Obtenção de RNA de alta qualidade a partir de populações de células no tecido humano único post-mortem do cérebro

Este procedimento começa com o corte de blocos de tecido congelados em vapor de nitrogênio líquido de oito micrômetros em um criostato ajustado a menos 17 graus Celsius, depositando-os em lâminas de vidro lisas e não carregadas. Em seguida, os cortes são corados com o kit de coloração histo gene. Após identificar os neurônios piramidais, cerca de 500 células são capturadas a laser na tampa de captura HS.

A tampa com as células é colocada em um tubo de microcentrífuga contendo 50 microlitros de tampão de extração virado de cabeça para baixo e posicionado em um tubo Falcon previamente colocado no Iraque, acomodado em banho-maria ajustado a 42 graus Celsius. Após uma breve etapa de centrifugação, a tampa é removida. A solução remanescente está então pronta para o isolamento de RNA.

Olá, sou Charmaine Peterson do laboratório de Wilson Wu, do Departamento de Neurociência Estrutural e Molecular do Hospital McLean. Hoje vamos mostrar um procedimento para captura a laser de neurônios paramedianos a partir de tecido cerebral humano pós-mortem. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a expressão gênica diferencial nos giros superior e inferior de indivíduos com esquizofrenia, empregando tecnologia de microarranjo.

Então vamos começar. Os tecidos cerebrais foram obtidos do Harvard Brain Tissue Resource Center na forma de blocos congelados em vapor de nitrogênio líquido antes da secção do tecido. É importante reduzir a contaminação por RNAs em todas as superfícies; assim, a área de trabalho, a lâmina de secção e as lâminas são tratadas com uma solução de descontaminação de RNA, como a RNA SAP, e limpas com etanol a 100%.

Este procedimento começa com o corte de blocos de tecido congelados pelo vapor de nitrogênio líquido em um criostato ajustado a menos 17 graus Celsius, depositando-os diretamente em lâminas de vidro lisas e não carregadas. As secções de tecido estão agora prontas para a identificação de neurônios piramidais utilizando o kit de coloração histo gene quick. Prepare a série de desidratação com etanol, aliquotando 25 mililitros das concentrações apropriadas de etanol e água livre de RNA nos frascos de coloração fornecidos com o kit histo gene.

Coloque todos os frascos em um balde de gelo, exceto um frasco de etanol 75%. Coloque esse frasco de etanol 75% no congelador a menos 20 graus Celsius. Em seguida, prepare a solução de coloração adicionando um microlitro de inibidor de RNAses a cada 100 microlitros da solução de coloração.

Como vamos corar quatro seções de tecido em dois lâminas, quatro microlitros de inibidor de RNAses são adicionados a 400 microlitros da solução de coloração em um tubo microcentrífuga. Mantenha a solução de coloração em gelo. Sob uma capela de exaustão.

Adicione peneiras moleculares ao frasco de xilol para remover o excesso de água, o que poderia comprometer a remoção do tecido. Ligue o banho-maria com a temperatura ajustada a 42 graus Celsius e coloque um tubo Falcon de 50 mililitros apoiado em um suporte dentro do banho-maria. Retire duas lâminas do congelador a menos 80 graus Celsius e descongele-as sobre uma toalha de papel Kim.

Por aproximadamente 30 segundos ou apenas até que as bordas dos lâminas comecem a descongelar, fixe brevemente o tecido em etanol 75% por 30 segundos no congelador a menos 20 graus Celsius. Em seguida, utilizando pinças livres de RNase, transfira os lâminas para água livre de nucleases para uma lavagem de 32 segundos. Após a lavagem dos lâminas, delimite as seções com uma caneta PAP para concentrar a solução de coloração sobre a seção e cora as quatro seções com a solução de coloração histo gene por 20 segundos. Com 97 microlitros do inibidor de RNAses por seção, desidrate as seções no etanol previamente preparado em gelo por 30 segundos por etapa.

O passo final com etanol a 100% deve ser prolongado por três minutos para obter uma desidratação suficiente que permita o adequado destacamento do tecido. Por fim, imergir as lâminas em xilol por cinco minutos, permitindo que sequem ao ar completamente antes de prosseguir para a microdissecção a laser; os neurônios piramidais devem ser removidos imediatamente após a coloração, no procedimento de captura a laser de uma única célula. A MICRODISSECÇÃO A LASER ou LCM exige um banho-maria a 42 graus Celsius contendo um tubo Falcon de 50 mililitros sustentado por um suporte, que foi montado anteriormente.

A LCM de célula única é realizada com o sistema e software de captura a laser ARCTURUS XT. Para iniciar este procedimento, carregue as lâminas e tampas no aparelho arcturus XT. Utilize as tampas de captura HS, mas mantenha a configuração do programa em macro.

Clique na caixa carregar com visão geral para obter uma imagem geral de cada lâmina. Ajuste o foco de brilho em duas vezes de ampliação para determinar a seção ideal para captura a laser. Evite seções de tecido com dobramento excessivo, mas escolha seções que estejam intactas, lisas e coradas.

Coloque uma cápsula sobre a região geral onde você fará a captura, certificando-se de incluir a área a ser capturada, em nosso caso, a camada três do córtex. Certifique-se de que os trilhos da cápsula não fiquem sobre dobras, pois isso inclinará a cápsula, resultando em tamanhos variáveis dos pontos.

Em seguida, confirme manualmente a localização do ponto do laser de infravermelho com ampliação de 40 x. A cruz azul deve estar centralizada dentro do ponto do laser de infravermelho. Caso contrário, ajuste sua posição clicando com o botão direito sobre o ponto e selecionando o ponto de infravermelho localizado.

Com ampliação de 40 x, identifique os neurônios piramidais de acordo com os seguintes critérios: primeiro, que as células tenham formato piramidal; segundo, que a porção proximal dos dendritos apicais e/ou basais seja identificável. Salve a posição do capilar clicando no sinal de adição na função de posição. Dessa forma, se o capilar for movido, ele sempre retornará exatamente ao mesmo local em que você ajustou o tamanho do ponto.

Insira esses valores na caixa de controle: 70 em potência e 16 em duração. Como esses parâmetros são específicos para o nosso tecido, recomendamos que você teste e ajuste essas variáveis de acordo com sua amostra de tecido específica antes de iniciar. Ao capturar células individuais com o laser, desmarque a opção de mover automaticamente a platina e certifique-se de que o símbolo de tamanho correto corresponda ao símbolo no painel à direita.

Selecione a opção de círculo no canto inferior direito para escolher um neurônio que você deseja testar a captura. Após alinhar a cruz azul com o círculo, ative o laser clicando em teste do ponto de IR. O ponto feito pelo laser deve apresentar, inicialmente, um anel escuro nítido ao redor do objeto capturado.

Certifique-se de que o anel seja grande o suficiente para englobar a célula, mas pequeno o suficiente para não incluir tecido indesejado ou outras células. Se esse anel for muito claro, a célula não foi capturada. Se houver um ponto escuro no centro do anel escuro, então a intensidade ou duração do laser é excessiva.

Repita este processo em diferentes partes do tecido dentro da camada que você deseja capturar. Para verificar se o tamanho do ponto não varia conforme a localização, faça os ajustes necessários. Identifique neurônios piramidais para captura, aproximadamente 500 células.

Pressione o botão de captura a laser para capturar as células. Mova a tampa para a estação de controle de qualidade. Certifique-se de que pelo menos 90% dos neurônios tenham sido removidos.

Se não, capture mais células na área onde a maioria das células foi capturada. Coloque a tampa em um tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitro contendo 50 microlitros de tampão de extração. A tampa foi projetada para se encaixar perfeitamente, evitando vazamento do tampão.

Coloque a montagem de cabeça para baixo, certificando-se de que o tampão de extração cubra toda a tampa, e posicione-a na parte inferior do tubo Falcon de 50 mililitros no banho-maria ajustado a 42 graus Celsius. Incube os neurônios por 30 minutos para remover o tecido da tampa; após a incubação, centrifugue a montagem do tubo e da tampa por dois minutos a 800 ×g. Após a centrifugação, remova a tampa.

Se o isolamento de RNA for realizado somente em um momento posterior, armazene o extrato celular remanescente a menos 80 graus Celsius. Caso contrário, prossiga com o isolamento de RNA do extrato celular conforme mostrado na próxima seção. O isolamento de RNA é realizado utilizando o kit de isolamento PICO pure, que foi desenvolvido para isolar pequenos números de células de amostras de LCM e para manter mRNA de baixa abundância.

Para iniciar este procedimento, adicione etanol 70% fornecido com o kit ao extrato celular e centrifugue em uma coluna de purificação previamente condicionada. A fim de ligar o RNA ao filtro da coluna após a lavagem, trate o RNA com D Ns para eliminar o risco de interferência do DNA. Esta etapa é particularmente importante em aplicações posteriores, como a R-T-P-C-R em tempo real.

Após a digestão do DNA, adicione 40 microlitros do tampão de lavagem um e centrifugue a coluna de purificação por 15 segundos a 8.000 Gs. Em seguida, prossiga com as lavagens conforme o protocolo fornecido com o kit, mas estenda o passo final de lavagem com o tampão de lavagem dois de dois para dois minutos e meio para garantir que nenhum tampão de lavagem permaneça na coluna, o que pode reduzir o seu rendimento de RNA. Transfira a coluna para outro tubo de microcentrífuga. Adicione o tampão de eluição e incube no filtro da coluna por um minuto; centrifugue a coluna para eluir o RNA.

Por fim, verifique a qualidade do RNA extraído utilizando um chip Experian High Sense lab, que fornece um gel virtual e um eletroferograma; pipete 1,3 microlitros da amostra em um tubo de 0,5 mililitro. Para o teste de controle de qualidade, congele o restante da amostra a menos 80 graus Celsius. Uma vez verificada a qualidade do RNA, ele pode ser amplificado, marcado e hibridado.

Para a análise de perfilagem de expressão gênica, serão realizadas duas rodadas de amplificação linear com o kit ribo amp HS plus, o que deve resultar em aproximadamente 50 microgramas de RNA amplificado, quantidade suficiente para a realização de experimentos de microarranjo e Q-R-T-P-C-R. O kit de marcação turbo biotina e a marcação da Molecular Devices são utilizados para marcar o RNA amplificado. Finalmente, será realizada a perfilagem da expressão gênica utilizando o chip de genes humano X three P pro beret da Atrix.

O corte do tecido deve resultar em dois lâminas, com duas seções por lâmina, totalizando quatro seções por caso. Cada seção deve ser lisa, com mínimas rasgaduras, rachaduras ou dobras. Os neurônios piramidais devem estar intensamente corados, com tamanho entre 20 e 25 micrômetros, formato piramidal e dendritos apicais visíveis.

Durante a MCL, após o pulso do laser atravessar o filme termoplástico, as células aderem à tampa e, portanto, já não permanecem no lâmina com o tecido circundante. Atrás de aproximadamente 85 a 100% dos neurônios devem aderir à tampa com as tampas de captura HS em configurações macro e ajuste correto da potência e intensidade do laser. Para cada seção, você deve obter cerca de 500 a 700 células por seção, resultando em pelo menos 500 picogramas de RNA total por caso.

Após o isolamento do RNA total, a qualidade do RNA é avaliada por meio de um eletroferograma e um gel virtual utilizando o BioRad Experian. No eletroferograma, devem ser observados dois picos distintos correspondentes às unidades de RNA ribossomal 18 s e 20 a s em tecido pós-morte. No entanto, nem sempre é esse o caso, pois o tecido pode estar degradado devido a fatores anteriores ao corte.

Você normalmente verá um grande pico indicando degradação, com um pico acentuado em torno de 18 s e um pico menor em 28 s, conforme indicado pelas setas vermelhas. Em contraste, o RNA de baixa qualidade, com degradação excessiva, será indicado por um eletroferograma com uma grande área sob a curva. Além de uma mudança para baixo na posição da dispersão para testar a qualidade do mRNA após duas rodadas de amplificação linear, utilizamos tanto o chip padrão BioRad Experian Sense Lab quanto o espectrofotômetro NanoDrop.

A tecnologia tradicional de microarranjo Atrics exige que a extensão do transcrito de mRNA tenha pelo menos 600 nucleotídeos de comprimento para ser detectada com este protocolo. A extensão do mRNA atingiu a faixa de 1000 nucleotídeos, conforme indicado pelo eletroferograma, com picos grandes que diminuem lentamente em função do tempo. Esse resultado também é confirmado pelo gel virtual.

Se os comprimentos dos transcritos forem menores que 600 nucleotídeos, a amostra não deve ser incluída. Para hibridização, as leituras no NanoDrop indicaram uma média da razão A260/A280 ou pureza de 2,5 entre as amostras. A concentração média foi de 1,7 microgramas por microlitro, resultando em aproximadamente 50 microgramas de mRNA por amostra, quantidade suficiente para análise por microarray e validação subsequente, que exige entre 15 a 20 microgramas de mRNA e validação dos resultados com RT-qPCR. Nossos resultados indicam que, com este protocolo, tanto a quantidade quanto a qualidade do RNA obtido são boas o suficiente para investigar diferenças na expressão gênica por meio do chip Atrix Human X Three P.

Após a hibridização com o chip Atrics Human X three P, obtivemos porcentagens de chamadas com uma média de 26,6%, indicando hibridização adequada e intensidades de sonda satisfatórias. Acabamos de mostrar como capturar por laser neurônios parametais de tecido cerebral humano pós-mortem para utilizar o RNA obtido dessas células. Em estudos de perfilagem por microarranjo G, ao realizar este procedimento, é importante executar todas as etapas em um ambiente livre de RNAses e completar os passos em tempo hábil para preservar a integridade do RNA.

É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.