Obtenção de RNA de alta qualidade a partir de populações de células no tecido humano único post-mortem do cérebro

Nós descrevemos um processo que utiliza laser de captura de microdissecção para isolar e extrair RNA de uma população de células homogêneas, neurônios piramidais, na camada III do giro temporal superior em cérebros post-mortem humano. Nós posteriormente linearmente amplificar (T7-based) mRNA, e hibridizar a amostra para o ser humano Affymetrix X3P microarray.

Este procedimento começa com o seccionamento de blocos de tecido congelado a vapor de nitrogênio líquido de oito micrômetros em um criostato ajustado a menos 17 graus Celsius em lâminas de vidro simples sem carga. Em seguida, as seções são coradas com o kit de coloração histogene. Depois de identificar os neurônios piramidais, as células cerca de 500 são capturadas a laser na tampa de captura de HS.

A tampa com células é colocada em um tubo de microcentrífuga contendo 50 microlitros de tampão de extração virado de cabeça para baixo e colocado em um tubo Falcon previamente posicionado no Iraque, sentado em banho-maria ajustado para 42 graus Celsius. Após uma curta etapa de centrifugação, a tampa é removida. A solução restante está então pronta para isolamento de RNA.

Olá, sou Charmaine Peterson, do laboratório de Wilson Wu no Departamento de Neurociência Estrutural e Molecular do Hospital McLean. Hoje vamos mostrar um procedimento para capturar neurônios parametálicos a laser do tecido cerebral humano post-mortem. Usamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar a expressão gênica diferencial no giro superior e pobre de indivíduos com esquizofrenia usando a tecnologia de microarray.

Então vamos começar. Os tecidos cerebrais foram obtidos do Harvard Brain Tissue Resource Center como blocos congelados a vapor de nitrogênio líquido antes do seccionamento do tecido. É importante reduzir a contaminação por RNAs todas as superfícies, incluindo a área de trabalho, lâmina de corte e lâminas são tratadas com uma solução de descontaminação de RNA, como RNA SAP e limpas com 100% de etanol.

Este procedimento começa com o seccionamento de blocos de tecido congelado a vapor de nitrogênio líquido em um criostato ajustado a menos 17 graus Celsius em lâminas de vidro simples sem carga. As seções de tecido estão agora prontas para a identificação de neurônios piramidais usando o kit de coloração rápida do gene histo. Preparar a alíquota da série de desidratação do etanol de 25 mililitros das concentrações adequadas de etanol e água isenta de ARN nos frascos de coloração fornecidos com o kit de histogenes.

Coloque todos os frascos em um balde de gelo, exceto um frasco de etanol de 75%. Coloque esse etanol de 75% no freezer de 20 graus Celsius negativos. Em seguida, prepare a solução de coloração adicionando um microlitro de inibidor de RNAs por 100 microlitros de solução de coloração.

Como estaremos colorindo quatro seções de tecido em duas lâminas, quatro microlitros de inibidor de RNAs são adicionados a 400 microlitros da solução de coloração em um tubo de microcentrífuga. Mantenha a solução de coloração no gelo. Sob um exaustor.

Adicione peneiras moleculares no frasco de xileno para remover o excesso de água, o que pode comprometer a elevação do tecido. Ligue o banho-maria com a temperatura ajustada para 42 graus Celsius e coloque um tubo Falcon de 50 mililitros apoiado em um rack no banho-maria. Remova duas lâminas do freezer de 80 graus Celsius negativos e descongele-as com um lenço Kim.

Por aproximadamente 30 segundos ou apenas até que os cantos das lâminas comecem a descongelar, fixe brevemente o tecido no etanol a 75% por 30 segundos no freezer de 20 graus Celsius negativos. Em seguida, usando uma pinça livre de RNA, transfira as lâminas para água livre de nuclease para uma 32ª lavagem Após a lavagem das lâminas, contorne as lâminas com uma caneta de barreira PAP para concentrar a solução de coloração na seção, core as quatro seções com a solução de coloração do gene histo por 20 segundos. Com 97 microlitros do inibidor de RNAs de corte de mancha por seção, desidrate as seções no etanol previamente preparado em gelo por 30 segundos por etapa.

A etapa final de etanol a 100% deve ser estendida para três minutos para atingir desidratação suficiente para o levantamento adequado do tecido. Por fim, mergulhe as lâminas em xileno por cinco minutos, permitindo que as lâminas sequem completamente ao ar antes de prosseguir com a microdissecção por captura a laser, os neurônios piramidais devem ser removidos imediatamente após a coloração do procedimento para captura a laser de célula única. MICRODISSECÇÃO ou LCM requer um banho-maria de 42 graus Celsius contendo um tubo Falcon de 50 mililitros suportado por um, que foi configurado anteriormente.

O LCM de célula única é realizado com o sistema e software de captura a laser ARCTURUS XT. Para iniciar este procedimento, carregue as corrediças e tampas no aparelho arcturus XT. Use as tampas HS de captura, mas mantenha a configuração do programa na macro.

Clique na caixa carregar com visão geral para obter uma foto geral de cada slide. Ajuste o foco de brilho em uma ampliação de dois x para determinar a seção ideal para captura a laser. Evite seções de tecido com dobras excessivas, mas escolha seções intactas, lisas e manchadas.

Bem, coloque uma tampa sobre a área geral onde você estará capturando, certificando-se de incluir a área a ser capturada em nosso caso. Camada três do córtex. Certifique-se de que os trilhos da tampa não estejam apoiados em nenhuma dobra, pois isso inclinará a tampa, resultando em tamanhos de pontos variáveis.

Em seguida, confirme a localização do ponto do laser IR manualmente na ampliação de 40x. A cruz azul deve ser centralizada dentro do ponto de laser IR. Caso contrário, ajuste sua localização clicando com o botão direito do mouse no local e selecionando o ponto IR localizado.

Com ampliação de 40 x, identifique os neurônios piramidais de acordo com os seguintes critérios, um que contém células em forma piramidal e dois, a porção proximal dos dendritos apicais e/ou basais são identificáveis. Salve a posição da tampa clicando no sinal de mais na função de posição. Dessa forma, se a tampa for movida, ela sempre retornará exatamente ao mesmo local para o qual você ajustou o tamanho do ponto.

Insira esses valores na caixa de controle: 70 em potência e 16 em duração. Como esses parâmetros são específicos para o nosso tecido, recomendamos que você teste e ajuste essas variáveis de acordo com sua amostra de tecido específica antes de começar. Com a captura a laser de células individuais, desmarque a opção de estágio de movimento automático e certifique-se de que o símbolo de tamanho correto esteja correlacionado com o símbolo no painel à direita.

Selecione a opção de círculo no canto inferior direito para selecionar um neurônio que você gostaria de testar a captura. E depois de alinhar a cruz azul com o círculo, ative o laser clicando no ponto IR de teste. O ponto feito pelo laser deve primeiro ter um anel escuro nítido ao redor do objeto capturado.

Certifique-se de que o anel seja grande o suficiente para abranger a célula, mas pequeno o suficiente para não incluir tecido indesejado ou outras células. Se este anel for muito leve, a célula não foi capturada. Se houver um ponto escuro no meio do anel escuro, a duração da barra de força do laser é muito grande.

Repita esse processo em diferentes partes do tecido dentro da camada que deseja capturar. Para verificar se o tamanho do ponto não difere dependendo do local, ajuste de acordo. Identifique neurônios piramidais para capturar aproximadamente 500 células.

Pressione o botão de captura a laser para capturar células. Mova a tampa para a estação de controle de qualidade. Certifique-se de que pelo menos 90% dos neurônios foram removidos.

Caso contrário, capture mais células na área onde a maioria das células foi capturada. Coloque a tampa em um tubo de microcentrífuga de 0.5 mililitro contendo 50 microlitros de tampão de extração. A tampa foi projetada para se encaixar perfeitamente para evitar que o buffer vaze.

Vire o conjunto de cabeça para baixo, certificando-se de que o tampão de extração cubra toda a tampa e coloque-o no fundo do tubo Falcon de 50 mililitros no banho-maria ajustado a 42 graus Celsius. Incubar os neurônios por 30 minutos para remover o tecido da tampa, após a incubação centrifugue o conjunto do tubo e da tampa por dois minutos a 800 gs. Após a centrifugação, remova a tampa.

Se o isolamento de RNA só for realizado posteriormente. Armazene o extrato celular restante a menos 80 graus Celsius. Caso contrário, prossiga com o isolamento do RNA do extrato celular, conforme mostrado na próxima seção, o isolamento do RNA é realizado usando o kit de isolamento puro PICO, que é projetado para isolar um pequeno número de células de amostras LCM e reter mRNA de baixa abundância.

Para iniciar este procedimento, adicione 70% de etanol fornecido com o kit ao extrato celular e centrifugue em uma coluna de purificação pré-condicionada. Para ligar o RNA ao filtro de coluna após a lavagem, trate o RNA com D Ns para eliminar o risco de interferência no DNA. Esta etapa é particularmente importante em aplicações downstream, como RTPC em tempo real.

Após a digestão do DNA, adicione 40 microlitros de tampão de lavagem um e centrifugue a coluna de purificação por 15 segundos a 8.000 Gs.Depois disso, prossiga com as lavagens de acordo com o protocolo fornecido com o kit, mas estenda a etapa final de lavagem com tampão de lavagem dois de dois para dois minutos e meio para garantir que nenhum tampão de lavagem permaneça na coluna, o que pode reduzir seu rendimento de RNA. Transfira a coluna para outro tubo de microcentrífuga. Adicione o tampão eluciano e incube no filtro na coluna por um minuto, centrifugue a coluna para eluir o RNA.

Por fim, verifique a qualidade do RNA extraído executando um chip de laboratório Experian High Sense, que fornece uma pipeta virtual de gel e eletroferograma de 1,3 microlitros da amostra em um tubo de 0,5 mililitro. Para o teste de controle de qualidade, congele o restante da amostra a menos 80 graus Celsius. Uma vez verificada a qualidade do RNA, ele pode ser amplificado, marcado e hibridizado.

Para análise de perfil de expressão gênica, duas rodadas de amplificação linear serão realizadas com o kit ribo amp HS plus, o que deve resultar em aproximadamente 50 microgramas de RNA amplificado suficiente para a realização de experimentos de microarray e Q-R-T-P-C-R. O kit de rotulagem de turbo biotina e a marcação de dispositivos moleculares são usados para rotular o RNA amplificado. Finalmente, será realizado o perfil de expressão gênica usando a boina pro chip do gene X três P humano da atrix.

O corte de tecido deve resultar em duas lâminas com duas seções por lâmina, quatro seções no total por caso. Cada seção deve ser lisa com o mínimo de rasgos, rachaduras ou dobras. Os neurônios piramidais devem ser corados de forma escura em torno de 20 a 25 micrômetros de tamanho com uma forma piramidal e dendritos apicais visíveis.

Durante o LCM, depois que o laser pulsou através do filme termoplástico, as células aderem à tampa e, portanto, não estão mais na lâmina, deixando o tecido circundante. Atrás de aproximadamente 85 a 100% dos neurônios devem aderir à tampa com as tampas HS de captura em configurações macro e ajuste correto da potência e força do laser. Para cada seção, você deve obter cerca de 500 a 700 células por seção, resultando em pelo menos 500 picogramas de RNA total por caso.

Após o isolamento total do RNA, a qualidade do RNA é avaliada por meio de um eletroferograma e um gel virtual via BioRad Experian. No eletroferograma, você deve ver dois picos distintos correspondentes às unidades de RNA ribossômico de 18 s e 20 a s com tecido post-mortem. No entanto, nem sempre é esse o caso, pois o tecido pode ser degradado devido a fatores anteriores ao seccionamento.

Normalmente, você verá uma grande protuberância indicando degradação com um grande pico em torno de 18 s e um pico menor de 28 s, conforme indicado pelas setas vermelhas. Em contraste, RNA de má qualidade com muita degradação será indicado por um eletroferograma com uma grande área sob sua curva. Além de uma redução na localização da propagação para testar a qualidade do mRNA após duas rodadas de amplificação linear, usamos o chip de laboratório Sense padrão BioRad Experian e o espectrofotômetro NanoDrop.

A tecnologia tradicional de microarray Atrics requer que a propagação do transcrito de mRNA tenha pelo menos 600 nucleotídeos de comprimento para ser detectada com este protocolo. A disseminação do mRNA atingiu a faixa de 1000 nucleotídeos, conforme indicado pelo eletroferograma com grandes picos descendo lentamente em função do tempo. Este resultado também é confirmado pelo gel virtual.

Se os comprimentos de transcrição forem menores que 600 nucleotídeos, a amostra não deve ser incluída Para hibridização, as leituras do NanoDrop indicaram uma média de dois 60 sobre uma proporção de dois 80 ou pureza de 2,5 entre as amostras. A concentração média foi de 1,7 microgramas por microlitro, resultando em aproximadamente 50 microgramas de mRNA por amostra, suficiente para análise de microarray e validação subsequente, o que requer entre 15 a 20 microgramas de mRNA e posterior validação dos resultados com QR TPCR. Nossos resultados indicam que, com este protocolo, tanto a quantidade quanto a qualidade do RNA obtido são boas o suficiente para investigar as diferenças de expressão gênica via chip atrix humano X três P.

Após a hibridização com o chip Atrics Human X três P, alcançamos chamadas percentuais de uma média de 26,6%, indicando hibridização adequada e intensidades de sonda. Acabamos de mostrar como capturar neurônios parametálicos a laser do tecido cerebral humano post-mortem para usar o RNA obtido dessas células. Para estudos de perfil de microarray G ao fazer este procedimento, é importante realizar todas as etapas em um ambiente livre de RNAs e concluir as etapas em tempo hábil para preservar a integridade do RNA.

Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.