Desnaturação Uréia Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (PAGE Urea)

Em geral, esse tipo de gel é necessário para separar fragmentos de DNA ou RNA de fita simples, como oligonucleotídeos ou produtos sintetizados ou marcados, de reações de clivagem enzimática. A faixa de separação depende da concentração de poliamida, urina em combinação com denas de calor para amostra e moléculas de fita simples migram dentro da matriz de gel de acordo com seu peso molecular. Este vídeo apresenta o vazamento, execução e processamento de um gel típico.

Olá, meu nome é Haki. Estou na Universidade Tecnológica de Nang. Nesta demonstração, mostrarei como realizar uma eletroforese em gel poli desnaturante.

Use placas de vidro limpas e monte o sanduíche de gel de acordo com a descrição do fabricante. Fixe o gel na câmara padrão de fundição em gel. Ize as placas de vidro de géis grandes se o gel tende a grudar nas placas de vidro.

Escolha um tamanho e espessura de gel de acordo com seus requisitos de separação. Prepare a solução de gel. De acordo com os protocolos atuais em biologia molecular.

Escolha uma concentração de poliamida que atenda às suas necessidades de separação. Melhor porcentagem mais alta de acrilamida resolverá fragmentos de menor peso molecular. Use Alta UIA puro e misturado com a quantidade desejada de poliacrilamida em um copo ou garrafa.

Adicione 10 tampão XTBE à solução e encha até o volume necessário com água. Aqueça a solução por 20 segundos no micro-ondas e misture delicadamente até que todo o UIA esteja dissolvido. Você pode armazenar a solução, se necessário, para volumes maiores de gel.

Repita a etapa de micro-ondas até que a solução esteja quente à mão. Evite aquecer muito a solução. Não superaqueça porque a urina começará a se degradar após 60 graus.

Os centígrados podem ser detectados pelo cheiro de amônia. Quando a solução estiver límpida e esfriar até a temperatura ambiente, adicione um PS e tamid à solução de gel e misture suavemente. Se a solução de gel estiver muito quente, o gel irá polimerizar dentro da pipeta.

Despeje o gel usando uma pipeta sorológica e, em seguida, o auxiliar de pipeta entre as duas placas de vidro. Evite introduzir bolhas de ar. Insira o tecom com cuidado.

Tente não prender bolhas de ar e deixe o gel polimerizar por 30 a 60 minutos. Desmonte o gel do suporte de fundição e monte-o na câmara tampão superior. De acordo com o protocolo do fabricante, coloque o gel na câmara tampão inferior e encha o reservatório inferior com tampão de gel, que normalmente é de 0,5 a um XTBE.

Com a mesma concentração do gel, encha a câmara tampão superior com tampão de gel até a borda da placa de vidro. Antes de carregar suas amostras, você deve pré-executar o gel por pelo menos 30 minutos para aquecer o gel e remover o ure. A temperatura ideal deve estar entre 45 a 55 graus centígrados, como para a corrida de gel real.

Evite temperaturas superiores a 60 graus, pois as bandas podem manchar ou as placas de vidro podem rachar com cuidado. Remova a calma sem perturbar as bordas e enxágue os poços para remover o que vazou para dentro deles. Use pontas de carregamento de gel e canalize-o para cima e para baixo várias vezes.

Para cada um, conecte bem a tampa do sistema de gel e conecte os cabos a uma fonte de alimentação de alta tensão. Escolha watts constantes para a pré-corrida, cerca de 15 a 20 watts por gel. Quando a fonte de alimentação é ligada, bolhas de ar indicam boa condutividade.

Enquanto isso, prepare suas amostras, portanto, na quantidade apropriada de dois x carga de gel para sua amostra. Quando a pré-corrida terminar, remova a tampa e Lave bem o bolso conforme descrito anteriormente, é muito importante enxaguar cuidadosamente os bolsos de gel. Para remover resíduos de urina, pois a urina formará uma camada densa que impede a amostra de entrar no gel.

Bem diante de você. Aplique sua natureza de aquecimento de amostra, sua amostra incubando-a a pelo menos 70 graus centígrados por vários minutos. Aplique as amostras cuidadosamente do fundo do bolso.

Para algumas aplicações, o corante interfere na amostra e pode causar bandas difusas, ou o corante mostra o sinal fluorescente. Em seguida, é útil remover um corante ou todos os corantes e carregar o corante padrão contendo tampão. Em um poço vazio, um padrão de tamanho, a quantidade de amostra que você deve carregar para bandas afiadas é idealmente entre um a cinco microlitros, mas você também pode carregar volumes maiores de até 15 microlitros.

Menos volume de amostra resulta em bandas mais agradáveis. Evite introduzir bolhas de ar e deixe a amostra afundar no bolso lentamente para formar uma camada unificada. Se você usar uma etiqueta fluorescente, embale o sistema de gel em queda de alumínio para evitar a exposição à luz, o que pode causar fotobranqueamento de sua amostra.

Monte a tampa e ligue a fonte de alimentação. Execute o gel até que a frente DIA atinja a extremidade inferior do gel. A duração da execução depende da porcentagem de acrilamida.

Você escolhe a força iion da espessura e comprimento do gel tampão. Uma corrida pode durar de uma a várias horas. Observe a migração do comercializado para determinar a duração do eletrocongelamento.

Use watts constantes e verifique a temperatura no gel. Um termômetro de gel pode ajudar a monitorar a temperatura certa durante a corrida ou verificar o manual do aparelho de gel quando o dron chegar ao fim. Desligue a fonte de alimentação e remova a tampa do aparelho de gel.

Em seguida, coloque o sanduíche de gel para fora da câmara tampão inferior. Despeje o tampão da câmara tampão superior. Encha um prato com solução de fixação em gel.

Esta solução deve ter a mesma concentração de TB e entre cinco a 10% de metanol e ácido estético. Remova o sanduíche de gel do aparelho e solte os grampos. Retire os espaçadores e desmonte cuidadosamente as placas de vidro usando uma espátula Se necessário, corte o pesador em um poço contendo parte de gel ou a parte inferior vazia de gel e descarte os pedaços de gel desnecessários como faixas contendo corante.

Para amostras fluorescentes, retire cuidadosamente o gel da placa de vidro e transfira-o para um prato cheio de solução de fixação de gel. Deixe o gel na solução por cinco a 10 minutos e troque o tampão duas vezes. Aplique suavemente o prato para lavar o ure do gel ou coloque o gel em solução de coloração, dependendo da sua aplicação.

A qualidade do gel também depende da espessura do gel. Géis mais finos, como 0,75 milímetro, mostram melhores resultados do que géis de 1,5 milímetro de espessura, mas são mais difíceis de manusear. A nitidez das bandas depende de vários fatores.

A baixa tensão no início da execução pode ajudar a obter bandas mais agradáveis, assim como a amostra entra na frente do gel suavemente, e isso evita que as bolsas de gel entrem em colapso devido à alta tensão. Um gel de empilhamento de acrilamida curto e de baixa porcentagem pode ter o mesmo efeito de nitidez da banda, incluindo 10% de glicerol também ajuda durante o carregamento do gel e a amostra afunda no poço. Aplique mais facilmente o buffer de carregamento em bolsos vazios para manter condições iguais durante a corrida.

Quando o gel estiver em solução de fixação, você pode secá-lo usando um secador de gel a vácuo para obter mais imagens ou escanear o gel diretamente, dependendo do rótulo da coxa ou da mancha que estiver usando. Esta página U é útil para analisar ou isolar amostras de DNA ou RNA de fita simples. Os géis podem ser armazenados em temperatura ambiente.

Portanto, embrulhe o gel em papel toalha e mergulhe-o em água ou tampão corrente. Coloque o gel embrulhado e úmido em um saco plástico de nível de vedação e use-o dentro de 48 horas. Um problema frequentemente observado é o sorriso em gel.

Isso se deve à distribuição desigual de calor através do gel. Se o gel não estiver cercado por tampão, a fixação de uma placa de metal pode aumentar a qualidade do gel. Olá, sou Hi Kasam.

Estou na Universidade Tecnológica N Yang. Mostrei como realizar uma desnaturação da férese Polymeal. Até a próxima.