Name: A avaliação quantitativa do Lipidome fermento usando Electrospray Espectrometria de Massa de Ionização (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-21T12:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Aprenda a quantificar lipídeos em levedura usando espectrometria de massa por ionização por electrospray. Este método melhora a sensibilidade e velocidade na identificação de espécies lipídicas em Saccharomyces cerevisiae.

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Somos gratos a Alain Tessier para aconselhar valiosa, discussões e suporte técnico. Reconhecemos o Centro de Aplicações Biológicas de Espectrometria de Massa na Concordia University para os serviços proeminentes. Este trabalho foi financiado por concessões do CIHR e NSERC do Canadá. VIT é um CIHR New Investigator e Concordia University, em Cátedra de Investigação Genómica, Biologia Celular e Envelhecimento.

Materiais e métodos <ol><li> Cepas de leveduras e condições de crescimento A cepa do tipo selvagem BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) foi cultivado em meio YEPD rica (1% extrato de levedura, peptona 2%, 2% de glicose). Células foram cultivadas a 30 ° C com rotação agitação a 200 rpm em Erlenmeyers em um &quot;volume frasco de volume / médio&quot; proporção de 5:1. </li><li> Armazenamento de células de levedura para extração de lipídios <ol><li> Uma cultura de 50 ml de células foi colhido por centrifugação a 3000 xg por 5 minutos. </li><li> Lavados duas vezes com água fria. <ol style=" list-style-type:lower-alpha;"><li> Ressuspender pellet em 25 ml de água gelada fria </li><li> Células sedimento em centrífuga a 3000 xg por 5 minutos </li></ol></li><li> Ressuspender o sedimento e transferir para tubo eppendorf </li><li> Pellet por centrifugação, 16.000 xg por 2 minutos, retire o sobrenadante e congelar a -80 ° C até o uso. (Usamos um copo de álcool isopropílico mantido no freezer -80, nitrogênio líquido também pode ser usado) </li></ol></li><li> Reagentes Clorofórmio e metanol grau de biotecnologia foram da Sigma-Aldrich. Ácidos graxos livres e triacilgliceróis foram adquiridos da Larodan (Malmo, Suécia). Várias espécies de fosfolipídios - incluindo fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilinositol, fosfatidilserina, ácido fosfatídico e cardiolipins - foram obtidos a partir Lipid Avanti Polar (Alabaster, AL, EUA). Alta velocidade de centrifugação de tubos de vidro com tampas de teflon foram de Fisher. </li></ol> Extração de lipídios Esta é uma modificação do protocolo descrito por Bligh e Dyer 8. Todas as manipulações com lipídios extraídos deve ser feito usando pipetas de vidro ou seringas; plásticos irá criar um grande sinal de fundo, se eles entram em contato com clorofórmio. Os volumes exatos não são críticas, desde que os rácios de 1:2:0.8 para clorofórmio - MeOH - H 2 O na etapa 3 e 2:2:1.8 para clorofórmio - MeOH - H 2 O na etapa 7 são conservados. <ol><li> Ressuspender as células congeladas em 1,6 ml de gelada destilada H 2 O. </li><li> Transferência de 1,6 ml da suspensão de células de alta velocidade tubos de centrífuga de vidro. </li><li> Adicionar 6 ml de clorofórmio e MeOH mistura (1:2) e 0,8 ml de contas de vidro à suspensão de células. </li><li> Vortex da suspensão de células com contas de vidro duas vezes por 1 min. </li><li> Adicionar 2 ml de clorofórmio e misture delicadamente. </li><li> Incubar por 5 min à temperatura ambiente com mistura ocasional. </li><li> Adicionar 2 ml de H 2 O destilada e misture delicadamente. </li><li> Incubar por 5 min à temperatura ambiente com mistura ocasional. </li><li> Centrifugar por 5 min a 3000 xg à temperatura ambiente. </li><li> Recolher toda a fase líquida em um novo tubo de centrífuga de alta velocidade de vidro. </li><li> Adicionar 3,2 ml de clorofórmio para as pelotas de células a partir do passo 9. </li><li> Vortex duas vezes por 1 min. </li><li> Centrifugar por 5 min a 3000 xg à temperatura ambiente. </li><li> Adicione o sobrenadante para a fase líquida a partir do passo 10. </li><li> Centrifugar por 5 min a 3000 xg à temperatura ambiente. </li><li> Descartar a fase (aquosa) superior e transferir a camada inferior (fase orgânica) em um novo tubo de centrífuga de alta velocidade de vidro. </li><li> Centrifugar por 5 min a 3000 xg à temperatura ambiente. </li><li> Transferir o sobrenadante inteiro em um frasco de vidro e seco sob nitrogênio. </li><li> Dissolver o filme lipídico em 500 mL de clorofórmio e armazenar a -20 ° C. </li></ol> Análise de lipídios por espectrometria de massa Um mix de ações de padrões de lipídios em clorofórmio deve ser preparado com antecedência, conforme Tabela 1, bem como uma solução estoque de MeOH - clorofórmio (1:1) com 0,1% (v / v) de hidróxido de amônio. <ol><li> Antes da injecção, combine 10 ml de uma amostra com 10 ml da mistura padrão de lipídios na Tabela 1. Em 200μL de 1:1 clorofórmio: metanol com 0,1% NH 4 OH. <ul><li> O padrão a proporção da amostra pode ser mudado quando necessário. </li></ul></li><li> Lipídios resolver usando um Micromass Q-TOF espectrômetro de massa 2 equipado com um operacional de código nano-electrospray a uma vazão de 1 ml / min. <ul><li> Parâmetros do instrumento exato vai variar de instrumento para instrumento. Ver Tabela 2 para as configurações de uma Micromass Q-TOF 2 (Waters, Milford, MA, EUA) equipado com uma fonte de nano-electrospray. Embora tenhamos aproveitado a alta resolução de um tipo Q-TOF de espectrômetro de massa, não é um requisito obrigatório. </li></ul></li><li> Após a aquisição dos espectros de massa são suavizadas, fundo subtraído e centrado, e então a lista de pico exportados para Excel. Os picos de cada classe de lipídios são então normalizados para o seu padrão interno. Dependendo da aplicação, pode ser necessário fazer executar mais de pós-processamento, tais como deisotoping e deconvolução. </li></ol> Tabela 1. Lipídica padrões internos, suas concentrações naa mistura padrão, eo modo de MS para sua análise. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Classe de lipídios </td><td> Composição da cadeia padrão </td><td> Massa de padrão </td><td> Concentração (mg / ml) </td><td> MS modo </td></tr><tr><td> Ácido fosfatídico </td><td> 14:0 / 14:0 </td><td> 591,40 </td><td> 100 </td><td> Negativo </td></tr><tr><td> Fosfatidiletanolamina </td><td> 14:0 / 14:0 </td><td> 634,45 </td><td> 200 </td><td> Negativo </td></tr><tr><td> Fosfatidilinositol </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Negativo </td></tr><tr><td> Fosfatidilserina </td><td> 14:0 / 14:0 </td><td> 622,37 </td><td> 40 </td><td> Negativo </td></tr><tr><td> Cardiolipina </td><td> 4x14: 0 </td><td> 619,92 </td><td> 100 </td><td> Negativo </td></tr><tr><td> Ácidos graxos livres </td><td> 19:00 </td><td> 297,28 </td><td> 100 </td><td> Negativo </td></tr><tr><td> Fosfatidilcolina </td><td> 14:0 / 14:0 </td><td> 650,48 </td><td> 100 </td><td> Positivo </td></tr><tr><td> Triacilgliceróis </td><td> 13:0 / 13:0 / 13:0 </td><td> 698,63 </td><td> 200 </td><td> Positivo </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Definições Instrumento para um Micromass Q-TOF 2 (Waters, Milford, MA, EUA) equipado com uma fonte de nano-electrospray. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td></td><td> Taxa de fluxo </td><td> Tensão Cone </td><td> Tensão capilar </td><td> Gás de colisão </td></tr><tr><td> Modo positivo </td><td> 1μl/min </td><td> -28 V </td><td> 3,0 kv </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Modo negativo </td><td> 1μl/min </td><td> 30 v </td><td> -3,2 Kv </td><td> 10 </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Cao, H., Gerhold, K., Mayers, J. R., Wiest, M. M., Watkins, S. M., Hotamisligil, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+lipokine%2C+a+lipid+hormone+linking+adipose+tissue+to+systemic+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of a lipokine, a lipid hormone linking adipose tissue to systemic metabolism.</a> Cell. 134, 933-944 (2008).</li>
<li>Claypool, S. M., Oktay, Y., Boontheung, P., Loo, J. A., Koehler, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiolipin+defines+the+interactome+of+the+major+ADP%2FATP+carrier+protein+of+the+mitochondrial+inner+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cardiolipin defines the interactome of the major ADP/ATP carrier protein of the mitochondrial inner membrane.</a> J. Cell Biol. 182, 937-950 (2008).</li>
<li>Guo, T., Gregg, C., Boukh-Viner, T., Kyryakov, P., Goldberg, A., Bourque, S., Banu, F., Haile, S., Milijevic, S., San, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+signal+from+inside+the+peroxisome+initiates+its+division+by+promoting+the+remodeling+of+the+peroxisomal+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A signal from inside the peroxisome initiates its division by promoting the remodeling of the peroxisomal membrane.</a> J. Cell Biol. 177, 289-303 (2007).</li>
<li>Russell, S. J., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+regulation+of+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Endocrine regulation of ageing.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 681-691 (2007).</li>
<li>Czabany, T., Athenstaedt, K., Daum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+storage+and+degradation+of+neutral+lipids+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Synthesis, storage and degradation of neutral lipids in yeast.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1771, 299-309 (2007).</li>
<li>Br&uuml, gger, Erben, B., Sandhoff, G., Wieland, R., &amp, F. T., Lehmann, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+biological+membrane+lipids+at+the+low+picomole+level+by+nano-electrospray+ionization+tandem+mass+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of biological membrane lipids at the low picomole level by nano-electrospray ionization tandem mass spectroscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 2339-2344 (1997).</li>
<li>Schneiter, R., Brügger, B., Sandhoff, R., Zellnig, G., Leber, A., Lampl, M., Athenstaedt, K., Hrastnik, C., Eder, S., Daum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospray+ionization+tandem+mass+spectrometry+%28ESI-MS%2FMS%29+analysis+of+the+lipid+molecular+species+composition+of+yeast+subcellular+membranes+reveals+acyl+chain-based+sorting%2Fremodeling+of+distinct+molecular+species+en+route+to+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Electrospray ionization tandem mass spectrometry (ESI-MS/MS) analysis of the lipid molecular species composition of yeast subcellular membranes reveals acyl chain-based sorting/remodeling of distinct molecular species en route to the plasma membrane.</a> J. Cell Biol. 146, 741-754 (1999).</li>
<li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Biochem.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).</li>
</ol>

Este método permite uma rápida avaliação quantitativa do lipidome levedura utilizando prontamente disponíveis, materiais mais baratos. O método permite a identificação da maioria das espécies de lipídios encontrados em células de levedura com exceção de diacilgliceróis, ergosterols e ésteres ergosteryl, embora estes lipídios podem ser identificados através da substituição de hidróxido de amônio com hidróxido de lítio. O método descrito permite a identificação e quantificação de lipídios nas concentrações tão baixo quant...

a avaliação quantitativa do lipidome fermento usando electrospray espectrometria de massa de ionização

A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Lipídios são uma das principais classes de biomoléculas e jogar papéis importantes membrana dinâmica, armazenamento de energia, e sinalização<sup&gt; 04/01</sup&gt;. A levedura de brotamento<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;, Uma geneticamente e bioquimicamente eukaryote manipuláveis ​​unicelulares com genoma anotado e lipidome muito simples, é um modelo valioso para estudar as funções biológicas das espécies de vários lipídios em eucariotos multicelulares<sup&gt; 2,3,5</sup&gt;.<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Tem 10 principais classes de lipídios, principalmente com comprimentos de cadeia de 16 ou 18 átomos de carbono e zero ou um grau de insaturação<sup&gt; 6,7</sup&gt;. Métodos existentes para a identificação e quantificação de lipídeos - como a cromatografia líquida de alta eficiência, cromatografia em camada fina, microscopia de fluorescência, cromatografia gasosa e seguido por MS - está bem estabelecida, mas apresentam baixa sensibilidade, insuficientemente separar várias formas moleculares de lípides, requerem derivitization lipídica antes para análise, ou pode ser bastante demorado. Aqui nós apresentamos uma descrição detalhada da nossa abordagem experimental para resolver essas limitações inerentes usando pesquisa scan-ESI / MS para a identificação e quantificação do complemento inteiro de lipídios em células de levedura. O método descrito não necessita de separação cromatográfica de misturas complexas de lipídios recuperados a partir de células de levedura, assim grandemente acelerar o processo de aquisição de dados. Este método permite a identificação e quantificação de lipídios nas concentrações tão baixo quanto g / ml e tem sido aplicado com sucesso para avaliar lipidomes de células de levedura todo e suas organelas purificada. Lipídios extração de células de levedura todo para usar este método de análise de lipídios leva de duas a três horas. Leva apenas 9:55 minutos para executar cada amostra de lipídios extraídos e secos em um espectrômetro de massa Q-TOF equipado com uma fonte de nano-electrospray.

Descrevemos um novo método lipidomics quantitativos para identificação de espécies de lipídios numerosos em levedura utilizando pesquisa scan-espectrometria de massa de ionização electrospray (ESI / MS). Este método ultrapassa atualmente os métodos disponíveis para identificação e quantificação de lipídios na capacidade de resolver diversas formas moleculares de lipídeos, sensibilidade e velocidade.

A avaliação quantitativa do Lipidome fermento usando Electrospray Espectrometria de Massa de Ionização

Os lipídios são uma das principais classes de biomoléculas e desempenham papéis importantes na dinâmica de membranas, no armazenamento de energia e na sinalização1-4. A levedura de brotamento ...

Este protocolo permite analisar rapidamente os principais componentes dos lipídios de levedura. Ele começa com a colheita e lavagem de células de levedura. Células lavadas são colocadas em uma mistura de clorofórmio e metanol na proporção de um para dois e lisadas com esferas de vidro.A adição de clorofórmio e água separa as duas fases. A fase orgânica é coletada, seca, e o filme lipídico é então dissolvido em clorofórmio para armazenamento antes da espectrometria de massa. Os lipídios extraídos são diluídos em clorofórmio e metanol com hidróxido de amônio, e uma mistura de padrões internos é adicionada.A solução lipídica pode agora ser injetada diretamente no espectrômetro de massas. Olá, sou Simon Bork do laboratório de Vladimir Teco, do Departamento de Biologia da Universidade Concordia. Hoje vou mostrar um método para quantificar lipídios de levedura utilizando espectrometria de massas.Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar alterações nos lipídios de levedura sob diferentes condições de crescimento. Então, vamos começar. Para iniciar este procedimento, ressuspenda os pellets de levedura previamente preparados congelados em 1,6 mililitros de água destilad

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Aqui nós descrevemos uma nova técnica proteômica quantitativa para a identificação de complexos de proteína em Saccharomyces cerevisiae. Neste estudo, nós utilizamos o método SILAC juntamente com purificação de afinidade seguido por espectrometria de massa para identificar com alta especificidade dos parceiros de ligação de uma proteína ER, Scs2p.

Identificação de complexos de proteínas com proteômica quantitativa em S. cerevisiae

Descrição de um processo de fosforilação quantitativa usando cryolysis, solubilziation uréia, fracionamento e enriquecimento HILIC IMAC de peptídeos fosforilados.

Phosphoproteomics quantitativa em ácidos graxos estimulada Saccharomyces cerevisiae</em

gotículas lipídicas são organelos importantes para a replicação de vários agentes patogénicos, incluindo o vírus da hepatite C (HCV). Descreve-se um método para isolar gotículas lipídicas para a espectrometria de massa quantitativa de proteínas associadas; ele pode ser utilizado sob uma variedade de condições, tais como infecção por vírus, stress ambiental, ou tratamento com droga.

Isolamento de gotículas de gordura para análise quantitativa Espectrometria de Massa

Aqui, apresentamos uma implementação de MATLAB de detecção automatizada e descrição quantitativa de gotas lipídicas em imagens de microscopia de fluorescência de fissão e brotamento de células de levedura.

Análise de conteúdo de gotas lipídicas em leveduras de fissão e brotamento usando processamento automatizado de imagens

Apresentamos um protocolo utilizando cromatografia líquida juntamente com espectrometria de massa tandem para identificar e quantificar os principais lipídios celulares em Saccharomyces cerevisiae. O método descrito para uma avaliação quantitativa das principais classes lipídicas dentro de uma célula de levedura é versátil, robusto e sensível.

Análise Quantitativa do Lipidome Celular de Saccharomyces Cerevisiae Usando Cromatografia Líquida Juntamente com Espectrometria de Massa de Tandem

Apresentamos um protocolo para identificação e quantitação das principais classes de metabólitos solúveis em água no levedura Saccharomyces cerevisiae. O método descrito é versátil, robusto e sensível. Permite a separação de isômeros estruturais e formas estereogômicas de metabólitos solúveis em água uns dos outros.

Metabolômica Quantitativa de Saccharomyces Cerevisiae Usando cromatografia líquida juntamente com espectrometria de massa tandem

Aqui, é apresentado um protocolo para a rotulagem metabólica da levedura com ácido acético de 14C, que é acoplado à cromatografia de camada fina para a separação de lipídios neutros.

Análise da Síntese Lipídica Neutra em Saccharomyces cerevisiae por Rotulagem Metabólica e Cromatografia de Camada Fina

Este vídeo demonstra a preparação de uma ultra-fina camada de matriz / analito para a análise de peptídeos e proteínas por Matrix Assisted Laser-ionização dessorção Espectrometria de Massa (MALDI-MS).

MALDI preparação da amostra: o método de Camada Ultra Thin

Padrões de Isótopos estáveis ​​e Captura de Anticorpos Anti-Peptide (SISCAPA) casais enriquecimento afinidade de peptídeos com isótopos estáveis ​​de diluição espectrometria de massa (MRM-MS) para fornecer a medição quantitativa de peptídeos como substitutos para suas respectivas proteínas. Aqui nós descrevemos o protocolo usando partículas magnéticas em um formato parcialmente automatizados.

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MALDI-TOF espectrometria de massa foi utilizado com sucesso para monitorar a troca hidrogênio / deutério amida em proteína quinase PAK2 ativação.

Amida de hidrogênio / deutério Exchange &amp; MALDI-TOF Análise Espectrometria de Massa de PAK2 Ativação

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