Name: Combinando QD-FRET e microfluídica para monitorar Nanocomplex DNA Automontagem-in Real-Time (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-26T16:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 36 s
Description: Aprenda a monitorar a automontagem de nanocomplexos de DNA em tempo real usando QD-FRET e microfluídica. Este método integra pontos quânticos e canais microfluídicos para estudar poliplexos de polieletrólitos com aplicações promissoras em terapia gênica.

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Apoio financeiro fornecido pelo NIH conceder HL89764, NSF concede 0546012, 0730503 e 0725528.

A. Biotinilação de DNA DNA plasmidial foram covalentemente biotinilado guanina com etiquetas específicas biotina, conforme descrito pelo fabricante (Mirus Bio, Madison, WI), mas dimensionada para ter ~ 1-2 rótulos biotina por DNA. DNA plasmídeo (pEGFP-C1, 4,9 kb, Clontech, Mountain View, CA) foi rotulada neste protocolo. <ol><li> Dissolver quantidade desejada de PDNA em tampão TE de DNase e livre de RNase-free (qualidade de biologia molecular-grade) de água para fazer uma solução de DNA 1μg/μL. </li><li> Realizar a reação rotulagem usando as misturas de reacção seguinte. Adicione o rótulo de TI último reagente. </li></ol> DNA para a reação 100μg: <table border="1"><tbody><tr><td> DNase-RNase livre e sem água </td><td> 75 mL </td></tr><tr><td> Tampão 10X Labeling A </td><td> 20 mL </td></tr><tr><td> 1μg/μL DNA </td><td> 100 L </td></tr><tr><td> Rotulá-la de reagente </td><td> 5 mL </td></tr><tr><td> Volume Total </td><td> 200 mL </td></tr></tbody></table><ol start="3"><li> Incubar a reação a 37 ° C por 1 hora. </li><li> Purificar a amostra rotulada por etanol ou isopropanol precipitação seguintes protocolos padrão. </li></ol> Nota: as colunas de filtração em gel com base pode levar a absorbância UV alto ou o fundo de fluorescência, que pode afetar a quantificação de DNA ou a caracterização de fluorescência. Nota: O nível de Biotinilação pode ser determinada por Haba baseado em testes. B. Rotulagem da Polymer Cy5-Catiônicos Quitosana (390 kDa, 83,5% desacetilado, Vanson, Redmond, WA) foi usado como um polímero catiônico modelo neste estudo. As aminas primária gratuita na espinha dorsal do polímero quitosana foram marcados com Cy5-NHS (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). <ol><li> Para facilitar a conjugação completa dos Cy5 corante, calcular a quantidade necessária de Cy5-NHS tal que a relação molar de Cy5: aminas primárias é de 1: 200. </li><li> Ajustar o pH da solução de quitosana (em tampão acetato 25mM) para ~ 6,5 pela adição de NaOH. Note-se que a reação do SNS é mais eficiente em pH básico, mas a solubilidade da quitosana aqui limita a faixa de pH de trabalho. </li><li> Agitando, lentamente adicione o montante calculado de Cy5-NHS (1 mg / ml DMSO) para a solução de quitosana de forma gota a gota. </li><li> Agitar a mistura no escuro à temperatura ambiente durante a noite. </li><li> Para purificar, diálise com 10k MWCO Slide-a-Lyzer (Pierce) por 2 horas contra tampão acetato de 1% à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Substituir buffer e diálise outra hr 2 à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Substituir buffer e diálise overnight a 4 ° C no escuro. </li><li> Loja purificada rotulados de polímero a -20 ° C. </li></ol> Nota: Neste estudo, uma curva padrão é construída através da medição da intensidade de emissão de Cy5 NHS-éster a 670 nm. Caracterizar a densidade de rotulagem, pela medição da emissão obtidos a 670 nm de Cy5 marcado com quitosana na curva padrão. Absorbância também pode ser usado para determinar a eficiência de marcação, mas não foi realizado aqui. C. Preparação do QD-rotulados de DNA e Cy5-Polymer A razão molar de PDNA para QD foi mantido em excesso (PDNA: QD ≈ 1, 2) para garantir a conjugação completa dos QDs para PDNA. O número de QDs rotulados em cada PDNA pode ser estimado através TEM imagens ou outros recursos equivalentes. Em nosso estudo, o número de QDs por PDNA é estimado em ~ 1-3 por TEM e espectroscopia única molécula. Use um Millipore Milli-Q de água gradiente (&gt; 18,0 MW, 0.2um filtrada) durante a preparação. <ol><li> Calcular a quantidade necessária de quitosana para 10μg PDNA desejado de acordo com relação N / P, a relação teórica de aminas protonadas na solução de quitosana para os fosfatos negativa na solução de DNA. </li><li> Adicionar estreptavidina-funcionalizados 605QDs (Qdot 605 ITK, Invitrogen, Carlsbad, CA) para a solução PDNA biotinilado. </li><li> Incubar a solução à temperatura ambiente no escuro por 15 min. </li><li> Adicione o DNA-QD rotulados em 50 solução de sulfato de sódio mM para fazer a 200μL volume final. </li><li> Diluir Cy5-quitosana, de acordo com a desejada relação N / P, com água Milli-Q para fazer a 200μL volume final. </li></ol> Nota: Mantenha a reação no escuro para evitar fotobranqueamento possível. Importante: Tenha cuidado ao usar o Qdot 605 ITK ™ estreptavidina conjugada (a série ITK), como pontos quânticos neste catálogo são projetados com a finalidade de FRET. A série Qdot regulares são conjugados com uma camada de PEG para evitar ligações não específicas, especialmente para a rotulagem celular. No entanto, essa camada adicional aumenta a distância doador receptor, resultando em reduced eficiência da transferência de energia. D. Fabricação do SU-8 Mestres usando fotolitografia padrão <ol><li> Wafer Si é piranha limpo e cozido a 200 ° C por 5 min. </li><li> Para a espessura de 25μm mestre designado, casaco girar o fotorresiste negativo (SU-8 2025, Microchem, Newton, MA), em Si wafer a 2000 rpm por 30 seg. </li><li> Bake suave a bolacha numa placa de aquecimento com uma rampa de 65 ° C / hr a 95 ° C. </li><li> Exponha à luz UV (365 nm) para 250mJ/cm 2 a máscara de um filme (CAD / Art Services, Bandon, OR), contendo o projeto de microcanais. </li><li> Pós-exposição cozer a bolacha numa placa de aquecimento com uma rampa de 65 ° C / hr a 95 ° C. </li><li> Desenvolver o wafer usando SU-8 desenvolvedor fotorresiste. </li><li> O wafer é difícil cozido estampados numa placa de aquecimento com uma rampa de 65 ° C / h até 200 ° C. Manter o wafer de 200 ° C por pelo menos 5 horas, então, gradualmente, esfriar a bolacha até à temperatura ambiente. </li></ol> Importante: rampa gradual durante o SU-8 processo de cozimento mestre é necessário, caso contrário, o SU-8 estrutura pode destacada do wafer de silício ou fissuras na estrutura do SU-8 pode ser induzida pelo estresse de liberação. E. Moldagem Réplica de PDMS com os mestres e União para a tampa de vidro <ol><li> O mestre SU-8 é colocado em um barco de pesagem. </li><li> Mix de silicone elastômero e agente de cura (Poli (dimetilsiloxano), PDMS, Sylgard 184, Dow Corning, Midland, MI), em um 10: 1 ratio. </li><li> Despeje a mistura sobre o PDMS mestre SU-8 e deixar o barco pesa num exsicador de vácuo para remover as bolhas. </li><li> Curar o PDMS a 65 ° C por 1-2 horas. </li><li> Descasque a tira PDMS do molde mestre Si. </li><li> Entradas e saídas de soco canal do dispositivo fluídico. </li><li> Limpe a tira de PDMS e tampa de vidro com etanol e, em seguida, secar ao ar. </li><li> Tratar a limpo PDMS tiras e tampa de vidro com plasma de oxigênio (20W por 1min). </li><li> Imediatamente tira o vínculo PDMS com tampa de vidro. </li><li> Deixe o chip colado microfluídicos no forno a 95 ° C para pernoite. </li></ol> Importante: O tratamento do plasma e assar durante a noite são essenciais para a força de ligação reforçada. F. Monitorar a formação de DNA Nanocomplexes No dispositivo micro <ol><li> Preencha o canal microfluídicos com água (para garantir que não haja bolhas dentro do canal microfluídicos), antes de carregar os reagentes para garantir fluidez durante o experimento. </li><li> Carregar o DNA QD-rotulados e Cy5 marcado quitosana soluções em duas seringas de vidro individuais, através da tubulação descrito no vídeo. </li><li> Conecte o tubo com as duas entradas de dispositivos microfluídicos. Ser cautelosos para não introduzir qualquer ar durante o processo. Definir a taxa de fluxo em 20nL/min (PHD-2000 bomba de seringa, Holliston, MA), sob condições de fluxo laminar. </li><li> Verifique os microcanais sob o microscópio. </li><li> Quando o fluxo é estável (~ 15 a 20 minutos), QD-mediada FRET devem ser observadas no centro do canal. </li><li> Tirar fotos de fluorescência (CCD refrigerado, Qimaging, BC, Canadá) em diferentes locais ao longo do canal. </li><li> Analisar as imagens de fluorescência com ImageJ e OriginLab. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1432/1432fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. QD-FRET fornece uma indicação sensível do início da Nanocomplexes DNA auto-montagem <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Quantum dot-mediada transferência de energia de ressonância de fluorescência (QD-FRET) pode fornecer uma indicação quantitativa e altamente sensível de estabilidade Polyplex em qualquer ambientes extra-ou intra-celular, permitindo a detecção inequívoca do início das interações entre o DNA eo portador do gene. O par FRET, 605QD e Cy5, foi escolhido com base na maximização sobreposição espectral entre o doador eo receptor e minimizar o potencial cross-talk. Para este par, a distância é 69.4Å Förster. 3 </li><li> Auto-montagem do nanocomplexes QD-FRET DNA. DNA plasmídeo aniônicos (PDNA) ea transportadora gene catiônicos foram marcadas com QD (doador de energia) e Cy5 (energia aceitante), respectivamente. QD-FRET nanocomplexes foram formados através de coacervação complexa eletrostática. Após a excitação a 488 nm, QD-FRET mediada emissão Cy5 indicado formação de um nanocomplex compacto e intacta. O tempo de permanência (t R) pode ser calculado de acordo com a distância (x) que mede a partir de onde as duas correntes se encontram para a posição de reação sob investigação, ea velocidade média do fluxo (v). Devido à natureza do fluxo laminar, mistura só ocorre na interface (centro de cada imagem), permitindo o cálculo preciso de transporte de massa em função de t R. A resolução temporal pode ser ajustada pela variação da applietaxas de fluxo d. (Inset) FRET mediada por sinal foi observada imediatamente na interface, quando as duas correntes atendidas, indicando que a ligação foi rápida, ocorrendo dentro de alguns milissegundos de acordo com as taxas de fluxo aplicadas. Bar escala: 100μm. </li></ol>

<ol><li>Ho, Y. P., Chen, H. H., Leong, K. W., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+intracellular+stability+and+unpacking+of+DNA+nanocomplexes+by+quantum+dots-FRET%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Evaluating the intracellular stability and unpacking of DNA nanocomplexes by quantum dots-FRET.</a> J Control Release. 116, 83-89 (2006).</li>
<li>Chen, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+comparison+of+intracellular+unpacking+kinetics+of+polyplexes+by+a+model+constructed+from+quantum+dot-FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Quantitative comparison of intracellular unpacking kinetics of polyplexes by a model constructed from quantum dot-FRET.</a> Mol. Ther. 16, 324-332 (2008).</li>
<li>Zhang, C. Y., Yeh, H. C., Kuroki, M., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Quantum-Dot-Based+DNA+Nanosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mat%22%5BJournal%5D)">Single-Quantum-Dot-Based DNA Nanosensor.</a> Nat Mat. 4, 826-831 (2005).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a declarar.

<ul><li> Importância do nosso trabalho: <ol><li> Esta é a primeira tentativa de monitorar poliméricos DNA nanocomplex auto-montagem cinética em tempo real (milissegundo resolução) através QD-FRET respostas dentro de um chip simples microfluídicos. </li><li> QD-mediada FRET fornece uma indicação altamente sensível e quantitativa do aparecimento de interações moleculares e em todo o processo de auto-montagem, enquanto que a microfluídica oferece um microambiente bem controlados para espacialmente analisar o processo durante a síntese nanocomplex DNA. </li><li> A integração de microfluídica e nanofotônica sugere uma abordagem nova e interessante investigar qualquer tipo de reações de complexação. </li><li> O resultado QD-FRET nanocomplexes DNA poliméricos podem ser facilmente aplicadas para o estabelecimento de relações estrutura-função 1,2. </li></ol></li></ul>

<table><tbody><tr><td>SU-8</td><td>MicroChem Corp.</td><td>SU-8 2025</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Plasmídeo de DNA</td><td>Clontech Laboratories</td><td>pEGFP-C1</td><td>4,9 kb, MM = 3,3 x 10&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Label&lt;/em&gt;IT Biotin Labeling Kit</td><td>Mirus Bio LLC</td><td>MIR 3400</td><td>O protocolo padrão fornece eficiência de marcação de aproximadamente um marcador a cada 20-60 pb de DNA de dupla fita; a densidade de marcação foi ajustada neste trabalho.</td></tr><tr><td>Streptavidina 605QD</td><td>Invitrogen</td><td>Qdot&amp;#174; 605 ITK&amp;#174; Streptavidin Conjugate</td><td></td></tr><tr><td>Éster de Cy5-NHS</td><td>Amersham</td><td>PA15101</td><td></td></tr><tr><td>Quitosana</td><td>Vanson</td><td>390 kDa</td><td>83,5% desacetilada</td></tr><tr><td>Lâmina de Vidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545C</td><td>No. 1; Tamanho: 40 x 22 mm</td></tr><tr><td>Seringa de Vidro Estanque</td><td>Hamilton Co</td><td>Série TLL</td><td>50&amp;#x03BC;L a 500&amp;#x03BC;L, dependendo do volume da amostra</td></tr><tr><td>Tubo Tygon</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>0,02 ID, 100 pés</td><td>Tubos Microbore Tygon, 0,02 ID, 100 pés</td></tr><tr><td>Conector</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>HTX-23R</td><td>Personalizado com comprimento de 0,750&quot;</td></tr><tr><td>Bomba de Seringa</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PHD-2000</td><td></td></tr><tr><td>CCD</td><td>QImaging</td><td>Intensified Retiga Cooled</td><td></td></tr><tr><td>Microsscópio</td><td>Olympus Corporation</td><td>BX-51</td><td>Lâmpada de arco de mercúrio de 100 W</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td>v1.36b</td><td>http://rsb.info.nih.gov/ij</td></tr><tr><td>Origin Pro8</td><td>OriginLab</td><td>Versão Estudantil</td><td></td></tr><tr><td>Conjuntos de Filtros para Microscópio</td><td>Omega Optical</td><td>475AF40</td><td>Filtro de excitação em ambos os canais</td></tr><tr><td>Conjuntos de Filtros para Microscópio</td><td>Omega Optical</td><td>595AF60</td><td>Filtro de emissão no canal 605QD</td></tr><tr><td>Conjuntos de Filtros para Microscópio</td><td>Omega Optical</td><td>670DF40</td><td>Filtro de emissão no canal QD-FRET</td></tr><tr><td>Conjuntos de Filtros para Microscópio</td><td>Omega Optical</td><td>500 DRLP</td><td>Dicroico passa-alta no canal 605QD</td></tr><tr><td>Conjuntos de Filtros para Microscópio</td><td>Omega Optical</td><td>595DRLP</td><td>Dicroico passa-alta no canal QD-FRET</td></tr></tbody></table>

combinando qd-fret e microfluídica para monitorar nanocomplex dna automontagem-in real-time

Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

Avanços na genômica continuar a alimentar o desenvolvimento de terapêuticas que possam alvo patogenia a nível celular e molecular. Tipicamente funcional dentro da célula, baseados em ácido nucléico terapêuticas requerem um sistema de entrega eficiente intracelular. Uma abordagem amplamente adotado é o de DNA complexo com um portador do gene para formar nanocomplexes via eletrostática auto-montagem, facilitando a captação celular de DNA, protegendo-o contra a degradação. O desafio consiste no desenho racional de portadores do gene eficiente, uma vez que a dissociação prematura ou excessivamente ligação estável seria prejudicial para a absorção celular e eficácia terapêutica. Nanocomplexes sintetizados através da mistura de massa mostrou uma grande diversidade de comportamento intracelular desembalar e tráfico, o que foi atribuído à heterogeneidade no tamanho e na estabilidade do nanocomplexes. Essa heterogeneidade dificulta a avaliação exata da cinética de auto-montagem e contribui para a dificuldade em correlacionar suas propriedades físico para a eficiência de transfecção ou bioativos. Nós apresentamos uma convergência romance de nanofotônica (ie QD-FRET) e microfluídica para caracterizar a cinética em tempo real do nanocomplex auto-montagem sob fluxo laminar. QD-FRET fornece uma indicação altamente sensível do início de interações moleculares e medida quantitativa em todo o processo de síntese, enquanto a microfluídica oferece um microambiente bem controlados para espacialmente analisar o processo com alta resolução temporal (~ milissegundos). Para o sistema modelo de nanocomplexes poliméricos, duas etapas distintas no processo de auto-montagem foram capturados por esta plataforma analítica. O aspecto cinética do processo de auto-montagem obtidos em microescala seria particularmente valiosos para microreactor baseado reações que são relevantes para muitas aplicações de micro e nano-escala. Além disso, nanocomplexes pode ser personalizada através de um design adequado dos dispositivos microfludic, ea conseqüente QD-FRET nanocomplexes DNA poliméricos podem ser facilmente aplicadas para o estabelecimento de relações estrutura-função.

Nós apresentamos uma integração inovadora e poderosa de nanofotônica (QD-FRET) e microfluídica para investigar a formação de polyplexes polieletrólito, que é esperado para prestar um melhor controle e síntese de polyplexes uniforme e personalizável para à base de ácido nucléico futuro terapêutica.

Combinando QD-FRET e microfluídica para monitorar Nanocomplex DNA Automontagem-in Real-Time

Os avanços na genômica continuam a impulsionar o desenvolvimento de terapias capazes de alvejar a patogênese nos níveis celular e molecular. Tipicamente...

Este procedimento inicia-se com a marcação do DNA e do polímero para gerar um plasma de DNA com peras de pontos quânticos ou QD fret, no qual o DNA é conjugado com pontos quânticos, o doador de energia, e o polímero iônico é marcado com um corante orgânico flora quatro sci cinco, o aceitador de energia.Após a mistura de QD fret, complexos nano são formados por autoagregação eletrostática e o sinal de fret mediado por QD pode então ser acompanhado conforme a interação ocorre. Esse sistema de QD fret é introduzido em um canal microfluídico onde os componentes interagirão apenas por difusão na interface de mistura. A autoagregação do complexo nano de DNA pode então ser monitorada pela combinação de QD fret e microfluídica.Olá, sou Megan Ho do laboratório de Bios e dinâmica de moléculas únicas do Departamento de Engenharia Mecânica da Universidade Johns Hopkins. Hoje vamos mostrar um procedimento para combinar trilhas quânticas e microfluídica a fim de monitorar a automontagem de estruturas de DNA em tempo real. Em nosso laboratório, utilizamos este procedimento para estudar complexos de DNNL com vistas à terapia gênica.Então vamos começar. Um kit de marcação com biotina da MIRIs bio é usado para marcar covalentemente o DNA plasmático com rótulos de biotina específicos para guanina, mas em escala para ter aproximadamente um a dois rótulos de biotina por DNA. Para iniciar, dissolva a quantidade desejada de DNA plasmático em tampão TE para obter uma solução de DNA de um micrograma por microlitro.Prepare a reação de marcação misturando o DNA plasmidial livre de DNA e RNA livre de água, tampão de marcação 10x A e o reagente de marcação. O reagente de marcação é adicionado por último. Incube a reação a 37 graus Celsius por uma hora.Após a incubação de uma hora, purifique a amostra marcada por precipitação com etanol, seguindo protocolos padrão. Armazene o DNA marcado a menos 20 graus Celsius até o uso.O próximo passo é rotular o polímero ônico. Nesta demonstração, usaremos quitosana como um modelo de polímero ônico e rotularemos as aminas primárias livres na cadeia principal do polímero de quitosana com sci-fi NHS. Primeiro, calcule a quantidade necessária de sci-fi NHS de modo que a razão molar de sci-fi para aminas primárias seja de 1 para 200. Isso facilitará a conjugação completa do corante sci-fi.Adicione hidróxido de sódio à solução de quitosana em tampão acetato 25 milimolar para ajustar seu pH a aproximadamente 6,5, sob agitação lenta. Adicione a quantidade calculada de sci-fi NHS à solução de quitosana gota a gota. Cubra o frasco com papel alumínio para manter a mistura no escuro e agite à temperatura ambiente durante a noite. No dia seguinte, purifique a mistura por diálise utilizando uma membrana de 10 K-M-W-C-O da pierce contra tampão acetato 1%, realizada por duas horas à temperatura ambiente no escuro.Após duas horas, substitua o tampão acetato 1% e realize a diálise por mais duas horas. À temperatura ambiente e no escuro, substitua novamente o tampão e realize a diálise durante a noite a quatro graus Celsius, no escuro. No dia seguinte, remova o polímero marcado purificado da cassete de diálise.O quitosano marcado com SCI cinco é então coletado em um tubo de microcentrífuga e armazenado a menos 20 graus Celsius. Adicione os pontos 6 0 5 funcionalizados com estreptavidina à solução de DNA plasmático biotinilado. Certifique-se de usar a série ITK de pontos Q revestidos para conjugação, em vez da série comum de pontos Q, pois os pontos quânticos da série ITK são projetados para a finalidade de fret.Incube a solução à temperatura ambiente por 15 minutos. Mantenha a reação de marcação com pontos quânticos (QD) no escuro para evitar possível fotodegradação. Após 15 minutos, adicione o DNA marcado com QD à solução de sulfato de sódio 50 milimolar para obter um volume final de 200 microlitros.Para preparar o polímero sci-fi, calcule a quantidade necessária de quitosana para 10 microgramas de DNA plasmidial de acordo com a razão NP desejada, que é a razão teórica entre iminas protonadas na solução de quitosana e fosfatos negativos na solução de DNA. Dilua a quitosana sci-fi de acordo com a razão NP desejada com água Milli Q para obter um volume final de 200 microlitros. As soluções de DNA marcado com QD e quitosana sci-fi estão agora prontas para serem carregadas no dispositivo microfluídico, como será demonstrado na seção seis. A lâmina de silício é preparada previamente por limpeza com piranha e secagem em estufa para remover umidade da lâmina, para a espessura nominal do molde de 25 mícrons. Aplique o fotoresiste negativo na lâmina de silício por spin coating a 2000 RPM durante 30 segundos.Realize uma pré-cura da pastilha em uma placa aquecida com uma rampa de 65 graus Celsius por hora até 95 graus Celsius. Isso evaporará o solvente no fotoresiste SU-8 e o solidificará antes da exposição à luz UV.Após a pré-secagem, aplique um filme de máscara contendo o desenho dos microcanais sobre a bolacha de silício exposta à luz UV em 365 nanômetros por 250 milijoules por centímetro quadrado após a exposição. Asse a bolacha em uma placa aquecida com uma rampa de 65 graus Celsius por hora até 95 graus Celsius. Revele a bolacha utilizando revelador de resistência fotossensível SU-8 para verificar a revelação completa.Mergulhe a pastilha no álcool isopropílico. O álcool isopropílico não deve ficar turvo. Por fim, para reforçar a estrutura de SU oito, faça uma cura térmica da pastilha padronizada em uma placa aquecedora com uma rampa de 65 graus Celsius por hora até 200 graus Celsius.Mantenha a pastilha a 200 graus Celsius por pelo menos cinco horas. Em seguida, resfrie gradualmente a pastilha até a temperatura ambiente. Coloque o molde SU oito em um barquinho de pesagem.Misture o elastômero de silicone e o agente de cura poli(dimetil Siloxano) ou PDMS em uma proporção de 10 para 1. Despeje a mistura de PDMS sobre o molde SU-8 e deixe o barquinho de pesagem em um dessecador a vácuo para remover bolhas. Cure o PDMS a 65 graus Celsius por uma a duas horas.Após a cura do PDMS, retire a tira de PDMS do molde-mestre de silicone usando um furador, com duas entradas de canal e uma saída de canal para o dispositivo fluídico. Limpe a tira de PDMS e o coverslip com etanol e, em seguida, seque ao ar. Trate a tira de PDMS e o coverslip limpos com plasma de oxigênio a 20 watts.Primeiramente, ligue imediatamente a tira de PDMS ao vidro de cobertura. Deixe o chip microfluídico ligado no forno a 95 graus Celsius durante a noite. O tratamento com plasma e a incuba&ccedil;&atilde;o noturna s&atilde;o essenciais para aumentar a resist&ecirc;ncia da liga&ccedil;&atilde;o.Antes de carregar os reagentes, preencha o canal microfluídico com água para garantir que não haja bolhas no interior. Isso garantirá um fluxo suave. Durante o experimento, carregue as soluções previamente preparadas de QD, DNA marcado e quitosana marcada com sci-fi em duas seringas de vidro individuais por meio da tubulação.Conecte a tubulação com as duas entradas do dispositivo microfluídico. Tenha cuidado para não introduzir nenhum ar durante o processo. Estabeleça a taxa de fluxo em 20 nanolitros por minuto sob condições de fluxo laminar.Verifique os microcanais ao microscópio quando o fluxo estiver estável, cerca de 15 a 20 minutos. O fret mediado por QD deve ser observado no centro do canal. Adquira imagens fluorescentes em diferentes locais ao longo do canal com uma câmera CCD refrigerada.Analise essas imagens com o ImageJ e o OriginLab. O sinal mediado por FRET é monitorado em diferentes posições axiais ao longo do canal. O tempo de residência é calculado com base na taxa de fluxo aplicada usando esta fórmula, onde TISA barra é o tempo de residência.O tempo X é a distância desde onde os dois fluxos se encontram até a posição da reação sob investigação. E V é a velocidade média do fluxo. Os perfis de intensidade transversal dos sinais de sci-fi mediados por fret podem então ser analisados em nosso sistema.Os perfis medidos experimentalmente exibem uma distribuição gaussiana. Acabamos de mostrar como monitorar complexos de DNA por meio de fio mediado quânticamente em um canal microfluídico simples. Ao realizar esses procedimentos, é importante lembrar-se de projetar uma marcação no seu canal microfluídico para que o tempo de residência possa ser determinado diretamente com base na taxa de fluxo aplicada e na geometria do canal.É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seu experimento.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Gota plataformas baseadas microfluídicos são candidatos promissores para a experimentação de alto rendimento, uma vez que são capazes de gerar picolitros, auto-compartimentada vasos barata a taxas kHz. Através da integração com rápido, sensível e de alta resolução de fluorescência métodos espectroscópicos, a grande quantidade de informações geradas nesses sistemas podem ser eficientemente extraído, aproveitada e utilizada.

Métodos de detecção de fluorescência para as plataformas de gotículas microfluídicos

Este vídeo descreve um método para visualizar a montagem de condensados de proteínas de fusão em moléculas de DNA em loci específicos usando imagens de molécula única. Esses condensados são formados devido às interações LCD-LCD e LCD-DBD, que permitem o recrutamento da RNA polimerase II e o aumento da transcrição gênica.

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Aqui nós descrevemos os instrumentos e métodos para a detecção de moléculas de proteína única fluorescently rotulados interagindo com uma única molécula de DNA suspenso entre duas microesferas opticamente presos.

Combinando uma única molécula de Manipulação e imagem para o estudo das interações proteína-DNA

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Descrevemos um ensaio digital de ponto final para quantificar ácidos nucléicos com uma leitura simplificada (analógica). Medimos a fluorescência em massa de ensaios digitais baseados em gotículas usando uma máquina de qPCR padrão em vez de instrumentação especializada e confirmamos nossos resultados por microscopia.

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Sequenciamento de célula única revela a heterogeneidade genotípica em sistemas biológicos, mas as tecnologias atuais não têm a produtividade necessária para a criação de perfil profundo de função e composição da Comunidade. Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho microfluidic para sequenciamento &gt; 50.000 monocelulares genomas de diversas populações de células.

Uma plataforma Microfluidic de ultra alta taxa de transferência para o sequenciamento do genoma de célula única

Usando DNA marcado com ponto quântico e microscopia de fluorescência de reflexão interna total, podemos investigar o mecanismo de reação das endonucleases de restrição ao usar proteína não marcada. Essa técnica de molécula única permite a observação massivamente multiplexada de interações proteína-DNA individuais, e os dados podem ser agrupados para gerar distribuições de tempo de permanência bem povoadas.

Análise de tempo de permanência de molécula única de clivagem de DNA mediada por endonuclease de restrição

Aqui, descrevemos o uso do método de imagem de molécula única, Cortinas de DNA, para estudar o mecanismo biofísico dos condensados EWS-FLI1 que se reúnem no DNA.

Imagem de molécula única de condensados EWS-FLI1 montados no DNA

A bioquímica visual de molécula única estudada através de câmaras microfluídicas é muito facilitada usando barril de vidro, seringas à prova de gás, conexões estáveis de tubos para células de fluxo e eliminação de bolhas colocando válvulas de comutação entre as seringas e a tubulação. O protocolo descreve armadilhas ópticas duplas que permitem a visualização de transações de DNA e interações intermoleculares.

Uso de pinças ópticas duplas e microfluídicas para estudos de molécula única

Aprenda a monitorar a automontagem de nanocomplexos de DNA em tempo real usando QD-FRET e microfluídica. Este método integra pontos quânticos e canais microfluídicos para estudar poliplexos de polieletrólitos com aplicações promissoras em terapia gênica.

Combinando QD-FRET e microfluídica para monitorar Nanocomplex DNA Automontagem-in Real-Time

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