Name: Desnaturação Uréia Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (PAGE Urea) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-29T07:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Aprenda a realizar eletroforese em gel de poliacrilamida com uréia desnaturante para separar DNA ou RNA fita simples. Este método é essencial para análise de oligonucleotídeos em biologia molecular.

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Este trabalho foi financiado pela Academic Singapura Research Council (ARC) [número de concessão 90/07]. Agradecemos pelo apoio radiodurans.

O protocolo de texto completo e detalhado para este procedimento experimental está disponível em protocolos atuais em Biologia Molecular. Detalhadas passo-a-passo as instruções para a montagem do sanduíche de gel e gel para os aparelhos podem ser encontrados no site da BioRad 3. Equipamentos necessários: Placas de vidro (interno e externo) 10 células cm: 10,1 x 7.3 cm (placa interna), 10,1 x 8,2 cm (placa externa), BioRad 20 celulares cm: 20 x 20 cm (placa interna), 20 x 22,3 cm (placa externa), BioRad 0,5-1,5 mm comb gel e espaçadores Gel ficar fundição Aparelho de gel com tampa e cabos Fonte de alimentação de alta tensão Bloco de aquecimento ou água do banho Pipetas sorológicas e auxílio de pipeta Pipeta e Pontas de pipeta Secador de gel ou scanner Reagentes e Soluções: Uréia (ultrapura) Solução de poliacrilamida 40% (29:1) 10 x TBE solução (Tris-Borato, EDTA buffer) Água, deionizada Temed 30% (w / v) de persulfato de amônio 0,5 x solução TBE Formamida EDTA Cyanol xileno Azul de bromofenol Metanol Etanol <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Volume </td><td colspan="3" style="text-align:center;"> 50 ml </td><td colspan="3" style="text-align:center;"> 60 ml </td><td colspan="3" style="text-align:center;"> 10 ml </td></tr><tr><td> Concentração de acrilamida </td><td> 10% </td><td> 12,5% </td><td> 15% </td><td> 10% </td><td> 12,5% </td><td> 15% </td><td> 10% </td><td> 12,5% </td><td> 15% </td></tr><tr><td> g UREA </td><td> 24 </td><td> 24 </td><td> 24 </td><td> 28,8 </td><td> 28,8 </td><td> 28,8 </td><td> 4,8 </td><td> 4,8 </td><td> 4,8 </td></tr><tr><td> ml Acryl 40% (29:1) </td><td> 12,5 </td><td> 15,625 </td><td> 18,75 </td><td> 15 </td><td> 18,75 </td><td> 22,5 </td><td> 2,5 </td><td> 3,125 </td><td> 3,75 </td></tr><tr><td> ul APS 30% </td><td> 166 </td><td> 166 </td><td> 166 </td><td> 199,2 </td><td> 199,2 </td><td> 199,2 </td><td> 33 </td><td> 33 </td><td> 33 </td></tr><tr><td> ul Temed </td><td> 20 </td><td> 20 </td><td> 20 </td><td> 24 </td><td> 24 </td><td> 24 </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> 10 x TBE </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 6 </td><td> 6 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td colspan="10"> Encher o volume com água, deionizada </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Reagentes e soluções necessárias para as concentrações de acrilamida vários volumes e para resolver único oligonucleotides encalhado Gel de montagem sanduíche e gel preparação <ol><li> Montar o gel de acordo com a descrição dos fabricantes e corrigir o gel na câmara de gel-casting 3. Use 0,5-1,5 mm espaçadores de espessura. </li><li> Prepare a solução de poliacrilamida apropriado de acordo com protocolos atuais em biologia molecular ou como listadas na Tabela 1. Por um gel de acrilamida desnaturante de 20 cm x 22 cm x 1,5 mm, 60 ml de solução de gel e por um 10,1 x 8,2 cm x 1 mm gel 5 ml solução de gel é suficiente. Géis maiores são usados ​​quando os produtos esperados / bandas estão dentro da faixa de algumas bases, em seguida, um gel mais irá resolver bandas com uma diferença de um único nucleotídeo. Se as bandas esperados diferem em mais de 10 nucleotídeos, géis menores serão adequados para resolver os fragmentos. Escolha o percentual de poliacrilamida que se adapte às suas necessidades de separação, uma maior concentração de poliacrilamida resolverá menor fragmentos de peso molecular. Use uréia ultrapura e misture com a quantidade desejada de acrilamida. Adicionar tampão TBE à mistura gel para obter uma concentração final de 0,5-1 x TBE e encher o volume com água, deionizada. Aquecer a solução por 20 segundos no microondas e misture delicadamente. Para volumes maiores gel repita este passo até que a solução é a mão quente. </li><li> Despeje o gel imediatamente, usando uma pipeta sorológica e um auxílio de pipeta automática entre as duas placas de vidro. Evitar a introdução de bolhas de ar. Inserir o Pente e deixar que o gel polimerizar por 30-60 minutos. </li></ol> Configurar o aparelho de eletroforese e prerun o gel <ol><li> Desmontar o gel da câmara de fundição e montagem para o aparelho de gel de acordo com instruções fabrica 3. </li><li> Encha o menor tampão tampão sagacidade câmara de execução (0,5-1 x TBE), que as placas de vidro será subfundiram 2-3 cm com tampão. Encha a câmara superior tampão até o topo do gel com o funcionamento de buffer. </li><li> Remova cuidadosamente o pente e lavar os poços com tampão de corrida usando uma pipeta e gel loading dicas. </li><li> Anexar a tampa do sistema de gel e conecte os cabos a uma fonte de alta tensão. Antes que você pode carregar suas amostras que você tem que prerun o gel por pelo menos 30 minutos para aquecer o gel para cima e para remover a uréia remanescente do gel. A temperatura ideal deve estar entre 45-55 ° C. Evite temperaturas superiores a 60 ° C como bandas poderia manchar ou as placas de vidro pode rachar. Escolha watts constante para o prerun (15-25 W por gel). </li></ol> Preparação de amostras <ol><li> Nesse meio tempo preparar suas amostras. Portanto, adicione a quantidade adequada de mistura de 2 x carregamento gel para sua amostra. A mistura de carregamento geralmente contém formamida 90%, 0,5% EDTA, cyanol 0,1% xileno e 0,1% azul de bromofenol. </li><li> Antes de as amostras podem ser carregadas no gel, as amostras devem ser de calor desnaturado por aquecimento as amostras entre 70-90 ° C por alguns minutos. </li></ol> Carregar e executar o gel <ol><li> Quando o prerun terminar, retire a tampa e lave bem os bolsos, como descrito antes, como uréia tem lixiviado para os poços. </li><li> Aplicar as amostras cuidadosamente do fundo do bolso. Evitar a introdução de bolhas de ar. Tampão de carregamento tem de ser aplicado para os bolsos vazios para manter a igualdade de condições durante a corrida. </li><li> Montar a tampa e executar o gel em watts constante para manter a temperatura do gel de 55 ° C semelhante ao prerun. Observar a migração dos corantes do marcador até que a frente de corante atingiu a extremidade inferior do gel. A duração da execução depende da porcentagem de acrilamida usado, força iônica do tampão e espessura gel. A execução pode durar entre 2-4 horas. Verificar a temperatura do gel. Um termômetro gel podem ajudar a monitorar a temperatura adequada durante a corrida. </li></ol> Processar o gel <ol><li> Quando a frente do corante atingiu o final do gel colocar o gel para fora da câmara inferior buffer. Remova o gel da câmara e soltar os grampos. Afaste os espaçadores e cuidadosamente dissimular as placas de vidro. Se for necessário cortar a parte superior bem contendo parte gel. </li><li> Transferir cuidadosamente o gel em um prato com uma solução de gel de fixação (mesma concentração de TBE além de metanol e etanol 5-10%). Deixe o gel na solução por 5-10 minutos e mudar o buffer duas vezes. </li><li> O gel está pronto para posterior processamento usando um secador de gel vácuo ou digitalização direta do gel. </li></ol>

<ol><li>Maniatis, T., Jeffrey, A., van deSande, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chain+length+determination+of+small+double-+and+single-stranded+DNA+molecules+by+polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Chain length determination of small double- and single-stranded DNA molecules by polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Biochemistry. 14, 3787-3794 (1975).</li>
<li>Albright, L. M., Slatko, B. E. Denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAlbright%2C+LM+%22Curr+Protoc+Nucleic+Acid+Chem%22">Curr Protoc Nucleic Acid Chem</a>. , (2001).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22PROTEAN+II+xi+Cell+and+PROTEAN+II+xi+2-D+Cell+Instruction+Manual%22">PROTEAN II xi Cell and PROTEAN II xi 2-D Cell Instruction Manual</a>. , Biorad. (2001).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a declarar.

<ol><li> A nitidez da banda depende de vários fatores. O volume da amostra carregada para as bandas nítidas deve ser o menor possível, isto é, idealmente entre 1-5 mL. No entanto, até 15 mL podem ser carregados que ainda garante uma resolução aceitável. Resultados menos amostra de volume em faixas mais nítidas. </li><li> A qualidade da banda é também dependente da espessura do gel. Géis mais finas, como 0,75 milímetro mostram melhores resultados do que 1,5 milímetros de espessura géis. </li><li> A forma de bandas também pode ser influenciado du...

desnaturação uréia eletroforese em gel de poliacrilamida (page urea)

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE)

PAGE desnaturante uréia ou uréia eletroforese em gel de poliacrilamida emprega 6-8 M de uréia, que desnatura DNA secundário ou estruturas de RNA e é usado para a sua separação em uma matriz de gel de poliacrilamida com base no peso molecular. Fragmentos de 2 a 500 bases, com diferenças de comprimento tão pequeno quanto um único nucleotídeo, podem ser separados utilizando este método 1. A migração da amostra é dependente da concentração de acrilamida escolhido. A maior porcentagem de poliacrilamida resolve fragmentos menor peso molecular. A combinação de uréia e temperaturas de 45-55 ° C durante a execução gel permite a separação de DNA não estruturados ou moléculas de RNA. Em geral, este método é necessário para analisar ou purificar DNA de fita simples ou fragmentos de RNA, tais como oligonucleotídeos sintetizados ou rotulados ou produtos a partir de reações de clivagem enzimática. Neste artigo de vídeo vamos mostrar como preparar e executar o gel de poliacrilamida desnaturante uréia. Dicas técnicas estão incluídos, além dos 1,2 protocolo original.

Desnaturação uréia eletroforese em gel de poliacrilamida é usado para separar single-stranded DNA ou RNA até um limite de 500 nucleotídeos. Uréia em combinação com amostras de calor desnatura e não estruturadas cadeias simples migrar dentro da matriz de gel de acordo com seu peso molecular.

Desnaturação Uréia Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (PAGE Urea)

A PAGE de ureia ou a eletroforese em gel de poliacrilamida com ureia desnaturante utiliza ureia 6-8 M, que desnatura estruturas secundárias de DNA ou RNA e é utilizada para a sua...

De modo geral, esse tipo de gel é necessário para separar fragmentos de DNA ou RNA de fita simples, como oligonucleotídeos sintetizados ou marcados ou produtos de reações de clivagem enzimática. A faixa de separação depende da concentração de poliacrilamida, da ureia em combinação com desnaturação térmica da amostra, e das moléculas de fita simples que migram dentro da matriz do gel de acordo com seu peso molecular. Este vídeo apresenta o preparo, a eletroforese e o processamento de um gel típico.Olá, meu nome é Haki. Estou na Universidade Tecnológica de Nang. Nesta demonstração, vou mostrar como realizar uma eletroforese em gel poliacrilamida desnaturante.Utilize placas de vidro limpas e monte o sanduíche de gel de acordo com as instruções do fabricante. Fixe o gel na câmara padrão de moldagem. Ize as placas de vidro de géis grandes se o gel tender a aderir às placas de vidro.Escolha um tamanho e espessura de gel de acordo com seus requisitos de separação. Prepare a solução do gel. De acordo com os protocolos atuais em biologia molecular.Escolha uma concentração de poliamida que atenda aos seus requisitos de separação. Porcentagens mais altas de acrilamida resolvem fragmentos de menor peso molecular. Use Alta pure UIA e misture com a quantidade desejada de poliacrilamida em um béquer ou frasco.Adicione 10 XTBE ao tampão e complete até o volume necessário com água. Aqueça a solução por 20 segundos no micro-ondas e misture suavemente até que todo o UIA esteja dissolvido. Você pode armazenar a solução, se necessário, para volumes maiores de gel.Repita a etapa no micro-ondas até que a solução esteja morna ao toque. Evite aquecer demais a solução. Não superaqueça, pois a uréia começará a se degradar após 60 graus.Centígrados podem ser detectados pelo cheiro de amônia. Quando a solução estiver clara e esfriar até a temperatura ambiente, adicione PS e tamid à solução de gel e misture suavemente. Se a solução de gel estiver muito quente, o gel se polimerizará dentro da pipeta.Despeje o gel usando uma pipeta serológica e, em seguida, utilize uma ajuda de pipetagem entre as duas placas de vidro. Evite introduzir bolhas de ar. Insira a tecom cuidadosamente.Tente não aprisionar bolhas de ar e deixe o gel polimerizar por 30 a 60 minutos. Desmonte o gel do suporte de moldagem e monte-o na câmara superior de tampão. De acordo com o protocolo do fabricante, coloque o gel na câmara inferior de tampão e preencha o reservatório inferior com tampão de eletroforese, normalmente 0,5 a 1 vez TBE.A mesma concentração utilizada para o gel, preencha a câmara superior de tampão com tampão de eletroforese até a borda da placa de vidro. Antes de carregar suas amostras, você deve pré-executar o gel por pelo menos 30 minutos para aquecê-lo e remover a ureia remanescente do gel. A temperatura ideal deve estar entre 45 e 55 graus centígrados, como na eletroforese real do gel.Evite temperaturas superiores a 60 graus, pois as bandas podem se espalhar ou as placas de vidro podem rachar cuidadosamente. Remova o tampão sem perturbar as bordas e enxágue os poços através dele para remover a ureia que tenha vazado para dentro deles. Use ponteiras para carregamento de géis e pipeteie para cima e para baixo várias vezes.Para cada um, prenda a tampa do sistema de eletroforese e conecte os cabos a uma fonte de alta voltagem. Escolha watts constantes para o pré-roteiro, cerca de 15 a 20 watts por gel. Quando a fonte é ligada, bolhas de ar indicam boa condutividade.Enquanto isso, prepare suas amostras, adicionando, portanto, a quantidade apropriada de dois x tampão de carga para a sua amostra. Quando a pré-eletroforese terminar, remova a tampa e lave bem o bolsão conforme descrito anteriormente; é muito importante enxaguar cuidadosamente os bolsões do gel para remover resíduos de uréia, pois a uréia formará uma camada densa que dificulta a entrada da amostra no gel.Imediatamente antes de você. Aplique o aquecimento da sua amostra, incubando-a a pelo menos 70 graus Celsius por vários minutos. Aplique as amostras cuidadosamente a partir da base do bolsinho.Para algumas aplicações, o corante interfere com sua amostra e pode causar bandas difusas, ou o corante exibe o sinal fluorescente. Nesse caso, é útil remover um corante ou todos os corantes e carregar o tampão contendo o corante padrão. Em um poço vazio, o padrão de tamanho, a quantidade de amostra que você deve carregar para obter bandas nítidas é idealmente entre um e cinco microlitros, mas você também pode carregar volumes maiores, até 15 microlitros.Menor volume da amostra resulta em bandas mais nítidas. Evite introduzir bolhas de ar e deixe a amostra afundar lentamente no bolsinho para que uma camada uniforme seja formada. Se você usar um marcador fluorescente, envolva o sistema de gel em folha de alumínio para evitar a exposição à luz, o que poderia causar o desbotamento fotossensível da sua amostra.Monte a tampa e ligue a fonte de alimentação. Execute o gel até que a frente do DIA atinja a extremidade inferior do gel. A duração da corrida depende do percentual de acrilamida.Você escolhe a força iônica do seu tampão, espessura e comprimento do gel. Uma corrida pode durar entre uma e várias horas. Observe a migração do marcador para determinar a duração da eletroforese.Use watts constantes e verifique a temperatura do gel. Um termômetro para gel pode ajudar a monitorar a temperatura adequada durante a corrida ou consulte o manual do aparelho de eletroforese para verificar quando a corrida chegou ao fim. Desligue a fonte de alimentação e remova a tampa do aparelho de eletroforese.Em seguida, retire o sanduíche do gel da câmara de tampão inferior. Descarte o tampão da câmara superior. Encha um recipiente com solução fixadora para gel.Esta solução deve ter a mesma concentração de TB e entre cinco a 10% de metanol e ácido acético. Remova o sanduíche de gel do aparelho e solte as presilhas. Retire os espaçadores e desmonte cuidadosamente as placas de vidro usando uma espátula. Se necessário, corte o peso em um poço contendo a parte do gel ou a parte inferior vazia do gel e descarte os pedaços desnecessários do gel, como as faixas contendo corante.Para amostras fluorescentes, retire cuidadosamente o gel da placa de vidro e transfira-o para um recipiente contendo solução fixadora para gel. Deixe o gel nesta solução por cinco a dez minutos e troque o tampão duas vezes. Agite suavemente o recipiente para remover a ureia do gel ou coloque o gel na solução de coloração, conforme a sua aplicação.A qualidade do gel também depende da espessura do gel. Géis mais finos, como 0,75 milímetro, apresentam melhores resultados do que géis com 1,5 milímetro de espessura, mas são mais difíceis de manipular. A nitidez das bandas depende de vários fatores.Uma baixa voltagem no início da corrida pode ajudar a obter bandas mais nítidas, pois a amostra penetra suavemente na frente do gel, evitando o colapso dos poços do gel devido à alta voltagem. Um gel de empilhamento curto, com baixa porcentagem de acrilamida, pode ter o mesmo efeito de nítida definição das bandas, e a inclusão de Glicerol a 10% também auxilia durante o carregamento do gel, fazendo com que a amostra afunde no poço. Aplique mais facilmente tampão de carga nos poços vazios para manter condições iguais durante a corrida.Quando seu gel estiver na solução de fixação, você pode secar o gel usando um secador de gel a vácuo para posterior obtenção de imagens ou escanear o gel diretamente, dependendo do marcador ou corante que estiver utilizando. Esta página U é útil para analisar ou isolar amostras de DNA ou RNA de fita simples. Os géis podem ser armazenados à temperatura ambiente.Portanto, enrole o gel em papel-toalha e umedeça-o com água ou tampão em circulação. Coloque o gel envolvido e úmido em um saco plástico com fechamento hermético e utilize-o em até 48 horas. Um problema frequentemente observado é o encurvamento das bordas do gel (gel smiling).Isso ocorre devido à distribuição desigual do calor ao longo do gel. Se o gel não estiver cercado por tampão, a fixação de uma placa metálica pode aumentar a qualidade do gel. Olá, eu sou Hi Kasam.Eu sou da Universidade Tecnológica N Yang. Mostrei a você como realizar uma eletroforese desnaturante. Vejo você da próxima vez.

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Biologia

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