A avaliação quantitativa do Lipidome fermento usando Electrospray Espectrometria de Massa de Ionização

Este protocolo permite analisar rapidamente os principais componentes do lipídio da levedura. Começa colhendo e lavando células de levedura. As células lavadas são colocadas em uma mistura de clorofórmio e metanol de um a dois e lisadas com esferas de vidro.

A adição de clorofórmio e água separa as duas fases. A fase orgânica é coletada, seca e o filme lipídico então dissolvido em clorofórmio para armazenamento antes da espectroscopia de massa. Os lipídios extraídos são diluídos em clorofórmio e metanol com hidróxido de amônio e uma mistura de padrões internos é adicionada.

A solução lipídica agora pode ser injetada diretamente no espectrômetro de massa. Olá, sou Simon Bork, do laboratório de Vladimir Teco no Departamento de Biologia da Concordia University. Hoje vou mostrar um método para quantificar lipídios de levedura usando espectroscopia de massa.

Usamos este procedimento em nosso laboratório para estudar as mudanças de lipídios de levedura sob diferentes condições de crescimento. Então vamos começar. Para iniciar este procedimento, resus suspenda os pellets de fermento congelados previamente preparados em 1,6 mililitros de gelo, água destilada fria e transfira 1,6 mililitros da suspensão da célula para tubos de centrífuga de vidro de alta velocidade.

Observe que, ao longo deste procedimento, todas as manipulações com lipídios extraídos são feitas usando pipetas ou seringas de vidro. Como os plásticos criarão um grande sinal de fundo, se entrarem em contato com o clorofórmio, inicie a extração de lipídios adicionando seis mililitros de uma mistura de clorofórmio e metanol na proporção de um para dois e 0,8 mililitros de esferas de vidro medidas em um tubo einor à suspensão celular. Os volumes exatos não são críticos, desde que a proporção de um para dois para 0,8 para clorofórmio, metanol e levedura suspensa em água seja mantida. Vórtice.

A suspensão celular e as contas de vidro se misturam duas vezes por um minuto de cada vez, continue adicionando dois mililitros de clorofórmio e misture delicadamente e incube por cinco minutos em temperatura ambiente com mistura ocasional. Após os cinco minutos de incubação, adicione dois mililitros de água destilada e misture delicadamente. Então, novamente, incube por cinco minutos em temperatura ambiente com mistura ocasional.

Aqui também, é mais importante manter a proporção de dois para dois para 1,8 para clorofórmio, metanol e água, em vez de um volume específico. Quando a segunda incubação estiver completa. Centrifugue por cinco minutos a 3000 Gs à temperatura ambiente, colete todo o sobrenadante desta primeira extração em um novo tubo de centrífuga de vidro de alta velocidade e adicione 3,2 mililitros de clorofórmio aos grânulos de células restantes para uma segunda extração de lipídios.

Vortex as pelotas celulares com o clorofórmio adicionado duas vezes por um minuto de cada vez. Em seguida, centrifugar durante cinco minutos a 3000 Gs À temperatura ambiente, adicionar o sobrenadante desta segunda extracção ao sobrenadante colhido após a primeira extracção. Em seguida, centrifugar os sobrenadantes recolhidos durante cinco minutos.

A 3000 Gs à temperatura ambiente, os lipídios extraídos são agora dissolvidos na fase orgânica inferior. Descarte a fase aquosa superior e transfira a fase inferior para um novo tubo de centrífuga de vidro de alta velocidade. Para produzir espectros mais limpos na centrífuga do espectrômetro de massa, a fase orgânica por cinco minutos a 3000 Gs à temperatura ambiente e transferir todo o sobrenadante para um frasco de vidro.

Seque os lipídios dissolvidos sob nitrogênio, dissolva o filme lipídico seco em 500 microlitros de clorofórmio e armazene a menos 20 graus Celsius até que esteja pronto para analisar as amostras por espectrometria de massa. Comece preparando uma mistura padrão de lipídios em clorofórmio, conforme listado na tabela um encontrada no protocolo escrito que acompanha. Cada lipídio representa uma classe diferente.

Esta solução pode ser armazenada a menos 20 graus Celsius para uso posterior antes da injeção dos lipídios extraídos no espectrômetro de massa. Combinou 10 microlitros da amostra com 10 microlitros da mistura padrão de lipídios. Observe que a proporção padrão para amostra pode ser alterada conforme necessário.

Resolva a mistura de lipídios padrão e a amostra usando um espectrômetro de massa de micromassa Q a F dois, equipado com uma fonte de nano eletrospray operando a uma taxa de fluxo de um microlitro por minuto. As configurações são detalhadas na tabela dois do protocolo escrito que acompanha. Embora o uso da alta resolução de um espectrômetro de massa Q a F seja vantajoso, não é um requisito obrigatório.

Os parâmetros exatos do instrumento variam entre os espectrômetros de massa. Após a aquisição dos dados, os espectros de massa são suavizados, o fundo subtraído e os picos são centralizados. Por fim, exporte a lista de picos para o Excel.

Em seguida, normalize os picos de cada copo lipídico para seu padrão interno. Dependendo da aplicação, pode ser necessário realizar pós-processamento adicional, como isótopo e deconvolução. Este método permite a determinação rápida e aprofundada dos principais componentes do lipídio da levedura.

Aqui destacamos um lipídio, que foi de isótopo de complicado e normalizado ao seu padrão interno. Acabamos de mostrar como isolar lipídios de levedura e como determinar o lipídio de levedura usando espectroscopia de massa de ionização de exibição de eletros. Ao fazer este procedimento, é importante lembrar de evitar o uso de plásticos e manter sua amostra na faixa linear de concentrações.

Este método é bastante flexível e em muitos dos volumes pode ser alterado conforme necessário. Este protocolo de extração também é adequado para outros métodos de análise lipídica, como cromatografia em camada delgada e espectroscopia de massa multidimensional. Então é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.