Análise da expressão global de Gene usando uma plataforma Microarray Zebrafish Oligonucleotide
10 de agosto de 2009
Gene microarrays são ferramentas poderosas no perfil de expressão gênica ao nível do genoma. Esta tecnologia tem aplicação em uma variedade de disciplinas biológicas, incluindo biologia do desenvolvimento e toxicologia. Neste vídeo, detalhamos um protocolo para análise global de expressão gênica utilizando uma plataforma de microarray abrangente de oligonucleotídeos para o peixe-zebra.
Este procedimento inicia-se com CDNA sintetizado a partir de um molde de RNA de alta qualidade. Primeiro, o CDNA é marcado com o corante fluorescente SI three. Após a conclusão da reação de marcação, o CDNA marcado é purificado, isolado e a qualidade da reação de marcação é avaliada.
O cDNA marcado é então hibridizado em um microarranjo. Após a hibridização, os arranjos são analisados para determinar os níveis relativos de expressão gênica nas amostras. Olá, meu nome é Sam Peterson do laboratório da Dra. Jennifer Freeman da Escola de Ciências da Saúde da Universidade Purdue.
Anteriormente, mostramos a você como extrair RNA de embriões de peixe-zebra e converter esse RNA em CDNA. Hoje, mostraremos o procedimento para marcar e hibridar esse CDNA em uma plataforma de microarranjo de oligonucleotídeos de peixe-zebra, a fim de estudar perfis globais de expressão gênica. Normalmente, utilizamos este procedimento para estudar a expressão gênica diferencial em resposta à exposição a uma toxina.
Então vamos começar. O experimento de microarranjo exige um ambiente com iluminação mínima para evitar a degradação fotossensível do corante fluorescente SI três utilizado na marcação. Para iniciar a marcação do CD NA com o SI três, prepare os seguintes componentes do sistema de marcação genômica CGH BioPrime Array: tampão de iniciadores aleatórios 2,5 x, mistura 10 X-D-C-T-P e água livre de nucleases. Além disso, descongele o estoque de 1 milimolar de DCTP marcado com SI três. Após o descongelamento, centrifugue brevemente os reagentes em um tubo de parede espessa de 0,6 mililitro.
500 nanogramas de cDNA, 40 microlitros, 2,5 x tampão de iniciador aleatório e água livre de nucleases para atingir um volume total de 86 microlitros. Misture bem e centrifugue brevemente, em seguida incube a reação a cem graus Celsius em um termociclador por cinco minutos. Ao final da incubação, transfira imediatamente a reação para uma suspensão em banho de gelo por 10 minutos.
Em seguida, retire a polimerase exo do congelador e coloque no gelo. Em seguida, adicione ao tubo de reação 10 microlitros da mistura 10 X-D-C-T-P, dois microlitros do SI 3D CTP 1 milimolar e dois microlitros da polimerase XO cleanout DNA, misture bem e centrifugue brevemente. Por fim, incube a reação a 37 graus Celsius por 16 horas em um termociclador quando a marcação estiver concluída.
Prossiga para a limpeza e precipitação do cDNA marcado. Para iniciar a limpeza do cDNA marcado, coloque uma coluna MicroCon em um tubo de 1,5 mililitro.
Adicione 300 microlitros de 0,1 XSSC à coluna e, em seguida, adicione a reação de marcação. Centrifugue a coluna a 16.100 ×g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Observe que o fluxo residual pode apresentar uma coloração rosa clara.
Descarte o eluato e adicione outros 300 microlitros de nought 0,1 XSSE à coluna. Em seguida, repita a centrifugação a 16.100 ×g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Novamente, descarte o eluato e adicione mais 300 microlitros de T 0,1 XSSC à coluna; agora, centrifugue a 16.100 ×g por 12 minutos a quatro graus Celsius após esta última lavagem.
O fluxo que passa deve estar claro e o cDNA marcado em rosa visível na coluna. Novamente, descarte o fluxo que passa dessa lavagem final para evitar o cDNA marcado. Adicione 100 microlitros de água livre de nucleases à coluna. Retire a coluna do tubo de microcentrífuga e vire-a invertida para um novo tubo.
Em seguida, centrifugue a coluna invertida a 2.300 ×g por dois minutos a quatro graus Celsius. O cDNA marcado é dissolvido na água na parte inferior do tubo. Verifique o cDNA obtido utilizando um espectrofotômetro NanoDrop ND 1000 de acordo com as instruções do fabricante.
Calcule a concentração de DNA e avalie a incorporação do corante conforme descrito no protocolo escrito acompanhante. Se o cDNA estiver suficientemente marcado, coloque seis microgramas em um novo tubo para precipitar a mistura de cDNA marcado com 0,1 x volume de acetato de sódio trimolar com pH 5,2 e um volume de isopropanol, incubando ao abrigo da luz por 30 minutos à temperatura ambiente.
Tendo em mente que todas as etapas até este ponto foram realizadas em ambiente com luz mínima. Em seguida, centrifugue a amostra a 16.100 ×g por 20 minutos à temperatura ambiente. Após a centrifugação, descarte cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet de DNA, que é rosa.
Por fim, lavar adicionando 500 microlitros de etanol a 70% e misturar por inversão suave em centrífuga a 16.100 ×g durante cinco minutos. À temperatura ambiente, remover o sobrenadante, inverter o tubo e deixar o pellet secar por cinco minutos. O cDNA marcado está pronto para hibridização.
Antes de iniciar a hibridização, ligue o sistema de hibridização NimbleGen e deixe-o equilibrar a 42 graus Celsius. Comece dissolvendo o pellet de DNA marcado em cinco microlitros de água livre de nucleases. Adicione os componentes de hibridização do kit de Hibridização Roche NimbleGen — tampão de hibridização, hibridização A e oligo de alinhamento — até um volume total de 18 microlitros, conforme descrito no protocolo escrito anexo.
Misture bem e gire brevemente o tubo para recolher o conteúdo no fundo. Em seguida, desnature o cDNA marcado colocando o tubo a 95 graus Celsius por cinco minutos. Transfira imediatamente o tubo para o sistema de hibridização NimbleGen até que os arranjos estejam prontos.
Observe que as microarranjos exigem manuseio e armazenamento cuidadosos. Os arranjos Roche NimbleGen são armazenados ao abrigo da luz, com dessecante, em temperatura ambiente. Carregue o arranjo na ferramenta de alinhamento do misturador de precisão.
Carregue a carga de PMA T no misturador X no PMA T e remova a fita adesiva com pinça. Com o arranjo e o misturador carregados, feche o PMA T com segurança. Em seguida, desacople o arranjo e o misturador do PMA T aplicando pressão no misturador através do orifício no PMA t.
Por fim, use um rolo para aplicar pressão ao redor da parte externa do misturador, a fim de garantir que o arranjo esteja selado e remover quaisquer bolhas. Em seguida, coloque o conjunto do misturador sobre o sistema de hibridização para aquecer e carregar a amostra de cDNA no arranjo. Use o deslocamento progressivo de forma lenta e com pressão constante.
Adicione 15 microlitros da amostra marcada no orifício de preenchimento no centro do misturador. Remova qualquer excesso de amostra dos orifícios e selle-os com tiras adesivas. Em seguida, feche a trava.
Agora, inicie a mistura da solução de hibridização utilizando o programa B no sistema de hibridização nimble gen. Deixe a microplaca hibridizar por 16 a 20 horas. Após a hibridização, a microplaca será lavada e escaneada quando a hibridização estiver quase concluída. Prepare-se para o escaneamento ligando o scanner de matriz gene picks 4,000 B e deixe-o aquecer por cerca de 15 minutos.
Em seguida, prepare os tampões de lavagem um A, um B dois e três conforme descrito no protocolo escrito em anexo. Pré-aqueça o tampão de lavagem um A a 42 graus Celsius, mas mantenha os outros tampões em temperatura ambiente. Quando o tampão de lavagem um A estiver aquecido, despeje-o em um recipiente.
Mergulhe um porta-objetos em tampão de lavagem um B. Agora remova o complexo do misturador de matriz do sistema de hibridização nimble gen e deslize-o para dentro do gabarito. Inicie a lavagem mergulhando o conjunto no tampão de lavagem pré-aquecido um A e remova cuidadosamente o misturador descolando-o do porta-objetos. Em seguida, remova a matriz do gabarito e agite por 15 segundos no tampão de lavagem um A. Transfira rapidamente a matriz para um porta-objetos submerso no tampão de lavagem um B e agite o porta-objetos vigorosamente por dois minutos.
Em seguida, transfira a grade de lâminas para o tampão de lavagem dois e agite por um minuto. Por fim, transfira a grade de lâminas para o tampão de lavagem três e agite por 15 segundos. Conclua as lavagens transferindo o arranjo para a centrífuga de secagem de lâminas e gire por dois minutos após a centrifugação.
Analise imediatamente a matriz, pois o D é sensível à luz e ao ozônio; inicie a digitalização carregando o código de barras da matriz para baixo no leitor de matriz gene picks 4,000 B. Na caixa de diálogo de configurações de hardware, defina o laser de 532 nanômetros com valor de PMT em 500, ajuste a potência para 100%, o tamanho do pixel para cinco mícrons, o número de linhas para média em um e a posição de foco em zero mícron. Quando a configuração estiver concluída, visualize previamente a matriz.
Escolha uma área para digitalizar e, em seguida, digitalize-a. Após a conclusão da digitalização, verifique o histograma da imagem. Idealmente, uma contagem normalizada de E menos cinco deve estar em 65.000, limite de saturação, o que significa que aproximadamente de 1 a 2% das características estão saturadas.
Se as contagens normalizadas forem inferiores a um E menos cinco, aumente o ganho do PMT e reescaneie a lâmina. Se as contagens normalizadas forem superiores a um E menos cinco, diminua o ganho do PMT, reescaneie a lâmina, salve a imagem e utilize um programa de análise de dados para normalização dos dados e cálculo dos valores de intensidade. A reação de marcação normalmente produz pelo menos 10 microgramas de cDNA marcado.
A incorporação do corante pode ser calculada usando uma simples razão básica de corante, na qual a razão de nucleotídeo para SI três equivale à razão de A 260 para A 550 multiplicada por 23,15. Uma boa reação resultará em um valor entre 50 e 80. Uma hibridização aceitável apresentará de 1 a 2% das características saturadas, resultando nisso.
Uma E menos cinco contagens normalizadas no limite de saturação de 65.000. Com o valor do PMT ajustado, a qualidade da hibridização também pode ser avaliada qualitativamente mediante a visualização da imagem escaneada do micromatriz e a avaliação da intensidade dos oligos alinhados em relação a outras características na matriz. A imagem escaneada também deve ser avaliada quanto à presença de manchas particulares ou de poeira dentro da área da matriz.
Na análise subsequente, um gráfico de dispersão pode ser usado para representar visualmente seus dados analisados, a fim de determinar os níveis relativos de expressão gênica nas amostras e identificar genes que são diferencialmente expressos. Genes que são diferencialmente expressos desviar-se-ão significativamente da linha de melhor ajuste em um procedimento complementar. Mostramos a você como extrair RNA de embriões de peixe-zebra para sintetizar cDNA. Aqui, apenas mostramos como rotular e hibridar o cDNA em uma plataforma de micromatriz de oligonucleotídeos para estudar perfis globais de expressão gênica.
Ao realizar este procedimento, lembre-se sempre de usar ADN de alta qualidade e evite expor o corante SYBR Green a luz direta. É isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.
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Visão Geral
Este artigo demonstra o processo de análise da expressão gênica global utilizando uma plataforma de microarranjo de oligonucleotídeos específica para peixe-zebra. O protocolo abrange a marcação fluorescente de cDNA, hibridização ao microarranjo e escaneamento para aquisição de sinal, permitindo aos pesquisadores perfilar quantitativamente os níveis de transcritos em escala genômica em amostras de peixe-zebra.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Genômica
- Biologia Molecular
- Análise de Expressão Gênica
- Transcriptômica
Contexto
- A tecnologia de microarranjo gênico permite a medição quantitativa da expressão gênica em todo o genoma.
- É amplamente utilizada para estudar alterações na expressão gênica relacionadas ao desenvolvimento, doenças e respostas toxicológicas.
- A plataforma de microarranjo de peixe-zebra investiga mais de 37.000 alvos com cobertura abrangente do transcriptoma.
- Dados de múltiplos bancos genômicos foram utilizados para projetar o arranjo, garantindo ampla aplicabilidade para pesquisas com peixe-zebra.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar um protocolo robusto para marcação e hibridização de cDNA em um microarranjo de oligonucleotídeos de peixe-zebra.
- Permitir o perfilamento global da expressão gênica em peixe-zebra, particularmente em resposta a exposições ambientais ou tóxicas.
- Fornecer etapas detalhadas para que pesquisadores possam replicar o processo e obter dados de alta qualidade sobre expressão gênica.
Métodos Utilizados
- Síntese de cDNA a partir de RNA de alta qualidade extraído de embriões de peixe-zebra.
- Marcação fluorescente de cDNA utilizando corante Cy3 e um sistema de marcação genômico.
- Purificação e avaliação da qualidade do cDNA marcado, incluindo verificações da incorporação do corante.
- Hibridização do cDNA marcado ao microarranjo em condições controladas.
- Lavagem pós-hibridização e digitalização do arranjo utilizando um escâner de microarranjos.
- Normalização e análise de dados para determinar os níveis relativos de expressão gênica.
Resultados Principais
- O protocolo produz pelo menos 10 microgramas de cDNA marcado adequado para hibridização.
- Obtém-se incorporação ideal de corante, com uma razão entre nucleotídeo e Cy3 entre 50 e 80.
- A hibridização de alta qualidade é indicada por saturação de características de 1–2% e intensidade de sinal apropriada.
- As imagens digitalizadas e a análise de dados permitem a identificação de genes diferencialmente expressos em amostras de peixe-zebra.
Conclusões
- O protocolo descrito permite um perfil confiável e reprodutível da expressão gênica global em peixe-zebra.
- O manuseio cuidadoso de corantes fluorescentes e a obtenção de cDNA de alta qualidade são fundamentais para resultados bem-sucedidos.
- Este método sustenta diversas aplicações em biologia do desenvolvimento, toxicologia e pesquisa de doenças utilizando modelos de peixe-zebra.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A análise global da expressão gênica utilizando microarranjos de oligonucleotídeos de peixe-zebra permite a redução de riscos mecanicistas na fase inicial de descoberta, fornecendo perfis transcriptômicos em todo o genoma. Esta abordagem auxilia na validação de alvos e na triagem fenotípica em aplicações de toxicologia e biologia do desenvolvimento. A plataforma fornece dados quantitativos e reprodutíveis que informam o grau de confiança preditiva para a identificação de compostos promissores e decisões de triagem de portfólio.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Analisa hipóteses terapêuticas por meio de perfis de expressão em todo o genoma para esclarecer o envolvimento de vias e mecanismos biológicos.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional de alvos ao identificar genes diferencialmente expressos em resposta à exposição a agentes tóxicos ou modelos de doenças.
- Valor Preditivo: Apoia a confiança preditiva e a triagem de portfólios ao revelar insights mecanicistas que reduzem os riscos na seleção de alvos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para triagem subsequente, estabelecendo perfis de expressão de referência em modelos de peixe-zebra.
- Valor Operacional: Fornece saídas padronizadas e quantitativas com alta reprodutibilidade, graças ao design robusto das sondas e controles de normalização.
- Prontidão para Triagem: Permite avaliação confiável de compostos por meio de fluxos de trabalho escaláveis e reutilizáveis em plataformas compatíveis com sistemas automatizados de hibridização e leitura.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Conecta descobertas científicas à validação pré-clínica, mantendo padrões de expressão relevantes para a doença em diferentes sistemas modelo.
- Alinhamento de Biomarcadores: Apoia a descoberta de biomarcadores translacionais por meio de leituras transcricionais consistentes que se correlacionam com desfechos fenotípicos.
- Avanço com Ajuste de Risco: Orienta decisões de prosseguimento ou interrupção do desenvolvimento ao fornecer sinais baseados em expressão gênica relacionados à segurança e eficácia já nos estágios iniciais da pesquisa.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se ao continuum de descoberta, desde a testagem da hipótese do alvo até a identificação de compostos líderes e a validação pré-clínica, permitindo o aperfeiçoamento iterativo do entendimento biológico.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias ao detectar alterações na expressão em todo o transcriptoma em resposta a perturbações.
- Triagem: Garante a prontidão do ensaio por meio de protocolos padronizados de marcação, hibridização e varredura que geram valores de intensidade reprodutíveis.
- Análises: Gera dados normalizados de contagem e valores de intensidade que permitem comparação estatística entre condições e identificação de características diferencialmente expressas.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao preservar assinaturas transcriptômicas específicas de peixe-zebra relevantes para vias de doenças humanas.
- Reutilização Corporativa: Funciona como uma capacidade reutilizável em diversos projetos devido ao design padronizado da matriz, química de marcação e parâmetros de varredura.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Fornece confiança preditiva por meio da redução de riscos mecanicistas e da diminuição da ambiguidade biológica na seleção de alvos.
- Valor Operacional: Garante padronização, reprodutibilidade e escalabilidade por meio de etapas validadas de marcação, hibridização e controle de qualidade.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou não prosseguir, a eficiência do capital e reduz riscos biológicos em estágios avançados ao fornecer insights precoces baseados em expressão.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco e decisões de avanço com base em perfis de expressão em todo o genoma e análise diferencial.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em biologia molecular, marcação de ácidos nucleicos e manipulação de microarranjos para garantir a integridade dos dados.
- Depende de instrumentação especializada, incluindo termocicladores, sistemas de hibridização de microarranjos e escâneres a laser para detecção de sinal.
- Necessita padronização entre equipes dos limiares de eficiência de marcação, protocolos de lavagem e configurações de ganho do PMT para resultados consistentes.
- Envolve considerações de adaptação ao aplicar a plataforma a diferentes linhagens de peixe-zebra, estágios de desenvolvimento ou condições de exposição.
- Inclui limitações práticas, como a sensibilidade à luz de corantes fluorescentes e a necessidade de otimizar as quantidades de cDNA e as proporções de incorporação de corantes.
