Name: Em Imaging vivo do Deep camadas corticais usando um Microprisma (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-27T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Aprenda a usar microprismas de vidro para imagem in vivo de camadas profundas do neocórtex em camundongos. Esta técnica permite visualizar simultaneamente todas as seis camadas corticais com campo amplo de aproximadamente 900 μm.

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Agradecemos a Anthony J. Koleske, PhD para fornecer os ratos YFP.

Parte 1: Optics Microprisma e Configuração do Microscópio <ol><li> O microprismas que usamos são de 1 mm, em ângulo reto prismas feitos de vidro comprado BK7 da Corporação Optosigma (Figura 1). Microprismas são tratadas usando uma pinça, sempre que possível. </li><li> A hipotenusa do microprisma é revestido com prata aperfeiçoado para fornecer uma refletividade de mais de 97% 4-200 nm. Isto proporciona reflexão interna, tanto de luz de excitação do laser e da fluorescência emitida. </li><li> Microprismas são sempre tratados com pinças, quando possível. As luvas são usadas em todos os momentos para manter o prisma limpo. </li><li> Nós usamos uma custom-built microscópio de dois fotões capaz de pequenos animais de imagem. O animal, ligado ao dispositivo de estereotaxia, é colocado em um palco de 3 eixos motorizados. </li><li> O microscópio está ligado a um PC Windows rodando software scanimage. Scanimage é um software de aquisição de imagem escritos em Matlab por Pologruto et al 1. </li><li> Para geração de imagens microprisma, coletamos imagens com uma resolução de 1024 x 1024 ou 512 x 512 pixels. Além disso, nós tipicamente scan em 2 ms / linha ou 4 ms / linha. </li><li> Dois tipos de objetivos são utilizados nos experimentos: <ul><li> A menor abertura numérica objetivo de ar (NA) para um largo campo de visão de imagem (veja a Tabela de Reagentes e Equipamentos). </li><li> Um objetivo maior de ar NA com um colar de correção de vidro capazes de minimizar aberrações esféricas induzida por 0-2 mm de vidro (ver Tabela de Reagentes e Equipamentos). </li></ul></li><li> Quando o animal está pronto para a gráfica em um objetivo baixa ampliação, alinhar o padrão raster quadrados de varredura do laser com o topo da microprisma. Isso ajudará a orientar a imagem e fazer uso eficiente da potência do laser. </li><li> Usando um objetivo maior NA com um colar de correção de vidro, coloque o colar de correção para corrigir a aproximadamente 1 mm de vidro. Uma vez que uma imagem fluorescente aparece durante o experimento, pode-se chegar com cuidado dentro do microscópio para otimizar o colar de correção para maximizar a resolução de imagem. </li></ol> Parte 2: Non-sobrevivência Cirurgia Animal e Inclusão Microprisma <ol><li> A duração do procedimento completo, desde a incisão inicial até a conclusão de imagem, depende dos objetivos do experimento. No entanto, a colocação não-sobrevivência procedimento cirúrgico e microprisma pode ser esperado para levar cerca de 30-40 minutos para ser concluído. </li><li> Camundongos (P30-P60) são pesados ​​e anestesiados adequadamente usando uma injeção IP de cetamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) para um plano adequado para procedimentos cirúrgicos. </li><li> Ao longo de todo o experimento, o animal deve ser verificado a cada 15-20 minutos para avaliar o seu nível de anestesia. Se o animal reage a uma empresa toe pinch, uma dose suplementar de cetamina / xilazina é necessária. Tipicamente, uma dose suplementar é um terço da dose inicial e pode ser preparado com antecedência, em uma seringa para injeção IP imediato, se necessário. </li><li> Uma vez que o mouse esteja devidamente anestesiado, a maioria dos pêlos sobre a cabeça do animal é raspado com um aparador com uma lâmina # 40. </li><li> Nair ® é aplicado para os cabelos restantes na cabeça para ajudar a criar uma superfície livre de fios que podem ficar no caminho do microprisma durante o exame. Após 5 minutos, o ® é Nair limpos usando um cotonete. </li><li> O animal anestesiado está devidamente colocada em um aparelho estereotáxico mouse. Durante os procedimentos cirúrgicos e sessões de imagem do animal é mantido em um cheio de água almofada de aquecimento fixado em 36 graus Celsius. </li><li> Com a cabeça do animal corretamente fixada no local, uma incisão limpa é feito usando um bisturi para baixo da linha medial do crânio para separar a pele. </li><li> Uma pequena quantidade de peróxido de hidrogênio 3% é colocado em um cotonete e aplicados ao crânio para limpar as membranas entre o crânio ea pele. </li><li> O peróxido de hidrogênio também ajuda a revelar bregma, um marco importante em saber onde realizar a craniotomia e insira o microprisma. </li><li> Antes da craniotomia é iniciado, as barras de ouvido e bar mordida estão adequadamente ajustadas para inclinar o crânio exposto de tal forma que é, basicamente, ao nível da mesa. Isso proporciona uma melhor plataforma para a craniotomia. Além disso, o que torna a superfície superior do prisma perpendicular com a luz de excitação de entrada. Isso ajudará a minimizar aberrações ópticas, enquanto imagem. </li><li> A pequena rebarba dental (~ 0,8 tamanho da cabeça mm) é conectado a uma ferramenta Dremel ® usando um braço de extensão flexível. Para craniotomias, vamos definir a velocidade para cerca de 7.000 a 10.000 rpms. </li><li> A broca dental é desnatado ao longo do crânio, até um groove praça é estabelecida no osso. Os lados do quadrado são aproximadamente 2-3 mm de comprimento e 1,5 centrada caudal mm e 1 mm lateral ao bregma. </li><li> Continuar afinando o osso até uma pequena abertura é feita através do crânio. Um par de fórceps can levantar o retalho ósseo longe do crânio. </li><li> A dura precisa ser removido antes da microprisma pode ser inserido no córtex. Sangramento é melhor controlada, permitindo que o sangue coagule na superfície por alguns minutos. Posteriormente, o sangue coagulado é removido com uma esponja cirúrgica antes de inserir o microprisma. </li><li> Para ajudar a ajudar o alinhamento do prisma com o córtex, a face vertical do microprisma está alinhado paralelo com as alças do fórceps. </li><li> Com o prisma corretamente realizada, o microprisma inteiro é inserido até o topo do prisma é nivelada com a superfície neocortical. </li><li> Quando inserido corretamente, a microprisma deve permanecer na posição adequada. Qualquer hemorragia que resulta é mínima e pode ser absorvido com uma pequena esponja cirúrgica. Uma vez que o prisma está em vigor o animal está pronto para geração de imagens. </li><li> Depois de um microprisma tem sido usado em um animal, ele pode ser reutilizado várias vezes. No entanto, ele não precisa ser devidamente limpo para remover qualquer material restante biológica. Isso pode ser feito por imersão do prisma em um pequeno volume de HCl ácido, seguida de um mergulho em metanol. O microprisma limpa pode então ser embrulhado em papel de lente até o uso futuro. </li></ol> Parte 3: Resultados Representante <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: Imagens do microprisma em ângulo reto. Prismas usados ​​neste experimento são um milímetro, prismas de vidro BK7 com um revestimento de prata reforçada com a hipotenusa para permitir reflexão interna de excitação e emissão de luz. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2: Imagem da camada V neurônios piramidais YFP. Imagem de campo de visão ampla com a microprisma revela uma grande população de corpos celulares piramidal ~ 800-900 mM de profundidade da superfície cortical. Além disso, dendrites apical estendendo-se até para a camada I também pode ser resolvido. Barra de escala = 200 mM. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3: Um objetivo maior abertura numérica usada em conjunto com o microprisma fornece resolução espacial suficiente para resolver as espinhas dendríticas nos dendritos apicais nos neurônios piramidais da camada V. Barra de escala = 10 mM. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4: Imagem obtida pela microprisma e uma cauda de injeção venosa de corante fluorescente. A imagem mostra vertical, vasos de grosso calibre, que se estende desde as regiões cerebrais profundas e capilares menores ramificando-se através do volume cortical. Barra de escala = 200 mM. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5: Usando um objetivo maior abertura numérica, a rede de capilares no neocórtex pode ser trabalhada com maior detalhe. Barra de escala = 50 mm. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6: microprismas também permite que as células vermelhas do sangue de imagem (hemácias) que flui através dos vasos. Hemácias não absorvem o corante fluorescente e, portanto, são vistos como listras escuras em todo o navio. Por linha de varredura em toda a embarcação, pode-se obter medições de fluxo e velocidade de RBC. Barra de escala = 10 mM (barra horizontal na imagem superior e inferior) e 250 ms (barra vertical na imagem em baixo).

<ol><li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScanImage%3A+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Eng+Online%22%5BJournal%5D)">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomed Eng Online. 2, 13-13 (2003).</li>
<li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).</li>
<li>Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuations+and+stimulus-induced+changes+in+blood+flow+observed+in+individual+capillaries+in+layers+2+through+4+of+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15741-15741 (1998).</li>
</ol>

Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela IACUC da Universidade de Yale.

Usando um microprisma em um experimento de imagens é relativamente simples e oferece muitas vantagens para os estudos in vivo sobre o neocórtex. Exemplos representativos usando esta técnica incluem imagens tiradas a partir de camundongos transgênicos expressando a proteína fluorescente nos neurônios da camada amarela V cortical. Usando microprismas pode-se ver uma coleção de grandes corpos celulares piramidais da camada V, cerca de 1 mm abaixo da superfície cortical. Visto também são os dendritos apicais que se estendem...

<table><tbody><tr><td>Com revestimento reflexivo de prata aprimorada-(R77)</td><td>OptoSigma Corp. (Santa Ana, CA)</td><td>055-0010</td><td>Com revestimento reflexivo de prata aprimorada-(R77)</td></tr><tr><td>Dextrana-fluoresceína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD70</td><td>70 kDa </td></tr><tr><td>Objetiva a seco, 4x, 0,28 NA</td><td>Olympus Corporation</td><td>XLFLUOR 4x/340</td><td></td></tr><tr><td>Objetiva a seco, 40x, 0,60 NA</td><td>Olympus Corporation</td><td>LUCPLFLN</td><td>Com correção para lamínula de 0-2 mm</td></tr></tbody></table>

em imaging vivo do deep camadas corticais usando um microprisma

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

Nós apresentamos um protocolo para a imagem in vivo do tecido cortical usando uma sonda de imagem cerebral profunda na forma de um microprisma. Microprismas estão 1 mm em tamanho e têm um revestimento reflexivo sobre a hipotenusa para permitir reflexão interna de excitação e emissão de luz. A sonda microprisma simultaneamente imagens múltiplas camadas cortical com uma perspectiva tipicamente vistos apenas em preparações fatia. As imagens são coletados com um grande campo de visão (~ 900 mm). Além disso, nós fornecemos informações sobre o procedimento não-cirúrgico de sobrevivência e configuração microscópio. Resultados representativos incluem imagens de neurônios piramidais da camada V de Thy-1-H YFP camundongos mostrando suas dendrites apical estendendo-se através da camada superficial cortical e estendendo-se tufos. Resolução foi suficiente para espinhas dendríticas imagem perto do soma dos neurônios da camada V. A injeção de cauda veia de corante fluorescente revela a intrincada rede de vasos sanguíneos no córtex. Linha de varredura das células vermelhas do sangue (hemácias) que flui através dos capilares revela RBC velocidade e taxas de fluxo pode ser obtida. Esta sonda microprisma romance é um elegante, o método ainda nova e poderosa de visualizar profundas estruturas celulares e da função cortical in vivo.

Em ângulo reto microprismas inserido no neocórtex do mouse permite a imagem profunda de múltiplas camadas cortical com um ponto de vista tipicamente encontrados em fatia. Um milímetro microprismas oferecer um campo de visão ampla (~ 900 mm) e resolução espacial suficiente para resolver as espinhas dendríticas. Demonstramos camada de imagem V neuronal e de imagem vascular neocortical usando microprismas.

Em Imaging vivo do Deep camadas corticais usando um Microprisma

Apresentamos um protocolo para a imagem in vivo de tecido cortical utilizando uma sonda de imagem de cérebro profundo em formato de microprisma. Os microprismas possuem 1 mm de tamanho...

As técnicas de microscopia de fluorescência possuem capacidade limitada de gerar imagens de estruturas profundas no interior do tecido, especialmente em materiais com alta dispersão da luz, como o tecido cerebral. Mesmo no caso da microscopia de dois fótons, pode ser muito difícil obter imagens in vivo de alta qualidade de estruturas neurais localizadas a mais de 500 micrômetros da superfície do neocórtex. Aqui, a linha verde indica uma profundidade de 500 micrômetros.De modo geral, as camadas neocorticais quatro, cinco e seis estão localizadas a mais de 500 micrômetros da superfície. Mostraremos como um microprisma de vidro de um milímetro inserido no neocórtex pode conduzir luz para dentro e para fora das camadas corticais superficiais e profundas. Utilizando essa técnica em um camundongo, é possível obter um campo de visão de um milímetro e visualizar simultaneamente todas as seis camadas corticais sob uma perspectiva de imagem que normalmente é encontrada apenas em tecido cerebral seccionado.Os microprismas oferecem um amplo campo de visão, capaz de visualizar os corpos celulares parametais da camada cinco com seus longos dendritos apicais e a rede complexa de vasos sanguíneos no neocórtex, mantendo ao mesmo tempo resoluções espaciais suficientes para distinguir espinhas dendríticas e o fluxo de hemácias através de microcapilares. Meu nome é Thomas Chia e sou estudante de pós-graduação no laboratório do Professor Michael Levine, do Departamento de Engenharia Biomédica da Universidade de Yale. O protocolo que discutiremos neste vídeo trata do uso de microprismas de vidro de ângulo reto de um milímetro para gerar imagens de fluorescência de estruturas situadas a um milímetro de profundidade no neocórtex de camundongos.Os microprismas que utilizamos são prismas de ângulo reto de um milímetro, feitos de vidro BK7, adquiridos da Opto Sigma Corporation. Os microprismas são manipulados com pinça sempre que possível. A hipotenusa do microprisma é revestida com prata melhorada para fornecer uma refletividade superior a 97% de 400 a 2000 nanômetros.Isso proporciona reflexão interna tanto da luz de excitação a laser quanto da fluorescência admitida. Utilizamos um microscópio de dois fótons construído sob encomenda, capaz de realizar imagem em pequenos animais. O animal, fixado a um dispositivo estereotáxico, é colocado sobre uma plataforma motorizada de três eixos.O microscópio está conectado a um computador com Windows que executa o software Scan Image. O Scan Image é um software de aquisição de imagens escrito em MATLAB por Polo Gudo et al. Para a imagem de microprisma, coletamos imagens com uma resolução de 10 24 por 10 24 ou cinco 12 por cinco 12 pixels.Além disso, normalmente realizamos a varredura com dois milissegundos por linha ou quatro milissegundos por linha. Um aspecto importante deste protocolo é o tipo de objetivas do microscópio utilizadas em conjunto com os microprismas. Dois tipos de objetivas são utilizados nos experimentos.O objetivo à esquerda é um objetivo a ar de baixa abertura numérica para imageamento com amplo campo de visão, neste caso, um objetivo Olympus 4x 0,28 NA. O objetivo à direita é um objetivo a ar de alta abertura numérica 40x 0,60 com colarinho de correção de vidro capaz de minimizar as aberrações esféricas induzidas por zero a dois milímetros de vidro. Para preparar o camundongo para cirurgia e a inserção do microprisma, o primeiro passo é anestesiar adequadamente o animal até um nível adequado para procedimentos cirúrgicos.Primeiro, o peso do animal é registrado com base na dosagem estabelecida. Um volume apropriado de uma mistura de cetamina e xilazina é aspirado em uma seringa. As drogas anestésicas são administradas por injeção IP utilizando uma agulha de 28 graus.Uma vez que o camundongo esteja em um plano anestésico adequado para procedimentos cirúrgicos, a maior parte dos pelos na cabeça do animal é aparada usando uma máquina de cortar pelos com lâmina número 40. Em seguida, nare é aplicado aos pelos remanescentes na cabeça para ajudar a criar uma superfície livre de pelos que possam interferir no microprisma. Durante a aquisição de imagens, após cinco minutos, o NA é removido usando um cotonete, e o animal anestesiado é corretamente posicionado em um aparelho estereotáxico para camundongos.Durante os procedimentos cirúrgicos e sessões de imagem, o animal é mantido sobre uma almofada aquecida com água regulada em 36 graus Celsius. Com a cabeça do animal devidamente fixada, é feita uma incisão limpa ao longo da linha mediana do crânio. Para separar a pele, uma pequena quantidade de peróxido de hidrogênio a 3% é colocada em uma haste de algodão e aplicada sobre o crânio para remover as membranas entre o crânio e a pele.O peróxido de hidrogênio também ajuda a revelar o BMA, um marco importante para identificar onde realizar a craniotomia e inserir o microprisma. Antes de iniciar a craniotomia, as barras auriculares e a barra de mordida são adequadamente ajustadas para inclinar o crânio exposto de modo que fique basicamente nivelado com a mesa. Isso fornece uma plataforma melhor para a craniotomia.Uma pequena broca dentária é conectada a uma ferramenta Dremel para craniotomias. Ajustamos a velocidade para aproximadamente 7.000 a 10.000 RPM. A broca dentária é deslizada sobre o crânio até que um sulco quadrado seja formado no osso.Os lados do quadrado têm aproximadamente dois a três milímetros de comprimento e são centralizados. A 1,5 milímetro de distância, cunham-se e, a um milímetro lateralmente, remove-se continuamente o osso até que se faça uma pequena abertura no crânio. Um par de pinças pode levantar o retalho ósseo.A dura precisa ser removida antes que o microprisma possa ser inserido no córtex. O sangramento é melhor controlado deixando o sangue coagular na superfície por vários minutos. Posteriormente, o sangue coagulado é removido usando uma esponja cirúrgica para auxiliar no alinhamento do prisma com o córtex.A face vertical do microprisma é alinhada paralelamente às hastes da pinça. Com o prisma corretamente segurado, insere-se completamente todo o microprisma até que a parte superior do prisma fique nivelada com a superfície do neocórtex. Aqui podemos ver o prisma repousando no neocórtex.Quando inserido corretamente, o microprisma deve permanecer na posição adequada. Qualquer sangramento resultante é mínimo e pode ser absorvido com uma pequena esponja cirúrgica. Uma vez que o prisma está no lugar, o animal está pronto para a aquisição de imagens com o animal.Sob um objetivo de baixa ampliação, pode-se observar a varredura a laser em raster sobre o microprisma na superfície do cérebro. Abaixo estão alguns exemplos representativos de imagens obtidas de camundongos transgênicos que expressam a proteína fluorescente amarela. Em neurônios corticais da camada cinco utilizando microprismas, pode-se observar um conjunto de grandes corpos celulares parametais na camada cinco, quase um milímetro abaixo da superfície cortical.Também são observados os dendritos apicais que se estendem por todas as camadas superficiais antes de se ramificarem em tufos; utilizando um objetivo de alta abertura numérica com o colar de correção de vidro, é possível resolver espinhos dendríticos neste caso. Nos dendritos apicais de neurônios parametais da camada cinco, os espinhos dendríticos são estruturas submicrométricas e vários deles são identificados na imagem com ponteiros amarelos. Também é possível marcar os vasos sanguíneos corticais com um corante fluorescente, como o dextrano-fluoresceína, utilizando técnicas estabelecidas de injeção na veia caudal.Usando esta técnica, é possível observar os vasos de maior calibre das camadas profundas estendendo-se em direção à PIA e ramificando-se para formar a rede de microcapilares. Essa delicada rede de microcapilares no neocórtex é melhor apreciada utilizando uma objetiva de alta abertura numérica. Além disso, é possível medir a velocidade e o fluxo de hemácias em capilares neocorticais profundos por meio de varredura em linha.A linha vermelha indica o padrão de varredura sobre a imagem do capilar através do microprisma. Como os glóbulos vermelhos não absorvem o corante fluorescente, eles aparecerão como faixas escuras. A imagem na parte inferior é o resultado de uma varredura de linha com uma dimensão espacial em um dos eixos e uma dimensão temporal no outro.A partir desses AE, é possível calcular o fluxo e a velocidade dos glóbulos vermelhos através do capilar. Após um prisma microscópico ter sido usado em um animal, ele pode ser reutilizado várias vezes. No entanto, é necessário limpá-lo adequadamente para remover qualquer material biológico remanescente.Isso pode ser realizado mergulhando o prisma em um pequeno volume de ácido clorídrico, seguido por um mergulho em metanol. O microprisma limpo pode então ser envolto em papel para lentes até seu uso futuro. Isso conclui nosso protocolo sobre o uso de microprismas para imagem cortical in vivo em camundongos.O uso de microprismas em um experimento de imagem é relativamente simples e oferece muitas vantagens quando se trata de estudos in vivo sobre a neocórtex. Esperamos que você tenha considerado esta uma técnica interessante e que possa utilizá-la em seu laboratório no futuro. Obrigado por assistir e boa sorte.

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