Name: Em Imaging vivo do Deep camadas corticais usando um Microprisma (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-27T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Aprenda a usar microprismas de vidro para imagem in vivo de camadas profundas do neocórtex em camundongos. Esta técnica permite visualizar simultaneamente todas as seis camadas corticais com campo amplo de aproximadamente 900 μm.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos a Anthony J. Koleske, PhD para fornecer os ratos YFP.

Parte 1: Optics Microprisma e Configuração do Microscópio <ol><li> O microprismas que usamos são de 1 mm, em ângulo reto prismas feitos de vidro comprado BK7 da Corporação Optosigma (Figura 1). Microprismas são tratadas usando uma pinça, sempre que possível. </li><li> A hipotenusa do microprisma é revestido com prata aperfeiçoado para fornecer uma refletividade de mais de 97% 4-200 nm. Isto proporciona reflexão interna, tanto de luz de excitação do laser e da fluorescência emitida. </li><li> Microprismas são sempre tratados com pinças, quando possível. As luvas são usadas em todos os momentos para manter o prisma limpo. </li><li> Nós usamos uma custom-built microscópio de dois fotões capaz de pequenos animais de imagem. O animal, ligado ao dispositivo de estereotaxia, é colocado em um palco de 3 eixos motorizados. </li><li> O microscópio está ligado a um PC Windows rodando software scanimage. Scanimage é um software de aquisição de imagem escritos em Matlab por Pologruto et al 1. </li><li> Para geração de imagens microprisma, coletamos imagens com uma resolução de 1024 x 1024 ou 512 x 512 pixels. Além disso, nós tipicamente scan em 2 ms / linha ou 4 ms / linha. </li><li> Dois tipos de objetivos são utilizados nos experimentos: <ul><li> A menor abertura numérica objetivo de ar (NA) para um largo campo de visão de imagem (veja a Tabela de Reagentes e Equipamentos). </li><li> Um objetivo maior de ar NA com um colar de correção de vidro capazes de minimizar aberrações esféricas induzida por 0-2 mm de vidro (ver Tabela de Reagentes e Equipamentos). </li></ul></li><li> Quando o animal está pronto para a gráfica em um objetivo baixa ampliação, alinhar o padrão raster quadrados de varredura do laser com o topo da microprisma. Isso ajudará a orientar a imagem e fazer uso eficiente da potência do laser. </li><li> Usando um objetivo maior NA com um colar de correção de vidro, coloque o colar de correção para corrigir a aproximadamente 1 mm de vidro. Uma vez que uma imagem fluorescente aparece durante o experimento, pode-se chegar com cuidado dentro do microscópio para otimizar o colar de correção para maximizar a resolução de imagem. </li></ol> Parte 2: Non-sobrevivência Cirurgia Animal e Inclusão Microprisma <ol><li> A duração do procedimento completo, desde a incisão inicial até a conclusão de imagem, depende dos objetivos do experimento. No entanto, a colocação não-sobrevivência procedimento cirúrgico e microprisma pode ser esperado para levar cerca de 30-40 minutos para ser concluído. </li><li> Camundongos (P30-P60) são pesados ​​e anestesiados adequadamente usando uma injeção IP de cetamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) para um plano adequado para procedimentos cirúrgicos. </li><li> Ao longo de todo o experimento, o animal deve ser verificado a cada 15-20 minutos para avaliar o seu nível de anestesia. Se o animal reage a uma empresa toe pinch, uma dose suplementar de cetamina / xilazina é necessária. Tipicamente, uma dose suplementar é um terço da dose inicial e pode ser preparado com antecedência, em uma seringa para injeção IP imediato, se necessário. </li><li> Uma vez que o mouse esteja devidamente anestesiado, a maioria dos pêlos sobre a cabeça do animal é raspado com um aparador com uma lâmina # 40. </li><li> Nair ® é aplicado para os cabelos restantes na cabeça para ajudar a criar uma superfície livre de fios que podem ficar no caminho do microprisma durante o exame. Após 5 minutos, o ® é Nair limpos usando um cotonete. </li><li> O animal anestesiado está devidamente colocada em um aparelho estereotáxico mouse. Durante os procedimentos cirúrgicos e sessões de imagem do animal é mantido em um cheio de água almofada de aquecimento fixado em 36 graus Celsius. </li><li> Com a cabeça do animal corretamente fixada no local, uma incisão limpa é feito usando um bisturi para baixo da linha medial do crânio para separar a pele. </li><li> Uma pequena quantidade de peróxido de hidrogênio 3% é colocado em um cotonete e aplicados ao crânio para limpar as membranas entre o crânio ea pele. </li><li> O peróxido de hidrogênio também ajuda a revelar bregma, um marco importante em saber onde realizar a craniotomia e insira o microprisma. </li><li> Antes da craniotomia é iniciado, as barras de ouvido e bar mordida estão adequadamente ajustadas para inclinar o crânio exposto de tal forma que é, basicamente, ao nível da mesa. Isso proporciona uma melhor plataforma para a craniotomia. Além disso, o que torna a superfície superior do prisma perpendicular com a luz de excitação de entrada. Isso ajudará a minimizar aberrações ópticas, enquanto imagem. </li><li> A pequena rebarba dental (~ 0,8 tamanho da cabeça mm) é conectado a uma ferramenta Dremel ® usando um braço de extensão flexível. Para craniotomias, vamos definir a velocidade para cerca de 7.000 a 10.000 rpms. </li><li> A broca dental é desnatado ao longo do crânio, até um groove praça é estabelecida no osso. Os lados do quadrado são aproximadamente 2-3 mm de comprimento e 1,5 centrada caudal mm e 1 mm lateral ao bregma. </li><li> Continuar afinando o osso até uma pequena abertura é feita através do crânio. Um par de fórceps can levantar o retalho ósseo longe do crânio. </li><li> A dura precisa ser removido antes da microprisma pode ser inserido no córtex. Sangramento é melhor controlada, permitindo que o sangue coagule na superfície por alguns minutos. Posteriormente, o sangue coagulado é removido com uma esponja cirúrgica antes de inserir o microprisma. </li><li> Para ajudar a ajudar o alinhamento do prisma com o córtex, a face vertical do microprisma está alinhado paralelo com as alças do fórceps. </li><li> Com o prisma corretamente realizada, o microprisma inteiro é inserido até o topo do prisma é nivelada com a superfície neocortical. </li><li> Quando inserido corretamente, a microprisma deve permanecer na posição adequada. Qualquer hemorragia que resulta é mínima e pode ser absorvido com uma pequena esponja cirúrgica. Uma vez que o prisma está em vigor o animal está pronto para geração de imagens. </li><li> Depois de um microprisma tem sido usado em um animal, ele pode ser reutilizado várias vezes. No entanto, ele não precisa ser devidamente limpo para remover qualquer material restante biológica. Isso pode ser feito por imersão do prisma em um pequeno volume de HCl ácido, seguida de um mergulho em metanol. O microprisma limpa pode então ser embrulhado em papel de lente até o uso futuro. </li></ol> Parte 3: Resultados Representante <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: Imagens do microprisma em ângulo reto. Prismas usados ​​neste experimento são um milímetro, prismas de vidro BK7 com um revestimento de prata reforçada com a hipotenusa para permitir reflexão interna de excitação e emissão de luz. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2: Imagem da camada V neurônios piramidais YFP. Imagem de campo de visão ampla com a microprisma revela uma grande população de corpos celulares piramidal ~ 800-900 mM de profundidade da superfície cortical. Além disso, dendrites apical estendendo-se até para a camada I também pode ser resolvido. Barra de escala = 200 mM. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3: Um objetivo maior abertura numérica usada em conjunto com o microprisma fornece resolução espacial suficiente para resolver as espinhas dendríticas nos dendritos apicais nos neurônios piramidais da camada V. Barra de escala = 10 mM. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4: Imagem obtida pela microprisma e uma cauda de injeção venosa de corante fluorescente. A imagem mostra vertical, vasos de grosso calibre, que se estende desde as regiões cerebrais profundas e capilares menores ramificando-se através do volume cortical. Barra de escala = 200 mM. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5: Usando um objetivo maior abertura numérica, a rede de capilares no neocórtex pode ser trabalhada com maior detalhe. Barra de escala = 50 mm. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6: microprismas também permite que as células vermelhas do sangue de imagem (hemácias) que flui através dos vasos. Hemácias não absorvem o corante fluorescente e, portanto, são vistos como listras escuras em todo o navio. Por linha de varredura em toda a embarcação, pode-se obter medições de fluxo e velocidade de RBC. Barra de escala = 10 mM (barra horizontal na imagem superior e inferior) e 250 ms (barra vertical na imagem em baixo).

<ol><li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScanImage%3A+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Eng+Online%22%5BJournal%5D)">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomed Eng Online. 2, 13-13 (2003).</li>
<li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).</li>
<li>Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuations+and+stimulus-induced+changes+in+blood+flow+observed+in+individual+capillaries+in+layers+2+through+4+of+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15741-15741 (1998).</li>
</ol>

Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela IACUC da Universidade de Yale.

Usando um microprisma em um experimento de imagens é relativamente simples e oferece muitas vantagens para os estudos in vivo sobre o neocórtex. Exemplos representativos usando esta técnica incluem imagens tiradas a partir de camundongos transgênicos expressando a proteína fluorescente nos neurônios da camada amarela V cortical. Usando microprismas pode-se ver uma coleção de grandes corpos celulares piramidais da camada V, cerca de 1 mm abaixo da superfície cortical. Visto também são os dendritos apicais que se estendem...

<table><tbody><tr><td>Com revestimento reflexivo de prata aprimorada-(R77)</td><td>OptoSigma Corp. (Santa Ana, CA)</td><td>055-0010</td><td>Com revestimento reflexivo de prata aprimorada-(R77)</td></tr><tr><td>Dextrana-fluoresceína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD70</td><td>70 kDa </td></tr><tr><td>Objetiva a seco, 4x, 0,28 NA</td><td>Olympus Corporation</td><td>XLFLUOR 4x/340</td><td></td></tr><tr><td>Objetiva a seco, 40x, 0,60 NA</td><td>Olympus Corporation</td><td>LUCPLFLN</td><td>Com correção para lamínula de 0-2 mm</td></tr></tbody></table>

em imaging vivo do deep camadas corticais usando um microprisma

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

Nós apresentamos um protocolo para a imagem in vivo do tecido cortical usando uma sonda de imagem cerebral profunda na forma de um microprisma. Microprismas estão 1 mm em tamanho e têm um revestimento reflexivo sobre a hipotenusa para permitir reflexão interna de excitação e emissão de luz. A sonda microprisma simultaneamente imagens múltiplas camadas cortical com uma perspectiva tipicamente vistos apenas em preparações fatia. As imagens são coletados com um grande campo de visão (~ 900 mm). Além disso, nós fornecemos informações sobre o procedimento não-cirúrgico de sobrevivência e configuração microscópio. Resultados representativos incluem imagens de neurônios piramidais da camada V de Thy-1-H YFP camundongos mostrando suas dendrites apical estendendo-se através da camada superficial cortical e estendendo-se tufos. Resolução foi suficiente para espinhas dendríticas imagem perto do soma dos neurônios da camada V. A injeção de cauda veia de corante fluorescente revela a intrincada rede de vasos sanguíneos no córtex. Linha de varredura das células vermelhas do sangue (hemácias) que flui através dos capilares revela RBC velocidade e taxas de fluxo pode ser obtida. Esta sonda microprisma romance é um elegante, o método ainda nova e poderosa de visualizar profundas estruturas celulares e da função cortical in vivo.

Em ângulo reto microprismas inserido no neocórtex do mouse permite a imagem profunda de múltiplas camadas cortical com um ponto de vista tipicamente encontrados em fatia. Um milímetro microprismas oferecer um campo de visão ampla (~ 900 mm) e resolução espacial suficiente para resolver as espinhas dendríticas. Demonstramos camada de imagem V neuronal e de imagem vascular neocortical usando microprismas.

Em Imaging vivo do Deep camadas corticais usando um Microprisma

Apresentamos um protocolo para a imagem in vivo de tecido cortical utilizando uma sonda de imagem de cérebro profundo em formato de microprisma. Os microprismas possuem 1 mm de tamanho...

As técnicas de microscopia de fluorescência possuem capacidade limitada de gerar imagens de estruturas profundas no interior do tecido, especialmente em materiais com alta dispersão da luz, como o tecido cerebral. Mesmo no caso da microscopia de dois fótons, pode ser muito difícil obter imagens in vivo de alta qualidade de estruturas neurais localizadas a mais de 500 micrômetros da superfície do neocórtex. Aqui, a linha verde indica uma profundidade de 500 micrômetros.De modo geral, as camadas neocorticais quatro, cinco e seis estão localizadas a mais de 500 micrômetros da superfície. Mostraremos como um microprisma de vidro de um milímetro inserido no neocórtex pode conduzir luz para dentro e para fora das camadas corticais superficiais e profundas. Utilizando essa técnica em um camundongo, é possível obter um campo de visão de um milímetro e visualizar simultaneamente todas as seis camadas corticais sob uma perspectiva de imagem que normalmente é encontrada apenas em tecido cerebral seccionado.Os microprismas oferecem um amplo campo de visão, capaz de visualizar os corpos celulares parametais da camada cinco com seus longos dendritos apicais e a rede complexa de vasos sanguíneos

in-vivo-imaging-of-deep-cortical-layers-using-a-microprism

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Para entender a dinâmica da rede de microcircuitos no neocórtex, é essencial para gravar simultaneamente a atividade de um grande número de neurônios. In-vivo de dois fótons de imagens de cálcio é o único método que permite registrar a atividade de uma densa população neuronal com uma única célula de resolução.

Vivo em 2-Photon Imagens de cálcio na camada 2 / 3 dos Ratos

Neste material de vídeo e suplementar, vamos mostrar um protocolo para a...

Imagem crônica de rato Visual Cortex usando uma preparação diluída crânio-

Experiência dependentes de alterações moleculares nos neurônios são essenciais para a capacidade do cérebro de se adaptar em resposta aos desafios comportamentais.

Vivo em dois fótons de imagem de experiência dependentes de alterações moleculares em neurônios corticais

A imagem de lapso de tempo no animal vivo fornece informações valiosas sobre a reorganização estrutural no cérebro intacto. Aqui, apresentamos uma preparação de crânio afinado que permite imagens transcranianas de estruturas sinápticas marcadas com fluorescência no córtex de camundongo vivo por microscopia de dois fótons.

Two-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imagem de espinhas dendríticas no Rato Cortex Usando um desbaste-crânio Preparação

Aqui, apresentamos um procedimento para a realização de imagens de Ca 2 + em larga escala com resolução celular em múltiplas camadas corticais em camundongos que se movem livremente. Centenas de células ativas podem ser observadas simultaneamente usando um microscópio em miniatura montado na cabeça acoplado com uma sonda de prisma implantada.

Multi-layer Cortical Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Imaging em ratos com movimento livre com sondas de prisma e microscopia de fluorescência miniaturizada

Aqui descrevemos um procedimento para tecido limpando, etiquetando fluorescente e imagens em grande escala do tecido de cérebro de rato que, desse modo, permite a visualização da organização tridimensional de tipos de células no neocórtex.

Imagem tridimensional em grande escala de organização celular no neocórtex Mouse

Apresentamos um na vivo dois fotões protocolo para o córtex cerebral de ratos neonatais de imagem de imagem. Este método é adequado para analisar a dinâmica do desenvolvimento dos neurônios corticais, os mecanismos moleculares que controlam a dinâmica neuronal e as mudanças na dinâmica neuronal em modelos de doenças.

Na Vivo Imagem de dois fotões de neurônios Cortical em camundongos Neonatais

Este trabalho descreve um método para observação crônica in vivo da microglia em repouso no CA1 do hipocampo de camundongos usando cirurgia precisamente controlada e microscopia de dois fótons.

In vivo Imagem crônica de dois fótons da microglia no hipocampo de camundongos

Quando integrada com uma placa de cabeça e um design óptico compatível com microscópios de um e dois fótons, a lente de microprisma apresenta uma vantagem significativa na medição de respostas neurais em uma coluna vertical sob diversas condições, incluindo experimentos bem controlados em estados fixos na cabeça ou tarefas comportamentais naturais em animais em movimento livre.

Imagem de Longo Prazo de Populações Neurais Identificadas Usando Microprismas em Animais em Movimento Livre e Cabeça Fixada

Este protocolo contém uma descrição detalhada de uma abordagem passo a passo para um modelo de camundongo crônico de janela craniana e embolia microvascular, otimizado para imagens in vivo por microscopia de dois fótons usando microsferas fluorescentes de poliestireno.

Modelo de camundongo com embolia microvascular para microscopia in vivo de dois fótons usando microesferas fluorescentes de poliestireno

Este protocolo detalha a imagem in vivo de cálcio de neurônios hipotalâmicos usando um microscópio miniaturizado (miniscópio) em camundongos que se comportam livremente durante manipulação do estado social (isolamento social e reunião social). Esse método permite a imagem, com resolução de neurônio único, da atividade hipotálmica que representa necessidade social e saciedade social, possibilitando estudos mecanicistas da homeostase social.

In Vivo Imagem de Cálcio com Microscópio Miniaturizado no Hipotálamo para Compreensão de Comportamentos Sociais em Camundongos

Aprenda a usar microprismas de vidro para imagem in vivo de camadas profundas do neocórtex em camundongos. Esta técnica permite visualizar simultaneamente todas as seis camadas corticais com campo amplo de aproximadamente 900 μm.

Em Imaging vivo do Deep camadas corticais usando um Microprisma

Explorar mais vídeos