tiras secas IM Molene para realizar o IEF na unidade de eletroforese múltipla de quatro metros. Primeiro defina a temperatura da unidade de resfriamento para 20 graus Celsius, pipete de três a quatro mililitros de fluido de cobertura na placa de resfriamento e posicione a bandeja de tiras secas Immobilien nela com a conexão do eletrodo vermelho voltada para o ânodo. Despeje cerca de 10 mililitros de óleo de cobertura na bandeja de tiras secas Immobilien e coloque o alinhador de tiras secas Immobilien com o lado da ranhura para cima na bandeja coberta de óleo.

Em seguida, remova a tira reidratada da bandeja de inchaço e transfira-a com o lado do gel até as ranhuras do alinhador. A extremidade ácida da tira deve estar voltada para o ânodo. No final, todas as tiras devem estar alinhadas com suas bordas anódicas.

Coloque as tiras de eletrodos saturadas de água destilada lateralmente nas extremidades das tiras de gel, certificando-se de que as tiras de eletrodo entrem em contato pelo menos parcialmente com a superfície do gel. Por fim, posicione os eletrodos nas tiras de eletrodos de forma que a marca colorida seja direcionada para o contato eletrônico correspondente. Posicione a barra do copo de amostra perto do ânodo na bandeja de tiras secas immobilien e coloque um copo de amostra acima de cada tira IPG.

Pressione suavemente os copos de amostra para baixo para garantir um bom contato com a tira IPG. Despeje 70 a 80 mililitros de óleo de cobertura na bandeja para cobrir as tiras de IPG. Nenhum óleo deve vazar para os copos de amostra.

Se o óleo vazar para o copo, remova-o com uma pipeta e ajuste os copos novamente. Por fim, adicione cerca de 150 mililitros de óleo de cobertura para cobrir completamente os copos de amostra. Agora aplique as amostras de proteína nos copos de amostra pipetando sob a superfície do fluido de cobertura.

O volume do copo é de 100 microlitros. Depois que todas as amostras de proteína forem aplicadas, conecte todos os cabos. Conecte a unidade multi quatro à fonte de alimentação e execute a focagem isoelétrica por 11,1 quilovolts-hora no modo gradiente, seguindo o IEF, as tiras IPG são colocadas em uma bandeja com o lado do gel voltado para cima e submetidas a redução e alquilação durante o equilíbrio.

Para redução, use 2,5 mililitros de solução de equilíbrio de 1% DI três e todos por tira. Em seguida, agite por 15 minutos e, em seguida, substitua completamente a solução de TDT e alquile as tiras em solução de equilíbrio de acetamida a 2,5% com agitação por mais 15 minutos. Enxágue as tiras de equilíbrio uma vez em um béquer cheio de água e seque-as em papel de filtro para remover o excesso de tampão de equilíbrio.

Em seguida, transfira as tiras em um buffer de execução XSDS. As proteínas nas tiras estão agora prontas para a segunda dimensão da eletroforese em gel 2D. A segunda dimensão é realizada por página SDS em um sistema de eletroforese vertical.

Um número apropriado de um milímetro de espessura. Os géis de acrilamida a 12% são fundidos um dia antes do uso e mantidos cobertos com papel úmido. À temperatura ambiente, as tiras de IPG equilibradas são colocadas na parte superior dos géis separadores e fixadas com solução de agro quente por proteínas são separadas por 2,5 horas, começando em 80 volts por 15 minutos, seguidas de 120 volts até que a frente do corante atinja o fundo do de gel.

Enquanto as proteínas estão sendo separadas por página SDS, prepare as soluções para a coloração coloidal de kumasi no gel. Ao fazer a solução de coloração, é muito importante manter a adição sequencial dos componentes na seguinte ordem. Primeiro, dissolva 100 gramas de sulfato de alumínio e aproximadamente 1,5 litros de água em um copo e mexa Depois que o sulfato de alumínio for dissolvido, misture 200 mililitros de etanol e adicione 0,4 gramas de CBG dois 50 à solução.

Assim que o CBB G dois 50 estiver completamente dissolvido, adicione 47 mililitros de ácido ortofosfórico. Esta etapa permite que as moléculas de kamasi se agreguem em seu estado coloidal. Por fim, adicione água mili Q a um volume final de dois litros.

A solução final em pé terá partículas nadando ao redor. Não filtre esta solução. A solução de coloração também pode ser preparada com antecedência e armazenada no escuro até o uso.

Quando o gel SDS estiver concluído. Remova cuidadosamente o gel das placas de vidro e transfira-o para uma mancha cheia de água Milli Q. Coloque o prato com o gel em uma coqueteleira horizontal e agite por 10 minutos.

Repita a lavagem mais duas vezes por cerca de cinco a 10 minutos. Com água fresca de mili cubos, é importante lavar bem o gel, pois o SDS restante no gel pode interromper a ligação do corante à proteína e causar baixa sensibilidade. No final da terceira lavagem, despeje a água do prato.

O gel agora está pronto para ser corado. Primeiro, agite a solução de Kumasi para dispersar as partículas coloidais uniformemente. Em seguida, adicione solução suficiente para cobrir o gel.

Coloque o prato com a solução de Kumasi coberta. Gel em uma coqueteleira e agite por duas a 12 horas. Após 10 minutos, você verá as primeiras manchas de proteína aparecendo.

80 a cem por cento da coloração pode ser realizada dentro de duas horas após a incubação. Mas recomendamos uma incubação noturna para atingir cerca de 100% de coloração. Quando a coloração estiver completa, remova a solução Kamasi e enxágue o gel duas vezes com água Milli Q.

Depois de enxaguar o gel, remova as partículas de corante grudadas do prato de coloração com uma toalha de papel sem fiapos. Adicione a solução de coloração ao gel e detenha por 10 a 60 minutos no shaker. Por fim, enxágue o gel duas vezes com água Milli Q.

O gel retomará sua espessura original e a intensidade da cor da coloração kumasi também será aprimorada. Se você seguir este protocolo, seu gel 2D deve ser claramente resolvido e bem corado com manchas de proteína azul escura. O resultado de nossa coloração kumasi de géis 2D é comparável ao da coloração de prata.

De acordo com o protocolo do Chef Chenko et al, que é relatado como de alta sensibilidade e compatibilidade com espectrometria de massa. Usando o exemplo da eletroforese em gel bidimensional, acabamos de mostrar como a sustentação de kangs cooma é rápida, simples e sensível. Para detectar proteínas em géis de po acrilamida, a sustentação pode ser concluída em duas horas.

O procedimento em si requer pouco trabalho. E por último, mas não menos importante, você pode detectar apenas um nanograma de proteína. Portanto, este protocolo é definitivamente uma boa alternativa aos métodos de não rotulagem da proteômica baseada em prisão.

Quando você usa o procedimento de sustentação, é importante lembrar de usar produtos químicos analíticos de graduação e água da mais alta pureza. Além disso, a adição sequencial dos componentes à solução de coloração é uma etapa crítica na preparação. Finalmente, não se esqueça de lavar com eficiência o SDES residual dos géis após a separação eletroforética.

Caso contrário, você não verá nada em seus géis. Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.