Name: Isolamento de RNA Síntese Zebrafish e cDNA embrionárias para Análise de Expressão Gênica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-07T16:40:00.000+00:00
Duration: 15 min 21 s
Description: Aprenda a isolar RNA de embriões de zebrafish e sintetizar cDNA para análise de expressão gênica. Este protocolo confiável utiliza reagente TRIzol e minikit Qiagen RNEasy para obter RNA de alta qualidade.

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Parte 1: Extração de RNA total utilizando reagente Trizol Quando se trabalha com RNA é muito importante trabalhar em um ambiente que está livre de RNAses. Precauções simples, como ter pipetas reservados para uso apenas com os procedimentos de RNA e pulverizar a área de trabalho com um reagente descontaminante (por exemplo, RNAse Fora) antes de iniciar o procedimento são muito úteis. <ol><li> Para atingir uma quantidade suficiente de RNA piscina de 50 embriões zebrafish em um microtubo de 1,5 ml e remover tanta água quanto possível com uma pipeta. </li><li> Imediatamente adicione 250 mL de reagente Trizol 1 para o tubo de microcentrífuga contendo os embriões. Reagente Trizol contém fenol e só deve ser utilizado sob uma coifa. </li><li> Lyse e homogeneizar os embriões com um pilão pellet (aproximadamente 20 cursos) até que o tecido é suficientemente perturbada. </li><li> Quando as células são suficientemente homogeneizada, adicionar 750 mL de reagente TRIzol para igualar um volume total de 1 ml. </li><li> Para permitir a dissociação completa dos complexos de nucleoproteínas, incubar amostras homogeneizadas por 5 minutos em temperatura ambiente. Nesta fase, a amostra pode ser flash congelado em nitrogênio líquido e armazenadas a -80 ° C ou o protocolo pode ser continuado. </li><li> Para continuar a adicionar 0,2 ml de clorofórmio e agitar o tubo por 15 segundos para misturar. </li><li> Incubar a amostra por 2 minutos em temperatura ambiente e, em seguida, centrifugar a 12.000 xg por 15 minutos a 4 ° C. </li><li> A mistura será separada em uma fase inferior fenol-clorofórmio vermelho, uma interfase, e uma fase superior aquosa incolor. A fase aquosa superior contém o RNA. A camada superior deve incluir cerca de 60% do volume inicial de TRIzol (aproximadamente 0,6 ml). Transferir a camada superior aquosa para um tubo de microcentrífuga novo usando uma pipeta de 1 ml com cuidado para não transferir qualquer da camada de interfase. </li><li> Para precipitar o RNA adicionar 0,5 ml de isopropanol. </li><li> Permitir que a amostra para sentar-se à temperatura ambiente por 10 minutos e, em seguida, centrifugar a amostra a 12.000 xg por 10 minutos a 4 ° C. RNA formará uma bolinha de gel na parte inferior do tubo. </li><li> Sem perturbar o sedimento, remover o sobrenadante com uma pipeta e lavar o sedimento em 1 ml de etanol 75%. Misturar a amostra por inversão e centrifugar a 7500 xg por 5 minutos a 4 ° C. </li><li> Após a centrifugação, remover o etanol com uma pipeta e permitir a amostra seca ao mesmo tempo invertido por 10 minutos. </li><li> Ressuspender o sedimento, adicionando 100 ul de água livre de RNAse e incubar a amostra a 55 ° C por 10 minutos. Recomenda-se a dedo vortex freqüentemente durante a incubação para ajudar na reidratação RNA. Opcionalmente, você pode verificar a qualidade e quantidade de amostra usando um ND-1000 NanoDrop espectrofotômetro ou diretamente continuar para a próxima etapa. </li></ol> Parte 2: Limpeza de RNA usando o Qiagen RNEasy Mini Kit A Qiagen RNEasy Mini Kit 2 é útil na remoção de contaminantes e impurezas de uma amostra de RNA isolado de outros métodos. Para este procedimento, β-mercaptoetanol, etanol e água livre de nuclease são necessários além dos componentes incluídos no kit. Um tratamento DNAse opcional é recomendado durante este procedimento. <ol><li> Após a primeira utilização do kit, tampão RPE terá de ser preparado por adição de 4 volumes de etanol 100% para um volume de RPE Buffer. </li><li> No dia do procedimento, tampão RLT terá de ser preparada. Calcule a quantidade total de tampão RLT que serão necessários. Um volume de 350 mL é necessário por amostra. Para preparar RLT Buffer, adicione 10 ml de β-mercaptoetanol para cada 1 ml de buffer. Isto deve ser feito sob a coifa. </li><li> Para cada amostra adicionar 350 uL de tampão RLT e 250 mL de etanol a 100%. Misture bem, pipetando cima e para baixo várias vezes. </li><li> Transferir a amostra, que deve ser de aproximadamente 700 mL, em uma coluna RNEasy que é colocado em um tubo de coleta de 2 ml e centrifugar a 8.000 xg por 1 minuto à temperatura ambiente. </li><li> Após centrifugação, descartar a fluir através de e adicione 700 mL de tampão RW1 a uma coluna de spin RNEasy. </li><li> Centrifugar a amostra a 8.000 xg por 1 minuto à temperatura ambiente e, em seguida, descartar a fluir. </li><li> DNAse tratamento com RNAse Qiagen-Free DNAse Kit: DNAse tratamento é opcional, mas é altamente recomendado para as amostras da mais alta qualidade. <ol style="list-style-type:upper-alpha;"><li> Quando você receber o kit de tratamento DNAse, você vai precisar para preparar a solução estoque DNAse I, adicionando água 550 mL nuclease-free para a DNAse. Misture delicadamente por inversão e não vortex. Alíquotas em frascos de utilização única contendo 10 ml da solução estoque. Você pode armazenar a solução estoque a -20 ° C por até 9 meses. As alíquotas descongeladas podem ser armazenadas a 4 ° C durante 6 semanas, se necessário, mas não voltar a congelar as alíquotas após o descongelamento. </li><li> Para preparar a mistura de incubação DNAse eu adicionar 70 mL de buffer RDD para 10 ml DNAse I stock solução por amostra. Misture por inversão suave e tubo de centrifugação rapidamente para recolher o líquido residual dos lados do tubo. Adicionar 80 mL DNAse mix de incubação eu diretamente para a coluna de spin RNEasy. Incubar o tratamento DNAse por 30 minutos em temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Tratamento DNAse seguir adicionar 350 mL de buffer RW1 para a coluna de spin e centrifugar a 8.000 xg por 1 minuto à temperatura ambiente. </li><li> Após a centrifugação descartar a fluir através de e adicionar 500 mL de buffer RPE para a coluna de spin. Incubar amostra por 5 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Centrifugar a 8.000 xg amostra por 1 minuto à temperatura ambiente e descarte a fluir. </li><li> Após a centrifugação adicionar 500 mL de etanol 75% para a coluna de spin. </li><li> Repetir a centrifugação a 8.000 xg, mas por 2 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Após a centrifugação descartar a fluir através de e permitir que a coluna para secar por 5 minutos. </li><li> Imediatamente centrífuga a 8.000 xg por 5 minutos em temperatura ambiente para remover qualquer sobra de vestígios de etanol. </li><li> Após a centrifugação é a transferência completa da coluna de spin em um novo tubo de coleta de 1,5 ml de água e adicionar 10 mL livre de nuclease. Incubar por 1 minuto e então centrifugar a 10.000 xg por 1 minuto à temperatura ambiente. O RNA será no fluir. </li><li> Adicionar outro mL 10 de água livre de nuclease para a coluna girar e incubar a temperatura ambiente por 1 minuto. Centrífuga de amostra a 10.000 xg por 1 minuto à temperatura ambiente. </li><li> Após a centrifugação remover e descartar a coluna spin. RNA será no fluir. </li><li> Verificar a quantidade ea qualidade do RNA usando um espectrofotômetro ND-1000 NanoDrop seguindo as instruções do fabricante. </li><li> Além disso, executar um gel desnaturante ou usar um Agilent 2100 Bioanalyzer para verificar a integridade do RNA. </li><li> Amostras devem ser armazenadas a -80 ° C até a síntese de cDNA podem ser executadas. </li></ol> Parte 3: Síntese de cDNA usando a Invitrogen SuperScript Sistema First-Strand RNA é facilmente suscetível à clivagem pela RNAses levando à degradação. Como resultado protocolos expressão muitos gene têm sido desenvolvidos para usar um produto mais estável cDNA que foi diretamente sintetizado a partir do RNA. Aqui síntese detalhamos da vertente do primeiro cDNA usando a Invitrogen SuperScript Sistema de Síntese First Strand-3. Cada reação de síntese de cDNA pode acomodar até 5 mg de RNA. <ol><li> Antes de iniciar o procedimento de mistura e brevemente centrífuga cada componente. </li><li> Prepare RNA / mistura de primers num tubo de microcentrífuga estéril de 0,5 ml, conforme descrito na Tabela 1. </li><li> Incubar a amostra a 65 ° C por 5 minutos. </li><li> Imediatamente para transferir a pasta de gelo por 10 minutos. </li><li> Enquanto a amostra está esfriando preparar uma mistura principal com os componentes descritos na Tabela 2. Os volumes são listados por 1 reação. Ajustar volumes em conformidade, para o número total de reações. </li><li> Após o resfriamento, adicionar 9 mL da mistura principal preparada na etapa 5 para cada RNA / mistura primer. Misture delicadamente e recolher por centrifugação breve. O volume total de cada amostra deve ser de 19 mL. </li><li> Incubar amostra a 42 ° C por 2 minutos em um termociclador. </li><li> Adicionar 1 ml (50 unidades) de SuperScript II RT para cada tubo, misturar e incubar a 42 ° C por 60 minutos em um termociclador. </li><li> Finalizar a reação a 70 ° C por 15 minutos e depois relaxar amostra a 4 ° C. A termociclador pode ser programado para as etapas 8 e 9. </li><li> Depois de o provete ter atingido 4 ° C, transferir a reação a um banho de gelo. </li><li> No gelo adicionar 1 ml de RNAse H a cada tubo e incubar por 20 minutos a 37 ° C. O volume total é agora com 21 mL. Além de RNAse H para a amostra irá degradar o modelo de RNA e deixar apenas o produto único fio cDNA. </li></ol> Parte 4: Isolamento de cDNA e Precipitação <ol><li> Um tubo de 1,5 ml de fase gel bloqueio será utilizado no isolamento do produto cDNA. Prepare um tubo de 1,5 ml de fase gel bloqueio por centrifugação a 12.000 xg por 2 minutos. O gel deve ser todos no fundo do tubo. </li><li> Adicionar 81,5 mL de fenol (Tris-saturadas, tamponado a pH 8,0), 81,5 mL de álcool isoamílico 24:1 clorofórmio, e da amostra (21 mL) para o tubo de gel fase de bloqueio. Mix várias vezes por inversão suave. </li><li> Centrifugar a amostra a 12.000 xg por 5 minutos em temperatura ambiente. </li><li> O cDNA deve ser na fase aquosa superior. Transferir a fase superior para um tubo limpo de microcentrífuga de 1,5 ml. O volume total deve ser cerca de 20 mL. </li><li> Adicionar 1X volume de 3 M NaOAc, pH 5,2 e misture delicadamente. Por exemplo, se o volume da fase aquosa superior foi igual a 20 l, você terá que adicionar 2 l da 3 M NaOAc, pH 5.2. </li><li> Adicionar 7 mL de 5 glicogênio mg / ml e misture delicadamente. </li><li> Adicionar 1X volume de isopropanol e misture delicadamente. Geralmente isto é cerca de 30 mL de isopropanol. </li><li> Deixar a amostra para incubar a temperatur salae por 10 minutos e, em seguida, centrifugar a 12.000 xg por 20 minutos em temperatura ambiente. </li><li> A pelota pequena cDNA deve formar no fundo do tubo. Remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta. </li><li> Adicionar 500 mL de etanol 70% e misturar por inversão. </li><li> Centrifugar a amostra a 12.000 xg por 5 minutos. </li><li> Após a centrifugação remover o sobrenadante com uma pipeta e repita a lavagem de etanol 70% e centrifugação (etapas 10 e 11). </li><li> Após a centrifugação remover o sobrenadante com uma pipeta. Se houver líquido restante nas laterais do tubo, que podem ser reunidos por breves instantes, girando o tubo. Remova qualquer excesso de líquido e permitir que o pellet secar à temperatura ambiente por 5 minutos. </li><li> Adicionar 20 l de água livre de nuclease para reidratar o sedimento. Colocar a amostra a 55 ° C por 5 minutos para reidratação do sedimento. </li><li> A quantidade ea qualidade do produto cDNA é então verificada usando um espectrofotômetro ND-1000 NanoDrop seguindo as instruções do fabricante. O cDNA pode ser armazenado a -20 ° C. </li></ol> Resultados representante Após a limpeza RNA, cerca de 15 mg de RNA total de alta qualidade pode ser esperado de 50 embriões zebrafish. Para avaliar a qualidade do RNA total, um espectrofotômetro, eletroforese em gel, e um Agilent 2100 Bioanalyzer pode ser usado. A ND-1000 NanoDrop espectrofotômetro pode ser usado para avaliar a absorbância a 260 nm, em comparação com a absorvância a 280 nm (Figura 1). O A 260 / A 280 relação pode revelar a presença de contaminantes e dar indícios de degradação possível. Um A 260 / A 280 de 1,9-2,0 é considerada aceitável. Além disso, é altamente recomendável que um gel desnaturação RNA ser executado para avaliar a integridade do RNA. RNA vai separar em função do seu tamanho, com fios menores migrando mais para baixo do gel. A amostra não-degradada aparecerá como uma mancha com duas bandas fortes. O esfregaço é resultado de uma população de diferentes vertentes mRNA tamanho e as bandas correspondem a 28S e 18S rRNA. A banda 28S deve ser cerca de duas vezes tão intensa como a banda 18S (Figura 2). Alternativamente, a integridade do RNA total pode ser avaliada através de um Agilent 2100 Bioanalyzer. Dois picos distintos representando o rRNA 28S e 18S é esperado (Figura 3). O pico 28S deve ser maior do que o pico de 18S com a área sob os picos de aproximadamente 2:1, respectivamente. Dois picos distintos não será observada em amostras degradadas. Amostras de RNA exibindo degradação não deve ser feita através de procedimentos experimentais subseqüentes. Análise espectrofotométrica pode ser usado para avaliar a qualidade do produto cDNA (Figura 4). O A 260 / A 280 deve ser em torno de 1,8. reações cDNA com uma entrada de 5 mg de RNA total rotineiramente rendimento mg 1-2 de cDNA do produto em nosso laboratório. <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Um espectro NanoDrop de amostra de RNA. Após a limpeza RNA, RNA quantidade e qualidade pode ser avaliada através de um ND-1000 NanoDrop espectrofotômetro. Aproximadamente 15 mg de alta qualidade total RNA é rotineiramente rendeu a partir de 50 embriões zebrafish com um A 260 / A 280 em torno de relação de 1,9-2,0. <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Um gel desnaturação RNA. Para avaliar a integridade do isolamento do RNA total, um gel desnaturação RNA pode ser executado. Uma mancha com duas faixas brilhantes correspondente a 28S e 18S rRNA é esperado. A banda 28S deve ser de aproximadamente duas vezes mais intensa que a banda 18S. <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Um traço de uma amostra de RNA a partir de um Bioanalyzer. Para avaliar a integridade do isolamento do RNA total, as amostras também podem ser analisados ​​em um Agilent 2100 Bioanalyzer. Dois picos, correspondentes aos 28S e 18S rRNA, deve ser visível. O pico 28S deve ser maior do que o pico de 18S com a área sob os picos de aproximadamente 2:1, respectivamente. <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Um espectro NanoDrop de uma amostra de cDNA. Análise espectrofotométrica com um NanoDrop ND-1000 pode ser usado para avaliar a quantidade ea qualidade do produto cDNA. O A 260 / A 280 relação deve ser em torno de 1,8. reações cDNA com uma entrada de 5 ug de RNA total rotineiramente rendimento 1-2 ug de cDNA em nosso laboratório. Tabela 1. Componentes para adicionar para RNA / misturas de primer no passo 2 da síntese de cDNA. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Volume </td></tr><tr><td> Total de RNA (até 5 mg) </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> 10 mM dNTP mix </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Oligo (dT) 12-18 (0,5 mg / mL) </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> DEPC tratados com água </td><td> mL n </td></tr><tr><td> Volume total </td><td> 10 ml </td></tr></tbody></table> Mesa mistura de reação 2. Para a etapa 5 da síntese de cDNA. Volumes indicados são por reação. Aumentar os volumes de cada componente para o número total de reações. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Volume </td></tr><tr><td> Tampão RT 10X </td><td> 2 l </td></tr><tr><td> 25 mM MgCl2 </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td> 0,1 mM DTT </td><td> 2 l </td></tr><tr><td> RNAseOUT </td><td> 1 ml </td></tr></tbody></table>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22TRIzol+Reagent+Manual%22">TRIzol Reagent Manual</a>. , (2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22RNEasy+Mini+Handbook%22">RNEasy Mini Handbook</a>. , 4th ed, (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22SuperScript+First-Strand+Synthesis+System+for+RT-PCR%22">SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR</a>. , Version E. (2003).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a declarar.

A fragilidade da molécula de RNA é o aspecto mais crítico que deve ser lembrado ao longo deste protocolo. Equipamento estéril que é RNAse-free deve ser sempre usada em uma zona livre de RNAse do laboratório. É útil reservar uma parte do laboratório a ser utilizado para procedimentos de RNA apenas. Esta área deve ser freqüentemente pulverizados com um produto de remoção de RNAse, como RNAse Away. As amostras de RNA devem ser sempre manuseadas com luvas e mantidos em gelo para evitar a degradação. <p class="jove_conte...

<table><tbody><tr><td>Glicogênio (5 mg/ml)</td><td>Ambion</td><td>9510</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop ND-100</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Pestles de Pellet com Tubo Microfuge</td><td>VWR international</td><td>KT749520-0090</td><td></td></tr><tr><td>Phase Lock Gel Light, 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>2302800</td><td></td></tr><tr><td>Fenol, saturado com Tris</td><td>Roche Group</td><td>3117944001</td><td></td></tr><tr><td>RNAse Away</td><td>VWR international</td><td>17810-491</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de DNase Isento de RNase</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Kit RNEasy Mini</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Sistema SuperScript&amp;#174; de Síntese de Primeiro Filamento para RT-PCR</td><td>Invitrogen</td><td>11904-018</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento de rna síntese zebrafish e cdna embrionárias para análise de expressão gênica

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Muitos procedimentos laboratoriais importantes e complexas exigem um trabalho de alta qualidade, RNA intacto. Uma amostra degradada ou a presença de impurezas pode levar a resultados desastrosos em downstream aplicações experimentais. É, portanto, de extrema importância o uso de técnicas sólidas com inúmeras salvaguardas e verificações de controle de qualidade para garantir uma amostra superior. Neste documento, detalhamos um protocolo para isolar RNA total a partir de embriões zebrafish inteiro usando um desnaturante químico comercialmente disponível e limpeza após a remoção de vestígios de DNA e impurezas através de um kit de isolamento comercial RNA. Como RNA é relativamente instável e facilmente propenso a clivagem pela RNAses, a maioria dos protocolos de expressão gênica de ensaio utilizando um produto que está diretamente cDNA sintetizado a partir de um modelo de RNA. Detalhamos um procedimento para converter RNA no produto mais estável cDNA usando um kit disponível comercialmente. Ao longo destes procedimentos, há inúmeros testes de qualidade de controlo para garantir que a amostra não é degradada ou contaminada. O produto final destes protocolos é cDNA que é adequado para análise de microarray, RT-PCR ou armazenamento de longo prazo.

O isolamento de alta qualidade, RNA intacto é um passo essencial para muitos protocolos laboratoriais. Aqui, demonstramos extração de RNA a partir de embriões zebrafish todo e síntese de cDNA para posterior aplicação em vários procedimentos experimentais, incluindo análise de microarray gene de expressão.

Isolamento de RNA Síntese Zebrafish e cDNA embrionárias para Análise de Expressão Gênica

Muitos procedimentos laboratoriais importantes e complexos exigem a entrada de RNA intacto e de alta qualidade. Uma amostra degradada ou a presença de impurezas podem levar...

Para iniciar o isolamento de RNA e obter rendimentos suficientes, 50 embriões de peixe-zebra são transferidos para um tubo microfusível com almofariz. O RNA é primeiramente extraído usando triol, reagente e clorofórmio após homogeneização completa. Em seguida, o RNA é limpo e purificado utilizando o minikit Qiagen RNEZ, obtendo-se RNA total de alta qualidade e não degradado para aplicações futuras e armazenamento de longo prazo.O RNA é sintetizado no produto cDNA mais estável. O cDNA é purificado para remover a fita molde de RNA original. Olá, meu nome é Sam Peterson do laboratório da Dra. Jennifer Freeman do Departamento de Ciências da Saúde da Universidade Purdue.Hoje vamos mostrar como extrair RNA de alta qualidade de embriões inteiros de peixe-zebra e convertê-lo no produto CDNA. Normalmente, utilizamos este procedimento para estudar perfis de expressão gênica. Então, vamos começar.Ao trabalhar com RNA, é muito importante atuar em um ambiente livre de RNAses. Adote precauções simples, como reservar pipetas exclusivamente para procedimentos com RNA e pulverizar a área de trabalho com solução anti-RNAses antes de iniciar a extração de RNA total. Inicie o procedimento na cabine de segurança e transfira 50 embriões de peixe-zebra para um tubo microcêntrifugo de 1,5 mililitro. Remova o máximo possível de água e adicione imediatamente 250 microlitros do reagente triol, que contém fenol.Use um pistilo em forma de pellet para triturar e homogeneizar os embriões por aproximadamente 20 movimentos até que o tecido esteja suficientemente rompido. Em seguida, adicione 750 microlitros de reagente de triazol e incube por cinco minutos à temperatura ambiente para permitir a completa dissociação dos complexos proteicos nucleares. Quando os cinco minutos terminarem, adicione N 0,2 mililitros de clorofórmio, misturando ao agitar o tubo por 15 segundos, e incube a amostra por dois minutos à temperatura ambiente; depois, centrifugue a 12.000 G por 15 minutos a quatro graus Celsius.A mistura irá se separar em uma fase inferior vermelha de fenol-clorofórmio, uma fase intermediária e uma fase aquosa superior incolor. A camada superior tem aproximadamente 0,6 milímetros e contém o RNA; transfira toda a camada aquosa superior, aproximadamente 0,6 milímetros, para um novo tubo micro FUZE, tomando cuidado para não transferir nenhuma parte da camada interfacial. Em seguida, para precipitar o RNA, adicione 0,5 mililitros de isopropanol e misture.E vamos deixar em temperatura ambiente por 10 minutos, em seguida centrifugar a amostra a 12.000 G por 10 minutos a quatro graus Celsius. O RNA deve formar um pellet semelhante a um gel. Remova o sobrenadante sem perturbar o pellet e lave adicionando um mililitro de etanol 75%, misturando com inversão suave e centrifugando a 7.500 G por cinco minutos a quatro graus Celsius.Após a centrifugação, remova o etanol e inverta o tubo para secar por 10 minutos. Re-suspenda o pellet adicionando 100 microlitros de água livre de RNAses e incubando a 55 graus Celsius por 10 minutos. Vortexe com os dedos com frequência para auxiliar na reidratação do RNA.Agora que o RNA foi extraído dos embriões, prossiga para a purificação do RNA e tratamento com DNase. Para purificar o RNA, utilize inicialmente um kit Rogen RN easy mini. Na primeira utilização, adicione quatro volumes de etanol 100% a um volume do tampão RPE, trabalhando na capela de exaustão.Adicione 10 microlitros de beta-mercaptoetanol para cada um mililitro do tampão RLT. Em seguida, adicione 350 microlitros do tampão RLT e 250 microlitros de etanol a 100% à amostra, misturando por pipetagem para cima e para baixo várias vezes, e transfira toda a amostra para uma coluna RNeasy colocada em um tubo de coleta de dois mililitros. Centrifugue a 8.000 ×g por um minuto à temperatura ambiente; após a centrifugação, descarte o fluxo passante e adicione 700 microlitros do tampão RW1 à coluna de centrifugação.Centrifugue novamente a 8.000 G por um minuto e descarte o fluxo para remover DA da amostra. Em seguida, trate o DNA utilizando o kit de DNA livre de RNA. Após receber o kit, adicione 550 microlitros de água livre de nucleases aos DNAs e misture suavemente por inversão para armazenar a solução estoque dividida em alíquotas de 10 microlitros e congele a menos 20 graus Celsius.Adicione 70 microlitros do tampão RDD a 10 microlitros da solução estoque de DNA, misturando com inversão suave, centrifugue brevemente e adicione diretamente à coluna R e easy spin A. Incube o tratamento do DNA por 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, adicione 350 microlitros do tampão RW1 à coluna spin, centrifugue a 8.000 ×g por um minuto à temperatura ambiente, descarte o fluxo passante e adicione 500 microlitros do tampão RPE à coluna spin. Incube a amostra por cinco minutos à temperatura ambiente.Centrifugue novamente a 8.000 G por um minuto à temperatura ambiente, descarte o fluxo e adicione 500 microlitros de etanol a 75% à coluna de centrifugação. Repita a centrifugação a 8.000 G, mas por dois minutos à temperatura ambiente; após a centrifugação, descarte o fluxo e deixe a coluna secar por cinco minutos imediatamente. Centrifugue a 8.000 G por cinco minutos à temperatura ambiente para remover quaisquer traços residuais de etanol.Agora transfira a coluna de centrifugação para um novo tubo de coleta de 1,5 mililitro e adicione 10 microlitros de água livre de nucleases; incube por um minuto para eluir o RNA e centrifugue a 10.000 ×g por um minuto. À temperatura ambiente, o RNA estará no fluxo passante. Repita a eluição com outros 10 microlitros de água.Verifique a quantidade e qualidade do RNA utilizando um espectrofotômetro NanoDrop ND 1000, seguindo as instruções do fabricante. Além disso, realize uma eletroforese em gel desnaturante ou utilize um bioanalisador Agilent 2100 para verificar a integridade do RNA. Se a qualidade e a quantidade do RNA forem satisfatórias, prossiga para a síntese de cDNA.Finalmente, armazene o RNA a menos 80 graus Celsius até que a síntese de CD NA possa ser realizada. Inicie a síntese de CD NA misturando e centrifugando brevemente cada componente do iniciador de RNA. Misture os NTPs de RNA e oligo dt.Adicione cada componente a um tubo microfusão estéril de 0,5 mililitro para um volume total de 10 microlitros. Para volumes específicos, consulte o protocolo escrito anexo. Em seguida, incube a amostra a 65 graus Celsius por cinco minutos.Transfira imediatamente a amostra para uma mistura de gelo por 10 minutos enquanto a amostra está em processo de preparação; prepare uma mistura mestra de tampão até um volume total de nove microlitros, conforme descrito no protocolo escrito anexo. Após o resfriamento, combine a mistura mestra de tampão com a mistura de iniciador de RNA, misturando suavemente, e recolha por meio de uma breve centrifugação. Em seguida, coloque a amostra combinada para incubação no termociclador a 42 graus Celsius por dois minutos.Para iniciar a transcrição reversa, adicione um microlitro de superscript two RT ao tubo e misture. Incube a 42 graus Celsius por uma hora. Encerre a reação a 70 graus Celsius por 15 minutos.Em seguida, resfrie a amostra a quatro graus Celsius e transfira para um banho de gelo sobre gelo. Adicione um microlitro de RNase H à amostra e incube por 20 minutos a 37 graus Celsius; a RNase H degrada o molde de RNA, deixando apenas o produto de DNA complementar de fita simples. A síntese de cDNA está agora completa, exigindo apenas uma etapa adicional de purificação e concentração. Para isolar o produto de cDNA, prepare um tubo de gel de bloqueio de fase de 1,5 mililitro por centrifugação a 12.000 ×g por dois minutos.Todos os géis devem estar na parte inferior do tubo. Adicione 81,5 µL de fenol saturado com tris tamponado a pH 8,0, 81,5 µL de clorofórmio:álcool isoamílico na proporção 24:1 e a amostra ao tubo com gel de bloqueio de fase, misture várias vezes por inversão suave e centrifugue a amostra a 12.000 ×g durante cinco minutos. À temperatura ambiente, o cDNA deverá estar na fase aquosa superior.Transfira a fase superior, que deve ser de aproximadamente 20 microlitros, para um tubo microfuga limpo de 1,5 mililitro. Para precipitar o CDNA, adicione dois microlitros de acetato de sódio três molar com pH 5,2 e misture suavemente. Adicione sete microlitros de glicogênio a cinco miligramas por mililitro e misture suavemente.Em seguida, adicione 30 microlitros de isopropanol e misture suavemente, deixando a amostra incubando à temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida, centrifugue a 12.000 ×g por 20 minutos à temperatura ambiente. Após a centrifugação, um pequeno pellet de cDNA aparece no fundo do tubo.Remova cuidadosamente o sobrenadante com um perpet. Lave o pellet adicionando 500 microlitros de etanol a 70% e misture por inversão. Centrifugue a amostra a 12.000 ×g durante cinco minutos. Após a centrifugação, remova o sobrenadante com ape.Repita a lavagem, adicione etanol, centrifugue e remova o sobrenadante. Após a segunda lavagem, gire brevemente o tubo para reunir qualquer líquido remanescente. Remova todo o líquido em excesso e deixe o pellet secar à temperatura ambiente por cinco minutos.Em seguida, adicione 20 microlitros de água livre de nucleases para reidratar o pellet. Incube a amostra a 55 graus Celsius por cinco minutos. Para a reidratação, o CD NA pode ser armazenado a menos 20 graus Celsius.Por fim, verifique a quantidade e a qualidade do produto de CD NA utilizando um espectrofotômetro NanoDrop ND 1000 seguindo as instruções do fabricante. A extração e purificação de RNA de 50 embriões de peixe-zebra normalmente produz cerca de 15 microgramas de RNA total de alta qualidade, conforme avaliado com um espectrofotômetro NanoDrop ND 1000. A razão de absorvância entre 60 e 80 é de aproximadamente 1,9 a 2,0. A integridade do RNA extraído é avaliada utilizando um gel de RNA desnaturante. O RNA aparece como uma mancha difusa com duas faixas brilhantes correspondentes ao RNA ribossomal 18S e 28S.A banda de 28 s deve ter intensidade aproximadamente duas vezes maior que a banda de 18 s. Alternativamente, a integridade do RNA é avaliada utilizando um bioanalisador Agilent 2100. Duas picos nítidos correspondentes ao RNA ribossômico de 18 s e 28 s são visíveis.O pico de 28 s deve ser maior que o pico de 18 s. A transcrição reversa de cinco microgramas de RNA total normalmente produz um a dois microgramas de CDNA, conforme avaliado usando um NanoDrop ND 1000. A razão de absorvância de 60 a 80 entre dois do CDNA é em torno de 1,8.Acabamos de mostrar como isolar RNA total de embriões inteiros de peixe-zebra e converter esse RNA no produto de DNAc. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de manter um ambiente livre de RNAses. Por isso é isso.Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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