Análise da expressão global de Gene usando uma plataforma Microarray Zebrafish Oligonucleotide

Este procedimento começa com o CDNA que foi sintetizado a partir de um modelo de RNA de alta qualidade. O CDNA é primeiro marcado com o corante fluorescente SI três. Após a conclusão da reação de marcação, o CDNA marcado é purificado, isolado e a qualidade da reação de marcação avaliada.

O CDNA rotulado é então hibridizado em um microarray. Após a hibridização, as matrizes são analisadas para determinar os níveis relativos de expressão gênica nas amostras. Olá, meu nome é Sam Peterson, do laboratório da Dra. Jennifer Freeman na Escola de Ciências da Saúde da Universidade de Purdue.

Anteriormente, mostramos como extrair RNA de embriões de peixe-zebra e transformar esse RNA em CDNA. Hoje mostraremos o procedimento para rotular e hibridizar esse CDNA em uma plataforma de microarray de oligonucleotídeos de peixe-zebra para estudar perfis globais de expressão gênica. Normalmente, usamos esse procedimento para estudar a expressão gênica diferencial em resposta a uma exposição a uma toxina.

Então vamos começar. O experimento de microarray requer um ambiente de luz mínima para evitar a fotodegradação do corante fluorescente SI três usado na rotulagem para começar a rotular o CD NA com sci três haw os seguintes componentes do sistema de rotulagem genômica CGH de matriz bio prime 2,5 x tampão de primer aleatório, mistura de 10 X-D-C-T-P e água livre de nuclease. Além disso, descongele o estoque milimolar do SI três marcado DCTP após o descongelamento, centrifugue brevemente ou reagentes em um tubo de parede de 0,6 mililitro de espessura combinado.

500 nanogramas de CDNA 40 microlitros, 2,5 x tampão de primer aleatório e água livre de nuclease para atingir um volume total de 86 microlitros. Misture bem e centrifugue brevemente, depois incube a reação a cem graus Celsius em um termociclador por cinco minutos. No final da incubação, transfira imediatamente a reação para uma pasta de banho de gelo por 10 minutos.

Em seguida, retire a exo DNA polimerase do freezer e coloque no gelo. Em seguida, adicione ao tubo de reação, 10 microlitros dos 10 X-D-C-T-P Misture dois microlitros de um milimolar SI 3D CTP e dois microlitros da DNA polimerase de limpeza XO bem misturados e centrifugue brevemente. Por fim, incubar a reação a 37 graus Celsius por 16 horas e um termociclador quando a rotulagem for concluída.

Prossiga para limpar e precipitar o CDNA rotulado. Para começar a limpar o CDNA rotulado. Coloque uma coluna MicroCon em um tubo de 1,5 mililitro.

Adicione 300 microlitros zero 0,1 XSSC à coluna e, em seguida, adicione a reação de rotulagem. Centrifugar a coluna a 16, 100 G durante 10 minutos a quatro graus SIU. Observe que o fluxo pode ser rosa claro.

Descarte o fluxo e adicione mais 300 microlitros de zero 0,1 XSSE à coluna. Em seguida, repita a centrifugação a 16.100 G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Novamente, descarte o fluxo e adicione mais 300 microlitros T 0,1 XSSC à coluna agora centrifugue a 16, 100 G por 12 minutos a quatro graus Celsius após esta última lavagem.

O fluxo deve ser claro e o CDNA rotulado em rosa é visível na coluna. Novamente, descarte o fluxo desta lavagem final para iludir o CD NA rotulado. Adicione 100 microlitros de água livre de nuclease à coluna. Retire a coluna do tubo da microcentrífuga e inverta em um novo tubo.

Em seguida, centrifugue a coluna invertida a 2.300 g por dois minutos a quatro graus Celsius. O CDNA rotulado é dissolvido na água no fundo do tubo. Verifique o CDNA aludido usando um espectrofotômetro NanoDrop ND 1000 de acordo com as instruções do fabricante.

Calcule a concentração de DNA e avalie a incorporação do corante conforme descrito no protocolo escrito que acompanha. Se o CDNA estiver suficientemente marcado, coloque seis microgramas em um novo tubo para precipitar a mistura de CD NA marcada em naut 0,1 x volume de acetato de sódio de três molares a pH 5,2 e um x volume. Isopropanol incubando no escuro por 30 minutos em temperatura ambiente.

Tendo em mente que todas as etapas até este ponto foram realizadas em um ambiente com pouca luz. Em seguida, centrifugue a amostra a 16, 100 g por 20 minutos à temperatura ambiente. Após a centrifugação, descarte cuidadosamente o SUP

Finalmente lavado adicionando 500 microlitros, 70% de etanol e misturado por centrífuga de inversão suave a 16, 100 G por cinco minutos. À temperatura ambiente, remova o supinato, inverta o tubo e deixe o pellet secar por cinco minutos. O CDNA rotulado está pronto para hibridização.

Antes de iniciar a hibridização, ligue o sistema de hibridização de gen ágil e deixe-o equilibrar a 42 graus Celsius. Comece dissolvendo o pellet de CD NA marcado em cinco microlitros de água livre de nuclease para o pellet dissolvido. Adicione componentes de hibridização do kit de hibridização Roche Nimble Gen Híbrido de hibridização A e oligo de alinhamento a um volume total de 18 microlitros, conforme descrito no protocolo escrito que acompanha.

Misture bem e gire brevemente o tubo para coletar o conteúdo na parte inferior. Em seguida, desnature, o CDNA rotulado, colocando o tubo a 95 graus Celsius por cinco minutos. Transfira imediatamente o tubo para o sistema de hibridização de geração ágil até que as matrizes estejam prontas.

Observe que os microarrays requerem manuseio e armazenamento cuidadosos. As matrizes de geração ágil da Roche são armazenadas no escuro com dessecante em temperatura ambiente. Carregue a matriz na ferramenta de alinhamento do misturador de precisão.

O PMA T carrega em X um misturador no PMA T e remove a fita adesiva com uma pinça. Com a matriz e o mixer carregados, feche o PMA T com segurança. Em seguida, desengate a matriz e o misturador do PMA T aplicando pressão ao misturador através do orifício no PMA t.

Por fim, use um brayer para aplicar pressão ao redor da parte externa do misturador para garantir que a matriz esteja selada e remover quaisquer bolhas. Em seguida, coloque o complexo do mixer da matriz no sistema de hibridização para aquecer, para carregar a amostra de CDNA na matriz. Use o perpet de deslocamento lentamente e com pressão constante.

Adicione 15 microlitros da amostra rotulada na porta de enchimento no centro do misturador. Limpe qualquer excesso de sample dos orifícios da porta e sele-os com tiras adesivas. Em seguida, feche a trava.

Agora comece a misturar a solução de hibridização usando o programa B no sistema de hibridização de geração ágil. Permita que o microarray hibridize por 16 a 20 horas Após a hibridização, o microarray será lavado e escaneado quando a hibridização estiver quase concluída. Prepare-se para a varredura ligando o scanner de matriz gene picks 4.000 B e deixe-o aquecer por cerca de 15 minutos.

Em seguida, prepare os tampões de lavagem um A, um B dois e três, conforme descrito no protocolo escrito que acompanha. O tampão de lavagem pré-guerra de um A a 42 graus Celsius, mas deixa os outros amortecedores em temperatura ambiente. Quando o tampão de lavagem um A estiver aquecido, despeje-o em um prato.

Mergulhe um rack de slides no tampão de lavagem um B.Agora remova o complexo do misturador de matriz do sistema de hibridização de geração ágil e deslize para dentro do gabarito. Comece a lavagem submergindo o conjunto no tampão de lavagem pré-aquecido um A e remova cuidadosamente o misturador retirando-o da corrediça. Em seguida, remova a matriz do gabarito e agite por 15 segundos no tampão de lavagem um A.Transfira rapidamente a matriz para um suporte de lâminas submerso no tampão de lavagem um B e agite vigorosamente o suporte de slides por dois minutos.

Em seguida, transfira o rack deslizante para o tampão de lavagem dois e agite por um minuto. Por fim, transfira o rack deslizante para o tampão de lavagem três e agite por 15 segundos. Termine as arruelas transferindo a matriz para a centrífuga de secagem de lâminas e gire por dois minutos após a centrifugação.

Digitalize a matriz imediatamente, pois o D é sensível à luz e ao ozônio, inicie a varredura carregando o código de barras da matriz no scanner de matriz 4.000 B. No conjunto de caixas de diálogo de configuração de hardware, o laser de 532 nanômetros tem um valor PMT definido em 500, defina a potência para 100% do tamanho do pixel para cinco mícrons, as linhas para a média para um e a posição do foco para zero mícrons. Quando a configuração estiver concluída, visualize a matriz.

Escolha uma área para digitalizar e, em seguida, digitalize-a. Quando a digitalização estiver concluída, verifique o histograma da imagem. Idealmente, uma contagem normalizada de E menos cinco deve estar no limite de saturação de 65.000, o que significa que aproximadamente um a 2% dos recursos estão saturados.

Se as contagens normalizadas forem menores que um E menos cinco, aumente o ganho de PMT e verifique novamente o slide. Se as contagens normalizadas forem maiores que um E menos cinco, diminua o ganho de PMT e digitalize novamente o slide, salve a imagem e use um programa de análise de dados para normalização de dados e cálculo de valores de intensidade. A reação de marcação rotineiramente produz pelo menos 10 microgramas de CDNA marcado.

A incorporação do corante pode ser calculada usando uma proporção de corante de base simples, onde a proporção de nucleotídeos para SI três é igual a A dois 60 para uma proporção de cinco 50 multiplicada por 23 vírgula 15. Uma boa reação resultará em um valor entre 50 e 80. Uma hibridização aceitável terá de um a 2% das características saturadas de rendimento.

Um E menos cinco contagens normalizadas no limite de saturação de 65.000. Com o valor PMT definido, a qualidade de hibridização próxima de 500 também pode ser avaliada qualitativamente visualizando a imagem digitalizada do microarray e avaliando a intensidade dos oligos alinhados com outros recursos na matriz. A imagem digitalizada também deve ser avaliada quanto a quaisquer pontos específicos ou de poeira dentro da área da matriz.

Na análise subsequente, um gráfico de dispersão pode ser usado para criar imagens de seus dados de análise para determinar os níveis relativos de expressão gênica nas amostras e identificar genes que são expressos diferencialmente. Os genes que são expressos diferencialmente se desviarão significativamente da linha de melhor ajuste em um procedimento complementar. Mostramos como extrair RNA de embriões de peixe-zebra para sintetizar c CD NA. Aqui, mostramos como rotular e hibridizar CD NA em uma plataforma de microraios de oligonucleotídeos para estudar perfis globais de expressão gênica.

Ao fazer este procedimento, lembre-se sempre de usar CD NA de alta qualidade e evite expor o local três corantes à iluminação direta. Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.