Em Imaging vivo do Deep camadas corticais usando um Microprisma

Em ângulo reto microprismas inserido no neocórtex do mouse permite a imagem profunda de múltiplas camadas cortical com um ponto de vista tipicamente encontrados em fatia. Um milímetro microprismas oferecer um campo de visão ampla (~ 900 mm) e resolução espacial suficiente para resolver as espinhas dendríticas. Demonstramos camada de imagem V neuronal e de imagem vascular neocortical usando microprismas.

As técnicas de microscopia de fluorescência têm uma capacidade limitada de obter imagens de estruturas profundas dentro do tecido, especialmente em materiais de dispersão de luz, como o tecido cerebral. Mesmo no caso de microscopia de dois fótons, pode ser muito difícil produzir imagens in vivo de alta qualidade de estruturas neurais com profundidade superior a 500 mícrons da superfície neocortical. Aqui, a linha verde indica uma profundidade de 500 mícrons.

Em geral, as camadas neocorticais quatro, cinco e seis são maiores que 500 mícrons da superfície. Mostraremos como um microprisma de vidro de um milímetro inserido no neocórtex pode retransmitir luz para dentro e para fora das camadas corticais superficiais e profundas. Usando essa técnica em um camundongo, é possível ter um campo de visão de um milímetro e visualizar todas as seis camadas corticais simultaneamente em uma perspectiva de imagem, normalmente encontrada apenas em tecido cerebral fatiado.

Os microprismas oferecem um amplo campo de visão capaz de visualizar corpos celulares parametálicos da camada cinco com seus longos dendritos apicais e a complexa rede de vasos sanguíneos no neocórtex, mantendo resoluções espaciais capazes de resolver espinhas dendríticas e fluxo de glóbulos vermelhos através de microcapilares. Meu nome é Thomas Chia e sou um estudante de pós-graduação no laboratório do professor Michael Levine no Departamento de Engenharia Biomédica da Universidade de Yale. O protocolo que discutiremos neste vídeo será sobre como usar microprismas de vidro de ângulo reto de um milímetro para gerar imagens de fluorescência de estruturas de um milímetro de profundidade em um neocórtex de camundongo.

Os micro prismas que usamos são prismas de ângulo reto de um milímetro feitos de vidro BK sete comprados da Opto Sigma Corporation. Os microprismas são manuseados com pinças sempre que possível. A hipotenusa do microprisma é revestida com prata aprimorada para fornecer uma refletividade superior a 97% de 400 a 2000 nanômetros.

Isso fornece reflexão interna da luz de excitação do laser e da fluorescência admitida. Usamos um microscópio de dois fótons personalizado capaz de imagens de pequenos animais. O animal preso a um dispositivo estereotáxico é colocado em um estágio motorizado de três eixos.

O microscópio está conectado a um PC com Windows executando a imagem de digitalização. O software de digitalização de imagem é um software de aquisição de imagem escrito em MATLAB por Polo Gudo, et al. Para imagens de microprisma, coletamos imagens com resolução de 10 24 por 10 24 ou cinco 12 por cinco 12 pixels.

Além disso, normalmente digitalizamos a dois milissegundos por linha ou quatro milissegundos por linha. Um aspecto importante deste protocolo é o tipo de objetivas de microscópio usadas em conjunto com os microprismas. Dois tipos de objetivas são usados nos experimentos.

A objetiva à esquerda é uma objetiva aérea de baixa abertura numérica para imagens de campos de visão amplos, neste caso, uma objetiva Olympus de quatro x 0,28 NA. A objetiva à direita é uma objetiva de ar NA de 40 x 0,60 de altura com um colar de correção de vidro capaz de minimizar as aberrações esféricas induzidas por zero a dois milímetros de vidro. Para preparar o camundongo para a cirurgia e a inserção do microprisma, o primeiro passo é anestesiar adequadamente o animal a um nível adequado para procedimentos cirúrgicos.

Primeiro, o peso do animal é registrado com base na dosagem estabelecida. Um volume apropriado de um coquetel de cetamina e xilazina é puxado para uma seringa. Os medicamentos anestésicos são administrados por meio de uma injeção IP usando uma agulha de calibre 28.

Uma vez que o camundongo está em um plano de anestesia adequado para procedimentos cirúrgicos, a maior parte do cabelo na cabeça do animal é raspada usando um tremor com uma lâmina número 40. Em seguida, o nare é aplicado nos pêlos restantes da cabeça para ajudar a criar uma superfície livre de pêlos que podem atrapalhar o microprisma. Durante a imagem, após cinco minutos, o NA é limpo Usando um cotonete com ponta de algodão, o animal anestesiado é devidamente colocado em um dispositivo estereotáxico de camundongo.

Durante os procedimentos cirúrgicos e sessões de imagem, o animal é mantido em uma almofada de aquecimento cheia de água ajustada a 36 graus Celsius. Com a cabeça do animal devidamente fixada no lugar, uma incisão limpa é feita na linha medial do crânio. Para separar a pele, uma pequena quantidade de peróxido de hidrogênio a 3% é colocada em um cotonete e aplicada no crânio para limpar as membranas entre o crânio e a pele.

O peróxido de hidrogênio também ajuda a revelar o BMA, um marco importante em saber onde realizar a craniotomia e inserir o microprisma. Antes do início da craniotomia, as barras auriculares e a barra de mordida são devidamente ajustadas para inclinar o crânio exposto de modo que fique basicamente nivelado com a mesa. Isso fornece uma plataforma melhor para a craniotomia.

Uma pequena broca dentária é conectada a uma ferramenta Dremel para craniotomias. Definimos a velocidade para aproximadamente 7.000 a 10.000 RPMs. A broca dentária é desnatada ao longo do crânio até que um sulco quadrado seja estabelecido no osso.

Os lados do quadrado têm aproximadamente dois a três milímetros de comprimento e são centralizados. 1,5 milímetros e um milímetro de rema lateral continuam afinando o osso até que uma pequena abertura seja feita através do crânio. Um par de pinças pode levantar o retalho ósseo.

A dura-máter precisa ser removida antes que o microprisma possa ser inserido no córtex. O sangramento é melhor controlado deixando o sangue coagular na superfície por vários minutos. Em seguida, o sangue coagulado é removido com uma esponja cirúrgica para ajudar no alinhamento do prisma com o córtex.

A face vertical do microprisma é alinhada paralelamente às alças da pinça. Com o prisma devidamente segurado, todo o microprisma é inserido até que o topo do prisma esteja nivelado com a superfície neocortical. Aqui podemos ver o prisma descansando no neocórtex.

Quando inserido corretamente, o microprisma deve permanecer na posição correta. Qualquer sangramento resultante é mínimo e pode ser absorvido com uma pequena esponja cirúrgica. Uma vez que o prisma está no lugar, o animal está pronto para a imagem com o animal.

Sob uma objetiva de baixa ampliação, pode-se ver a varredura raster a laser sobre o microprisma na superfície do cérebro. Aqui estão alguns exemplos representativos de imagens tiradas de camundongos transgênicos expressando proteína fluorescente amarela. Nos neurônios corticais da camada cinco usando microprismas, pode-se ver uma coleção de grandes corpos celulares parametálicos na camada cinco, quase um milímetro abaixo da superfície cortical.

Também são vistos os dendritos apicais que se estendem por todas as camadas superficiais antes de divergir em Tufts usando uma objetiva de alta abertura numérica com o colar de correção de vidro, é possível resolver espinhos dendríticos neste caso. Nos dendritos apicais dos neurônios parametálicos da camada cinco, as espinhas dendríticas são estruturas submicrométricas e várias são identificadas na imagem usando pontas de setas amarelas. Pode-se também rotular os vasos sanguíneos corticais com um corante fluorescente, como a fluoresceína dextrana, usando técnicas estabelecidas de injeção na veia da cauda.

Usando essa técnica, pode-se ver os vasos de maior calibre de camadas profundas que se estendem em direção à PIA e se ramificam para formar a rede de microcapilares. Esta delicada rede de microcapilares no neocórtex é melhor apreciada usando uma objetiva de alta abertura numérica. Além disso, é possível medir a velocidade e o fluxo dos glóbulos vermelhos dos capilares neocorticais profundos por varredura de linha.

A linha vermelha indica o padrão de varredura de linha na imagem capilar através do microprisma. Como os glóbulos vermelhos não absorvem o corante fluorescente, eles aparecerão como listras escuras. A imagem na parte inferior é o resultado de uma varredura de linha com uma dimensão espacial em um AEs e uma dimensão temporal no outro.

Os EAs deste podem calcular o fluxo e a velocidade dos glóbulos vermelhos através do capilar. Depois que um microprisma foi usado em um animal, ele pode ser reutilizado várias vezes. No entanto, ele precisa ser devidamente limpo para remover qualquer material biológico restante.

Isso pode ser feito mergulhando o prisma em um pequeno volume de ácido clorídrico, seguido por um mergulho em metanol. O microprisma limpo pode então ser embrulhado em papel de lente até o uso do recurso. Isso conclui nosso protocolo sobre o uso de microprismas para imagens corticais in vivo em camundongos.

O uso de microprismas em um experimento de imagem é relativamente simples e oferece muitas vantagens quando se trata de estudos in vivo sobre o neocórtex. Esperamos que você tenha achado esta uma técnica interessante e que você possa usar em seu laboratório no futuro. Obrigado por assistir e boa sorte.