Name: Preparação e Cultura de explantes Rat Lens epitelial para estudar a diferenciação terminal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 2 s
Description: Aprenda a preparar e cultivar explantes de epitélio de lente de ratos recém-nascidos para estudar diferenciação terminal induzida por FGF-2. Este método permite analisar eventos de sinalização celular em biologia do desenvolvimento.

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A preparação de explantes de lente epiteliais foi adaptado a partir de métodos originado no laboratório do Dr. John McAvoy 9. Este trabalho é financiado pelo National Eye Institute, Programa de Pesquisa Intramural Z01-EY000238-22

Parte 1: Remoção de lentes Materiais e reagentes: <ol><li> Micro-tesouras de dissecação, curvado, dicas blunt, (tais as.RS-5983, Roboz Surgical Instrument Co., Inc, Gaithersburg, MD); micro-pinças de dissecação ponta, curvadas (como Roboz # RS5137). </li><li> Meio de suspensão: Meio 199 contendo 0,1% de albumina bovina sérica, 100 unidades / ml de penicilina, estreptomicina 100μg/ml, 2,5 mg / ml anfotericina B. Os reagentes estão disponíveis a partir Invitrogen, Carlsbad, CA. </li></ol> Procedimento: <ol><li> Euthanize ratos recém-nascidos (com idade entre 2-4 dias), em conformidade com as orientações fornecidas pelo National Institutes of Health, Bethesda, MD. </li><li> Remove as pálpebras com uma tesoura cirúrgica. Pressione delicadamente com uma pinça curva em lados opostos da órbita ocular para forçar o olho a protuberância para fora. Fazer uma pequena incisão no lado posterior do olho com a tesoura. Pressionando com uma pinça contra a lateral do olho oposto a incisão, a lente e uma pequena quantidade de humor vítreo ligado pode então ser forçado para fora através da ruptura, permitindo que a lente a ser pego com uma pinça curva. Cuidados devem ser tomados para não quebrar a cápsula do cristalino. </li><li> Use a pinça curvas para as lentes de transferência para uma placa de cultura de tecido de plástico contendo 60 milímetros 5ml quente, meio de suspensão estéril. </li></ol> Parte 2: Microdissecção de explantes Materiais e reagentes: <ol><li> Micro Pinças de dissecação, 0,1 dicas mm, (como Roboz RS-4976). Usamos liga Dumostar devido à flexibilidade da ponta, mas outras ligas de aço também são aceitáveis. Pinça com pontas mais finas do que 0,1 milímetros não são recomendados, pois eles tendem a quebrar ou dobrar durante este procedimento. </li><li> Meio de suspensão (ver parte 1) </li><li> Não suplementado meio Ham F12 ou Médio 199 (Invitrogen, Carlsburg, CA) </li></ol> Procedimento: <ol><li> Os seguintes passos devem ser realizados em um ambiente limpo, sem correntes de ar ambiente, utilizando ferramentas de dissecação e estéril meio estéril. </li><li> Usando um microscópio estéreo de dissecação, limpar as lentes de qualquer tecido conjuntivo aderente com a pinça de ponta 0,1 mm e transferi-los para um prato de cultura contendo 60 milímetros segundo meio de suspensão 5ml estéril (esta etapa ajuda a reduzir a contaminação). Com a pinça, transfira o número desejado de lentes para um prato de cultura contendo 35 milímetros 5ml médio, estéril não suplementado. (Muitas vezes usamos F12 Ham (Invitrogen) para esta etapa, pois a menor concentração de corante torna a dissecção mais fácil, no entanto, Meio 199 também é aceitável Sem antibióticos ou outras adições são necessários durante esta etapa..) Como muitos como 12 explantes podem ser feitas no centro de um prato desse tamanho. No entanto, um prato de 35 mm deve ser usado mesmo se explantes menos devem ser feitas, porque as ferramentas de dissecação não pode ser manipulado facilmente em um pequeno prato. Colocar a cápsula contendo as lentes restantes para uma cultura de tecidos incubadora a 37 ° C até serem necessárias. </li><li> Identificar a face posterior da lente. Há muitas maneiras de reconhecer isso: 1) O posterior é mais arredondada do que a anterior, que é um pouco achatado, 2) de ratos recém-nascidos lentes de catarata forma fria como eles arrefecer à temperatura ambiente durante a dissecção. Se a catarata frio não foi completamente cheio a lente, o lado posterior é o lado mais distante da região opaca. Se a opacidade encheu a lente, o aquecimento do prato para 37 ° C por alguns minutos vai revertê-lo. O lado posterior podem ser identificadas como as reformas de catarata com o resfriamento. 3) Vestígios da túnica vasculosa lentis pode ser visível no lado posterior. 4) A sutura posterior pode ser visível no lado posterior. Identificar o lado posterior corretamente é essencial, uma vez que este é o local onde a cápsula será aberta. Abertura da lente na face anterior vai rasgar o epitélio. </li><li> Uma vez que o lado posterior foi identificado, transformá-lo para cima e agarrar as lentes da pinça esquerda (para um trabalhador com a mão direita). Em seguida, aperte a cápsula posterior com a pinça direito de produzir uma pequena dobra. </li><li> Enquanto segura a cápsula posterior com a pinça direita, segure a dobra da cápsula com a pinça esquerda e puxe os dois pares de pinças em direções opostas para fazer um pequeno rasgo na cápsula. </li><li> Ao segurar a borda da cápsula retraindo com a pinça, puxe-o para baixo, primeiro de um lado, depois do outro, pressionando-o no plástico do prato com a pinça. Repita isso várias vezes, movendo-se em todo o equador da lente, até que a cápsula está firmemente ligado à placa em muitos pontos. Segurando a cápsula no lugar com a pinça esquerda, agite levemente a massa de fibra com a pinça direito de quebrar o vínculo entre as células de fibras e células epiteliais no equador do cristalino. Em seguida, empurre a massa de fibra de distância, rolando-o fora da cápsula / epitélio, que permanece preso à parte inferior doprato. Continue esse processo com todas as lentes no prato. Retire e deite fora as massas de fibras (ou salvá-los congelados como fonte de proteínas das lentes para outros estudos). </li></ol> Parte 3: Microdissecção e cultura de explantes centrais Materiais e reagentes: <ol><li> Estéril bisturi descartável, lâmina # 15, (Cincinnati Surgical Co. Cincinnati, OH) </li><li> Fosfato estéril salina tamponada com cálcio e magnésio (Invitrogen, Carlsbad, CA) </li><li> Meio de cultura: meio de suspensão contendo 100ng/ml FGF-2 (Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO). </li></ol> Procedimento: <ol><li> Utilizando um escalpelo esterilizado, apare o epitélio periférico (PE), que contém células em estágios iniciais de diferenciação (Figura 1A), deixando uma praça central de aproximadamente 2,0 milímetros de um lado, composta por células epiteliais centrais apenas (CE) (Figura 1B). </li><li> Transferência do prato contendo os explantes central para uma cabine de segurança biológica. Lavar 3 vezes com PBS estéril, contendo cálcio e magnésio, e uma vez com 1ml de meio de suspensão fresco, equilibrado (37 CO ° C, 5% 2). Essas lavagens reduzir muito a probabilidade de contaminação. </li><li> Adicionar 2 ml de meio de cultura para induzir a diferenciação de uma, e coloque os explantes em umidificado, cultura de tecidos incubadora a 37 ° C CO, 5% 2. Períodos de cultura pode ser tão curto quanto algumas horas ou prolongar o tempo que duas a três semanas, dependendo do parâmetro que está sendo estudado. Médio deve ser trocada a cada 2-3 dias. </li></ol> Parte 4: A colheita de explantes para a análise de eventos associados com a diferenciação 1. Explantes colheita para análise de proteína ou RNA Materiais: <ol><li> Pinças Microdissecting </li><li> SDS Lysis Buffer de RNA ou mais tarde </li></ol> Procedimento: <ol><li> No final do período de incubação, remova o meio de cultura. </li><li> Usando o microscópio estéreo de dissecação, com cuidado, solte as bordas de cada explante. </li><li> Levantar cada explante com a pinça e transferir para um tubo contendo cerca de 100μl tampão de lise SDS (para análise de proteínas) ou RNA-posterior (para análise de RNA). Agitar a ponta da pinça na solução para garantir que o explante não ficar com a pinça. </li></ol> 2. Explantes de colheita, para imunofluorescência Materiais e reagentes: <ol><li> Tampão fosfato salino com cálcio e magnésio (Invitrogen, Carlsbad, CA) </li><li> Tampão fosfato (sem cálcio e magnésio) (Invitrogen, Carlsbad, CA) </li><li> Paraformaldeído 4% (Bioproducts Boston, Worcester, MA) </li><li> Pinças Microdissecting </li><li> Pena de marcação hidrofóbica </li><li> Microscópio de lâminas de vidro </li><li> 0,25% Triton X-100 em tampão fosfato salino. </li></ol> Procedimento: <ol><li> Enxaguar explantes brevemente em PBS contendo cálcio e magnésio. </li><li> Fixar tecidos, adicionando paraformaldeído a 4% por 30 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Remova o fixador e substituir com tampão fosfato salina. Explantes fixa-se um pouco rígida, permitindo-lhes ser levantado e transferido para lâminas de vidro para a imunocoloração. </li><li> Coloque uma pequena gota de PBS (sem cálcio e magnésio) no slide para ajudar a posicionar o tecido e evitar curling. Usando uma pinça microdissecting, levante o explante e insira-o a queda no slide. Sem tocar o explante, cuidadosamente remover o líquido com um pavio de papel para achatar o explante no vidro e deixar o tecido secar ao ar em temperatura ambiente por 3-5 minutos. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1519/fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1 A. O epitélio periféricos expressa diferenciação proteínas específicas. O explante foi mostrado histoquímica para N-caderina imediatamente após microdissecção. Expressão é visto em uma faixa de células do epitélio periféricas, indicando que as células nesta região começaram a se diferenciar. B. O epitélio periférico pode ser aparado para remover as células que expressam N-caderina e outros diferenciação proteínas específicas. O anel vermelho representa a localização das células que expressam N-caderina, enquanto o pequeno quadrado delineado em cinza representa o quadrante do epitélio mostrado no painel de 1A. O epitélio periféricos podem ser removidos por quatro cortes de bisturi, deixando um quadrado central que contém apenas as células que ainda não começaram a se diferenciar.

<ol><li>McAvoy, J. W., Chamberlain, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+%28FGF%29+induces+different+responses+in+lens+epithelial+cells+depending+on+its+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor (FGF) induces different responses in lens epithelial cells depending on its concentration.</a> Development. 107 (2), 221-228 (1989).</li>
<li>Campbell, M. T., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Onset+of+fibre+differentiation+in+cultured+rat+lens+epithelium+under+the+influence+of+neural+retina-conditioned+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Onset of fibre differentiation in cultured rat lens epithelium under the influence of neural retina-conditioned medium.</a> Exp Eye Res. 39 (1), 83-94 (1984).</li>
<li>Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+lens+epithelial+explants+induced+to+differentiate+into+fibres+by+fibroblast+growth+factor+%28FGF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of lens epithelial explants induced to differentiate into fibres by fibroblast growth factor (FGF).</a> Exp Eye Res. 49 (3), 479-494 (1989).</li>
<li>Golestaneh, N., Fan, J., Fariss, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lens+major+intrinsic+protein+%28MIP%29%2Faquaporin+0+expression+in+rat+lens+epithelia+explants+requires+fibroblast+growth+factor-induced+ERK+and+JNK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Lens major intrinsic protein (MIP)/aquaporin 0 expression in rat lens epithelia explants requires fibroblast growth factor-induced ERK and JNK signaling.</a> J Biol Chem. 279 (30), 31813-31822 (2004).</li>
<li>Saravanamuthu, S. S., Gao, C. Y., Zelenka, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+is+required+for+lateral+induction+of+Jagged1+during+FGF-induced+lens+fiber+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Notch signaling is required for lateral induction of Jagged1 during FGF-induced lens fiber differentiation.</a> Dev Biol. 332 (1), 166-176 (2009).</li>
<li>Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF-induced+lens+cell+proliferation+and+differentiation+is+dependent+on+MAPK+%28ERK1%2F2%29+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF-induced lens cell proliferation and differentiation is dependent on MAPK (ERK1/2) signalling.</a> Development. 128 (24), 5075-5084 (2001).</li>
<li>Dirks, R. P., Kraft, H. J., Van Genesen, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cooperation+between+two+silencers+creates+an+enhancer+element+that+controls+both+the+lens-preferred+and+the+differentiation+stage-specific+expression+of+the+rat+beta+B2-crystallin+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">The cooperation between two silencers creates an enhancer element that controls both the lens-preferred and the differentiation stage-specific expression of the rat beta B2-crystallin gene.</a> Eur J Biochem. 239 (1), 23-32 (1996).</li>
<li>Yang, Y., Stopka, T., Golestaneh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+alphaA-crystallin+via+Pax6%2C+c-Maf%2C+CREB+and+a+broad+domain+of+lens-specific+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Regulation of alphaA-crystallin via Pax6, c-Maf, CREB and a broad domain of lens-specific chromatin.</a> The EMBO journal. 25 (10), 2107-2118 (2006).</li>
<li>McAvoy, J. W., T, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+retinas+promote+cell+division+and+fibre+differentiation+in+lens+epithelial+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Neural retinas promote cell division and fibre differentiation in lens epithelial explants.</a> Curr Eye Res. 3 (6), 827-834 (1984).</li>
</ol>

O rato sistema explante lente tem sido utilizado com sucesso por um número de laboratórios para estudar a diferenciação terminal das células epiteliais lente para lente de fibras 21,3,4,5. Quando exposto a FGF-2 em 100ng/ml explantes começará a mostrar mudanças na sinalização em poucos minutos 6, com as mudanças na morfologia e expressão de genes que aparecem sequencialmente durante vários dias 3,4,5. As culturas permanecem viáveis ​​por 2-3 semanas, se o cuidado é tomado para evitar contaminação. Os explantes centrais descritas neste protocolo são especialmente úteis para estudar a seqüência de eventos associados com a diferenciação, uma vez que contêm poucas ou nenhumas células que expressam marcadores de diferenciação antes de FGF-2 é adicionado 1,5. As células então diferenciar de forma síncrona, como um grupo, tornando possível acompanhar a evolução no tempo da sinalização e eventos transcricionais associadas com a diferenciação. Explantes de cultura para diferentes comprimentos de tempo, portanto, fornece informações precisas sobre os temporais eventos seqüência. Inibidores específicos podem ser adicionados ao meio de cultura para identificar relevantes vias de sinalização. Explantes podem ser usados ​​para analisar a expressão de proteínas por eletroforese em gel de SDS e immunoblotting ou para analisar a expressão de mRNAs específicos por RT-PCR. Faixa de rendimento de proteína 20-50 mcg / explante e rendimento de RNA é de cerca de 200-600 ng / explante, dependendo da duração do período de cultura. Nós geralmente descobrimos que explantes por 5-6 prato irá fornecer proteínas suficientes ou RNA para ensaios diversos. RNA a partir de explantes também pode ser usado para preparar cDNA para avaliar a expressão gênica por microarranjos de análise, que pode identificar novos genes que podem ser fundamentais para diferenciação. Explantes também podem ser transfectadas. Apesar de a eficiência de transfecção é geralmente baixa, é suficiente para assaying genes repórter 4, 7, 8. Microscopia de imunofluorescência dos explantes oferece um complemento útil para métodos bioquímicos determinando a localização subcelular de proteínas de interesse. Assim, a preparação ea cultura de explantes de lente rato fornece um sistema poderoso para estudar a diferenciação terminal lente em mamíferos, que podem complementar em técnicas in vivo, tais como a geração de camundongos transgênicos e knock-out.

preparação e cultura de explantes rat lens epitelial para estudar a diferenciação terminal

Preparation and Culture of Rat Lens Epithelial Explants for Studying Terminal Differentiation

A superfície anterior da lente ocular é coberto por uma monocamada de células epiteliais, que proliferam em uma zona anular subjacente ao corpo ciliar. Após a divisão, essas células migram posteriormente, onde FGF difusão da retina os induz a se diferenciar em uma vasta posterior de células lente alongado fibra, que compõem o grosso da lente. Diferenciação das células epiteliais em fibras lente lente pode ser induzida in vitro pelo cultivo de explantes da região central do epitélio anterior, na presença de FGF-2. Explantes são preparados a partir de lentes de ratos recém-nascidos através da remoção da lente do olho e agarrar a cápsula da lente no lado posterior com uma pinça de dissecação. A cápsula posterior é então delicadamente rasgada e pressionado para o fundo de plástico de um prato de cultura de tecidos. As regiões periféricas do explante são removidos com um bisturi ea área central é, então, cultivadas na presença de 100ng/ml FGF-2, enquanto 2-3 semanas, dependendo dos parâmetros a serem estudados. Como as células epiteliais em explantes cultivados diferenciar em sincronia aproximada por um período de dias ou semanas, o tempo de sinalização e expressão gênica pode ser determinada usando técnicas moleculares, bioquímicos e farmacológicos. Microscopia de imunofluorescência é um complemento poderoso para estes métodos, uma vez que demonstra a localização subcelular de proteínas de interesse e pode revelar as conseqüências fisiológicas de manipulações experimentais de vias de sinalização.

Explantes da região central da lente de ratos epitélio diferenciar de forma síncrona quando cultivadas na presença de FGF-2. Microscopia de imunofluorescência de tais culturas pode fornece informações romance sobre a expressão gênica e eventos de sinalização associado com a diferenciação terminal.

Preparação e Cultura de explantes Rat Lens epitelial para estudar a diferenciação terminal

A superfície anterior do cristalino é coberta por uma monocamada de células epiteliais, que proliferam em uma zona anular situada sob o corpo ciliar.

Este procedimento começa com a remoção das lentes de ratos com idade entre dois e quatro dias e a limpeza destas de qualquer tecido aderente. O lado posterior da lente é identificado e um pequeno rasgo é feito na cápsula. Em seguida, a cápsula é descascada para baixo e pressionada contra o fundo do recipiente.Esse processo é repetido ao redor de toda a lente. A massa de fibras da lente é removida movendo-a lateralmente. O epitélio periférico é cortado e as estruturas são então cultivadas.Finalmente, eles são transferidos para um tubo de ensaio para análise bioquímica ou para uma lâmina de vidro para microscopia. Olá, sou Peggy Lanka no laboratório de Biologia Molecular e do Desenvolvimento no Instituto Nacional do Olho do NIH. Olá, sou Al Tu, também do Laboratório de Biologia Molecular e do Desenvolvimento no Instituto Nacional do Olho.Sou Chung Ga, também do mesmo laboratório do NEI. Hoje vamos mostrar um procedimento para a explantação e o cultivo de epitélio lensar de ratos recém-nascidos. Vamos mostrar como remover a região periférica do epitélio, que contém células em estágios iniciais de diferenciação.Em seguida, mostraremos como induzir as células epiteliais centrais remanescentes do cristalino a se diferenciarem em fibras cristalinas, expondo-as ao FGF. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a cronologia dos eventos envolvidos na diferenciação terminal. Coletamos o EXPLAN em diversos momentos após a adição de FGF ao meio de cultura.Em seguida, analisamos a expressão proteica por meio de western blotting, a expressão de RNA por R-T-P-C-R ou microarranjos e realizamos imunomarcação do explante para determinar a localização subcelular das proteínas de interesse. Vamos então começar removendo lentes de ratos recém-nascidos. Para iniciar, utilize tesouras de microdissecação para remover as lentes dos olhos de ratos eutanasiados com dois a quatro dias de idade, fazendo uma pequena incisão posterior e pressionando no lado oposto.Transfira as lentes para uma placa de cultura tecidual plástica de 60 milímetros contendo cinco mililitros de meio de suspensão estéril aquecido, utilizando pinças com ponta de 0,1 milímetro. Remova qualquer tecido aderido das lentes e transfira-as para uma segunda placa de cultura de 60 milímetros contendo cinco mililitros de meio de suspensão estéril. Isso ajuda a reduzir a contaminação pelas pinças.Transfira o número desejado de lentes para uma placa de cultura de 35 milímetros contendo dois mililitros de meio estéril não suplementado. Até 12 x explantes podem ser preparados no centro de uma placa deste tamanho. Quaisquer lentes extras podem ser armazenadas na segunda placa de 60 milímetros do passo anterior e colocadas em um incubador de cultura de tecidos a 37 graus Celsius por até uma hora antes de serem usadas para fazer x explantes.Agora identifique o lado posterior da lente. Posso dizer que essas duas estão posicionadas com o lado anterior voltado para cima. Vou colocá-la de canto para que você possa olhar ao longo dela e verá a catarata fria, que é uma área opaca no centro.O lado mais distante do centro opaco é o lado posterior. Então, eu o viro para o lado posterior. No lado posterior, você também pode observar essas estriações, que são os remanescentes dessa tenal vasculite.É um padrão de vasos sanguíneos ao redor da periferia da lente que também marca o lado posterior. Correto. A identificação é fundamental, pois é nesse local que a cápsula será aberta. Abrir a lente no lado anterior irá romper o epitélio.Existem várias maneiras de identificar o lado posterior. Primeiro, ele é mais arredondado do que o lado anterior, que é ligeiramente achatado. Segundo, as lentes de ratos recém-nascidos formam cataratas frias ao se resfriarem até a temperatura ambiente durante a dissecação.Se a catarata fria ainda não tiver preenchido completamente a lente, o lado posterior é o lado mais distante da região opaca. Se a opacidade tiver preenchido a lente, aquecer a placa a 37 graus Celsius por alguns minutos irá revertê-la. O lado posterior pode ser identificado quando a catarata se reforma durante o resfriamento.Terceiros vestígios dos VASIs da túnica podem ser visíveis no lado posterior. Finalmente, a sutura posterior pode ser visível no lado posterior. Uma vez que o lado posterior tenha sido identificado, vire-o para cima e apoie a lente com a pinça esquerda.Em seguida, pin&ccedil;a a c&aacute;psula posterior com a pin&ccedil;a direita para produzir uma pequena dobra, enquanto segura a c&aacute;psula posterior com a pin&ccedil;a direita, agarre a dobra da c&aacute;psula com a pin&ccedil;a esquerda e puxe os dois pares de pin&ccedilas em dire&ccedil;&otilde;es opostas para fazer uma pequena ruptura na c&aacute;psula; ao agarrar a borda da c&aacute;psula retratil, puxe-a primeiro para baixo de um lado, depois do outro, pressionando-a contra o pl&aacute;stico da placa com a pin&ccedil;a. Repita este procedimento v&aacute;rias vezes, movendo-se ao redor de todo o equador da lente at&eacute; que a c&aacute;psula esteja firmemente fixada &agrave; placa. Em diversos pontos, segurando a c&aacute;psula no lugar com a pin&ccedil;a esquerda, movimente suavemente a massa de fibras com a pin&ccedil;a direita para romper a ader&ecirc;ncia entre as c&eacute;lulas fibrilares e as c&eacute;lulas epiteliais no equador da lente.Agora, puxe suavemente a massa de fibras, enrolando-a para fora da cápsula, que permanece presa ao fundo do recipiente. Repita este processo com todas as lentes no recipiente. As massas de fibras podem ser descartadas ou congeladas e armazenadas como fonte de proteínas da lente para outros estudos com microdissecação de explantes epiteliais inteiros completos.Vamos analisar a microdissecação e o cultivo do explante central. Usando um bisturi estéril, retire o epitélio periférico, que contém células em estágios iniciais de diferenciação. Deixe um quadrado central, com aproximadamente dois milímetros de cada lado, composto por células epiteliais centrais.Transfira apenas a placa contendo o explante central para uma cabine de segurança biológica. Lave as berinjelas três vezes com PBS estéril e uma vez com um mililitro de meio de suspensão fresco e equilibrado. Em seguida, adicione dois mililitros de meio de cultura para induzir a diferenciação e coloque o explante em uma incubadora de cultura de tecidos umidificada a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono.O período de cultivo pode durar algumas poucas horas ou até duas a três semanas, dependendo do parâmetro em estudo. O meio deve ser trocado a cada dois ou três dias com microdissecação e Turing completo. Vamos começar a colher os explantes para análise.Após o período de incubação, remova o meio de cultura utilizando pin&ccedil;as microcir&uacute;rgicas. Solte suavemente as bordas de cada explante. Segure cada explante com as pin&ccedil;as e transfira-o para um tubo contendo cerca de 100 microlitros de tamp&atilde;o de lise SDS para an&aacute;lise de prote&iacute;nas ou RNA later para an&aacute;lise de RNA, agitando a ponta das pin&ccedil;as na solu&ccedil;&atilde;o para garantir que o explante n&atilde;o adere &agrave;s pin&ccedil;as.Os espécimes estão agora prontos para análise de proteína ou RNA; os espécimes também podem ser analisados por imunofluorescência. Para iniciar, lave os espécimes brevemente em PBS. Fixe os tecidos adicionando paraformaldeído a 4% por 30 minutos.À temperatura ambiente, remova o fixador e substitua-o por PBS. O explante fica um pouco rígido, permitindo que seja levantado e transferido para lâminas de vidro para imunomarcação. Coloque uma pequena gota de PBS sem cálcio e magnésio sobre a lâmina para ajudar a posicionar o tecido e evitar o encurvamento. Usando pinças de dissecação fina, levante o explante e insira-o na gota sobre a lâmina sem tocá-lo; use cuidadosamente uma tira de papel para remover o líquido e aplainar o explante sobre o vidro.Deixe o tecido secar ao ar à temperatura ambiente por três a cinco minutos. Os implantes estão agora prontos para análise por imunofluorescência. É mostrado aqui um exemplo de um explante epitelial inteiro microdissecado que foi imunomarcado para NCO, um marcador de adesão celular.Nos estágios iniciais da diferenciação, apenas as células na região periférica do epitélio são positivamente coradas para este corte de proteína. O epitélio periférico, conforme descrito neste protocolo, deixa uma explanta central, que contém poucas, ou nenhuma, célula que expressa e é coerente. Isso é demonstrado por meio de western blotting, dos tecidos epiteliais central e periférico para e coerente; o western blotting para GA.DH foi utilizado para confirmar que as amostras de proteína foram carregadas igualmente.O momento dos eventos associados à diferenciação pode ser determinado cultivando-se explantes centrais por diferentes períodos de tempo. Explantes centrais foram cultivados por 2, 5, 24 e 48 horas em meio com ou sem 100 nanogramas por mililitro de FGF. Os explantes X foram coletados nos momentos indicados e transferidos para tampão amostra SDS para análise por eletroforese em gel seguida de transferência para membrana (western blotting).Os resultados mostram que a expressão proteica coerente final é induzida após 24 a 48 horas em cultura. O teste de Western blot para GA DH demonstra que as amostras de proteína foram igualmente carregadas.Imunomarcação de explantes centrais cultivados por quatro dias na ausência ou presença de 100 nanogramas por mililitro. FGF mostra que a imunofluorescência de N-caderina está fortemente elevada em explantes expostos ao. A imunofluorescência de FGF também mostra a localização subcelular da N-caderina nas fronteiras entre célula e célula.Acabamos de mostrar como preparar em cultura epitélios de lente para estudar a diferenciação. A principal vantagem deste sistema é que as células se diferenciam de forma sincronizada. Isso torna possível determinar a sequência de eventos.Além disso, podemos adicionar fatores de crescimento ou inibidores específicos ao meio para ativar ou bloquear vias de sinalização particulares. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de prevenir contaminações realizando a dissecação e manipulando o meio estéril em um ambiente limpo, bem como observando cuidadosamente o explante antes de cultivá-los. Assim sendo, é isso.Obrigado por assistir. Boa sorte com seu experimento. Tchau tchau. Tchau.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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A angiogênese envolve interações multicelulares e multissistêmicas que precisam ser investigadas em um ambiente fisiologicamente relevante. O objetivo deste estudo é demonstrar a capacidade do modelo de cultura de mesentério de rato em fazer comparações de lapso de tempo de redes microvasculares intactas durante a angiogênese.

A<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Método for Imaging Time-Lapse of cultivadas Rato Mesentéricas microvasculares Networks

Nós descrevemos um método para engenheiro um retina tecido composto de células epiteliais de pigmento retinal derivadas de células-tronco pluripotentes humanas cultivadas em cima de membrana amniótica humana e sua preparação para enxertia em modelos animais.

Engenharia de tecido de epitélio do pigmento da retina transplante-apropriado derivado de células estaminais embrionárias humanas

Apresentamos um modelo in vitro para avaliar a capacidade neurorregenerativa de glia ensheathing glia (OEG), após lesão neural. Baseia-se em uma cocultura de neurônios gânglios de retina adulto axotomizados (RGN) em monocamadas OEG e estudo subsequente de regeneração axonal, analisando marcadores axonal e somatodendritic RGN.

Cocultura de Neurônios de Gânglio Axotomizado de Rato Retinal com Glia Ensheathing Olfactory, como um Modelo In Vitro de Regeneração Axonal Adulta

O protocolo descreve explanações organotípicas daretina neurodo camundongo, cultivadas juntamente com seu epitélio pigmento retiniano (RPE), em meio definido r16, livre de soro e antibióticos. Este método é relativamente simples de executar, menos caro e demorado quando comparado com experimentos in vivo, e pode ser adaptado a inúmeras aplicações experimentais.

Cultivo de longo prazo, sem soro de explantes de retina de rato organotipo com epitélio pigmento de retina intacto

Este estudo tem como objetivo desenvolver um novo modelo de cultura de retina organotípica humana (HORC) que previne comprometer a integridade da retina durante o manuseio da explant. Isso é conseguido através da cultura da retina com o vítreo sobrelada e o pigmento de retina subjacente epitélio-coroide (RPE-choroid) e esclera.

Caracterização de uma nova técnica de cultura de retina organotipípica humana

Este protocolo, que foi originalmente relatado por Fernandez-Godino et al. em 20161,descreve um método para isolar eficientemente e cultivar células RPE do mouse, que formam uma monocamada RPE funcional e polarizada dentro de uma semana em placas Transwell. O procedimento leva aproximadamente 3 horas.

Dissecção eficiente e cultura de células epiteliais de pigmento de retina do rato primário

Este protocolo apresenta e descreve as etapas para o isolamento, dissecção, cultivo e coloração de explantes de retina obtidos de um camundongo adulto. Este método é benéfico como um modelo ex vivo para o estudo de diferentes doenças neurovasculares da retina, como a retinopatia diabética.

Explante Retiniano da Retina de Rato Adulto como Modelo Ex Vivo para o Estudo de Doenças Neurovasculares da Retina

Este manuscrito descreve um protocolo de vídeo detalhado para a cultura de células epiteliais primárias do cristalino (LECs), com o objetivo de melhorar a reprodutibilidade e auxiliar a pesquisa em catarata e opacificação da cápsula posterior (PCO). Ele oferece instruções passo a passo sobre dissecção de lentes, isolamento de LECs e validação, servindo como um guia valioso, especialmente para recém-chegados no campo.

Otimizando a cultura de células epiteliais primárias de lente de camundongo: um guia abrangente para tripsinização

Desenvolvemos um modelo de rato de inflamação grave da córnea por meio de curetagem do epitélio da córnea combinada com suturas da córnea. O estudo avaliou os padrões de inflamação da córnea, proliferação epitelial e alterações nas células-tronco límbicas sob condições inflamatórias.

Estabelecendo um modelo de inflamação grave da córnea em ratos com base na curetagem do epitélio da córnea combinada com suturas da córnea

Este protocolo detalha a separação do epitélio da lente ocular do camundongo e da massa em massa da célula da fibra, seguida pelo isolamento de RNA e análise de qPCR. Este método permite separar os compartimentos das células do cristalino para uma análise mais detalhada do transcriptoma e dos processos biológicos em células epiteliais versus células de fibra diferenciadas.

Isolamento de RNA do epitélio da lente ocular de camundongo e massas em massa de células de fibra

Aprenda a preparar e cultivar explantes de epitélio de lente de ratos recém-nascidos para estudar diferenciação terminal induzida por FGF-2. Este método permite analisar eventos de sinalização celular em biologia do desenvolvimento.

Preparação e Cultura de explantes Rat Lens epitelial para estudar a diferenciação terminal

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