Name: Cultura de rato precursores das células-tronco neurais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-02-25T00:00:00.000+00:00
Duration: 27 min 44 s
Description: Aprenda a isolar neuroprecursores do córtex embrionário de camundongos para estudos de neurociência e biologia do desenvolvimento. Este método demonstra dissecação, dissociação tecidual e cultura celular confiável.

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<ol><li> Precursores do mouse neural (NPCs) foram isoladas do córtex E12.5 embrião. </li><li> Camadas da pele e mesenquimais foram retirados dissecados vesículas telencefálico. </li><li> Vesículas foram incubadas em tripsina 0,05% com EDTA 0,02% e BSA 0,2% em HBSS durante 20 minutos a 37 ° C. </li><li> Tripsinização foi parado por um volume igual de 1 mg / ml inibidor de tripsina de soja (Sigma # T6522) em HBSS. </li><li> Digere o tecido foram dissociadas utilizando várias rodadas de trituração com pipetas Pasteur-fogo polido. </li><li> Células foram lavadas uma vez com BSA 0,2% em HBSS e banhado em 50.000 células / ml em laminina revestido lamínulas em meios com 20 ng / EGF ml, 10 ng / ml FGF2 (R &amp; D Systems ou Peprotech), e 2 ug / heparina ml ( Sigma). </li></ol>

<ol><li>Currle, D., Cheng, X., Hsu, C., Monuki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+and+indirect+roles+of+CNS+dorsal+midline+cells+in+choroid+plexus+epithelial+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Direct and indirect roles of CNS dorsal midline cells in choroid plexus epithelial formation.</a> Development. 132 (15), 3549-3559 (2005).</li>
<li>Flanagan, L., Rebaza, L., Derzic, S., Schwartz, P., Monuki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+human+neural+precursor+cells+by+laminin+and+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins.</a> J Neurosci Res. 83, 845-856 (2006).</li>
</ol>

Grandes avanços em nossa compreensão do CNS desenvolvimento e biologia das células estaminais tem sido possível graças a nossa capacidade de colheita, isolar e cultivar células-tronco embrionárias neural. Este vídeo demonstra a dissecação de E12.5 córtex cerebral do rato e da desagregação e posterior cultivo de células-tronco embrionárias neural. Muitos outros outros métodos semelhantes têm sido empregada com sucesso por outros pesquisadores.

<table><tbody><tr><td>Tesoura de íris reta</td><td>Ferramenta</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-11</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura média</td><td>Ferramenta</td><td>Fine Science Tools</td><td>15024-10</td><td></td></tr><tr><td>Microtesoura</td><td>Ferramenta</td><td>Fine Science Tools</td><td>15002-08</td><td></td></tr><tr><td>Pinça curvada</td><td>Ferramenta</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr></tbody></table>

cultura de rato precursores das células-tronco neurais

Culture of Mouse Neural Stem Cell Precursors

Culturas primárias de células-tronco neurais são úteis para estudar os mecanismos subjacentes ao desenvolvimento do sistema nervoso central. Pesquisas com células-tronco vai aumentar a nossa compreensão do sistema nervoso e pode permitir-nos desenvolver tratamentos para doenças atualmente incuráveis ​​cérebro e lesões. Além disso, as células-tronco devem ser usados ​​para pesquisa com células-tronco que visam o estudo detalhado dos mecanismos de diferenciação neural e transdiferenciação e os sinais genéticos e ambientais que a especialização da direta das células em tipos de células particular. Este vídeo demonstra uma técnica utilizada para desagregar as células embrionárias a partir do dia cérebro anterior dorsal 12,5 mouse. O procedimento inclui a colheita dissecção E12.5 embriões de camundongos a partir do útero, eliminando a &quot;pele&quot; com finas pinças de dissecação e, finalmente, isolando partes do córtex cerebral. Após a dissecção, o tecido é digerido e mecanicamente dissociados. As células são então ressuspenso dissociada cultivadas em &quot;células tronco&quot; de mídia que favorece o crescimento de células-tronco neurais.

Este vídeo descreve o método utilizado para o isolamento de neuroprecursors desenvolvimento do córtex de ratos embrionárias. O procedimento para a remoção de embriões do útero, dissecando o tecido cortical, e digerindo o córtex cerebral isolado é mostrado.

Cultura de rato precursores das células-tronco neurais

Culturas primárias de células-tronco neurais são úteis para estudar os mecanismos subjacentes ao desenvolvimento do sistema nervoso central. A pesquisa com células-tronco aumentará...

Então, esta é a primeira etapa no isolamento, dissociação e cultivo de células precursoras neurais. Primeiro, vou revestir uma placa de 24 poços. Ela não é tratada para cultura de tecidos.Vou revestir com laminina para que as células aderem. Primeiro, vou revestir com uma mistura de água e poli-L-lisina. Vou adicionar cerca de 450 microlitros por poço.Então, vou apenas, já recobri metade da placa, estas duas linhas aqui, com a solução de poli-D-lisina. E vou incubar por cinco minutos à temperatura ambiente, apenas nesta câmara de fluxo laminar aqui. Portanto, já está incubando há cinco minutos.Vou apenas remover a solução de PDL com uma bomba de vácuo aqui. Ação da bomba de vácuo. Agora vou enxaguar as cavidades com água novamente, cerca de 450 microlitros.Realmente sem tempo de incubação para a lavagem com água. Vou apenas prosseguir e aspirar a água. Agora vou adicionar a solução de laminação.O laminado foi dissolvido no meio EM a dois microgramas por mililitro. Então, vou adicionar 450 microlitros da solução de laminado a cada um; bem, no momento estou revestindo plástico. Você também poderia ter revestido lamínulas nestas placas.Vou incubar as células a 37 graus em uma incubadora de cultura de tecidos por pelo menos quatro horas. Então, tenho duas pinças finas dobradas em um ângulo de 45 graus. Também tenho uma tesoura fina dobrada em um ângulo de 45 graus.Algumas pinças rombudas apenas para a dissecção inicial do útero e uma tesoura grande para cortar na fêmea. Muito bem, esta é uma CD1, fêmea normal. Ela está grávida com embriões de dia 12 e meio de desenvolvimento embrionário.Já realizei a eutanásia utilizando asfixia com CO2 seguida de fratura cervical. Agora, vou remover o útero e, posteriormente, os embriões. Primeiramente, preciso desinfetar a região do abdômen com etanol 70%.Com minha pin&ccedil;a grande, seguro o abd&ocirc;men dela na metade inferior, fa&ccedil;o um corte, coloco meus instrumentos para baixo e simplesmente rasgo a pele, expondo novamente o abd&ocirc;men, segurando no mesmo local. Fa&ccedil;o outro corte no meio e corto lateralmente, abrindo a f&ecirc;mea. Agora estou expondo os embri&otilde;es.Aqui está o útero dela, inchado com embriões. Então faço o primeiro corte logo abaixo dos ovários, retiro a gordura no caminho e puxo para cima. Coloco esse lado para baixo e seguro apenas entre os embriões.Obviamente, agarrar por cima dos embriões pode danificar o tecido. E isso é evidente. Eles parecem uma fileira de uvas.Segure entre as uvas, novamente, cortando acima do ovário no outro lado e retire a gordura. O corte final será feito aqui no meio. Novamente, estou removendo a gordura.Aqui está o útero com embriões. Meu meio de dissecação é PBS com 0,6% de glicose e penicilina-estreptomicina. Primeiro, vou apenas enxaguar os embriões no meio de dissecação para remover o sangue.Então, minha dissecação está limpa. Vou cortar ao longo do comprimento do útero, no lado oposto ao da gordura, para expor os embriões. Onde está a gordura?Está do outro lado porque você não consegue vê-lo. Portanto, há um embrião exposto aqui. Posso mostrar como isso se parece ao microscópio.Então, assim é como fica sob o microscópio. Vou cortar ao longo deste lado do útero. Do lado oposto, a gordura.Veja a gordura aqui, consigo ver a gordura de fato. Então vou apenas cortar ao longo da parte superior, por todo o comprimento. E você pode ver que os embriões sairão à medida que eu continuar descendo pelo útero.Um pouco mais ao norte. Ah, ali está um. Deslumbrante. Então você está cortando ao longo do lado oposto ao embrião gordo, que está apenas saindo.Sim, todos são. Alguns aqui que você precisa voltar às vezes e abrir algo, caso tenha perdido. Então, isso é o âmnio ou é o córion e o, isso é o córion.O âmnio está, está no interior, está intimamente associado ao embrião. Veja, você realmente não consegue ver o âmnio a partir daqui. Assim que eu retirar o embrião, você vai ver, posso perceber que estes são menores e não vou usar esses.Mas, então, estão todos os embriões expostos. Agora tenho os embriões expostos aqui. Vou remover as camadas ao redor do embrião e, em seguida, transferir o embrião para um recipiente limpo para a dissecação fina.Então há a primeira camada. Depois que eu a removo, normalmente procuro o cordão umbilical. Esse é um tecido bastante resistente.E eu consigo realmente levantar o animal com o cordão umbilical. É isso aí mesmo. Você pode apontar para ele?Sim, bem ali. Veja só, sim, o vaso vermelho, aquela estrutura. Sim. Então, isso é o cordão umbilical, que se prende ao abdômen, e eu normalmente apenas enfio a mão e o pego.Agora vamos lá. Então, agora vou remover a pele da cabeça do embrião. Isso expõe o córtex cerebral, que é de onde colherei as células.Então, com a minha mão esquerda, vou apenas perfurar a parte traseira do embrião para segurá-lo assim. Estou segurando-o contra o fundo da placa. Vou entrar com a minha mão direita, com a pinça sob o olho, subindo sob a pele, perfurando-a e, em seguida, rasgando-a.Agora tenho uma borda aqui que posso segurar. Ok. Em seguida, com os outros quatro passos, seguro a borda oposta e retiro a pele, e normalmente o mesênquima subjacente vem junto com ela. Agora vocês podem ver o hemisfério direito exposto em direção ao norte.Vou virar o embrião e tentar encontrar outra borda para segurar. Então há outra borda da pele. Vire-o, continue a descascar.Aí está. Expondo o córtex cerebral. Agora vou simplesmente pinçar a cabeça, o que me permitirá obter uma posição melhor para remover partes do córtex cerebral.Então eu simplesmente pinço com minha pinça, esfrego com a outra pinça por baixo, cortando-o completamente. E esta é uma vista dorsal. Aqui você pode ver uma vista dorsal do prosencéfalo, os dois hemisférios do córtex cerebral, o diencéfalo e, em torno dessa região, o mesencéfalo.Aqui está como se faz para retirar os fragmentos para a associação de células-tronco neurais. Agora vou segurar o embrião com minha pinça esquerda para fixá-lo desta maneira, proporcionando uma boa posição e ângulo para recortar fragmentos do córtex.Agora, com minhas tesouras finas, entro e corto o córtex cerebral anterior assim. Deixo um orifício para poder fazer meu corte lateral e faço um corte próximo à linha média dorsal, mas evito as células da linha média, tentando isolar os precursores neurais ou precursores neurais que estão no córtex. Então, esta é uma peça do córtex cerebral.E como você pode ver, há um espessamento aqui no lado direito. Na verdade, isso é o início da eminência GIC lateral, que em nossa preparação não queremos, já que estamos interessados nas precursoras do córtex dorsal. Então vou simplesmente seguir em frente e remover isso.Estou deixando apenas células do córtex dorsal. Agora vou passar para o outro lado. Mesmo método.É um pouco mais desconfortável porque sou destro, mas novamente, faça o corte anterior, coloque a tesoura no orifício. Corte ao longo do lado dorsal, lado lateral. Desta vez, tentarei evitar a evidência da gangue maníaca.Então, aqui estão os dois fragmentos provenientes dos hemisférios do córtex dorsal. Agora vou usar uma ponteira de pipeta P1000 cortada para transferir os córtices para um tubo cônico de 15 ml que contém meio de dissecação, onde permanecerão enquanto eu dissecar o restante da ninhada. Vou apenas aspirar um fragmento agora.Agora estou transferindo os córtices da placa para o tubo cônico de 15 mL que contém o meio de dissecção, onde permanecerão enquanto eu dissecar o restante da ninhada. Dissequei toda a ninhada e agora vou aspirar o meio de dissecção em excesso, deixando uma pequena quantidade de líquido e os córtices. Agora vou adicionar cerca de 500 microlitros de Trix e EDTA, colocando o tubo em banho-maria a 37 graus por 20 minutos.Após a incubação de 20 minutos, adiciono 500 microlitros de inibidor de tripsina de soja. Agora vou dissociar mecanicamente as células usando uma pipeta de Pasteur com o orifício muito pequeno e polido com chama. Não quero introduzir muitas bolhas de ar, mas, se isso acontecer, também não há problema.Você sobe e desce cerca de cinco a dez vezes e as células devem se dispersar em uma nuvem. Agora vou centrifugar as células a 1000 RPM, a 25 graus, durante um minuto. Após a centrifugação, removerei o líquido em excesso por aspiração, deixando um pequeno pellet, que é mal visível.Parece um pequeno esfregaço de SA na parte inferior deste tubo cônico. Acredito que apenas uma pequena quantidade de líquido, tomando muito cuidado para não aspirar o pellet. Obviamente, agora estou adicionando solução de lavagem ao pellet.Ok, outra centrifugação a mil RPM, 25 graus por um minuto. Novamente, vou aspirar o líquido em excesso, deixando apenas o pellet celular e uma quantidade muito pequena de líquido após a aspiração. Vou adicionar o meio de crescimento desejado com os fatores de crescimento.Obviamente específico ao experimento de cultura, o volume que vou adicionar depende de quantos embriões dissecuei e de qual idade eles são. Assim, normalmente, para uma ninhada inteira de embriões E12 e meio, pode-se adicionar cerca de 700 microlitros. Para isso, vou adicionar cerca de 300 microlitros para concentrar um pouco mais minhas células. Retirar minha placa revestida com laminina do incubador.Já se passaram pelo menos quatro horas. Agora vou aspirar o meio laminado. E agora vou fazer uma lavagem com o meu meio de crescimento.Estou lavando com cerca de 300 microlitros e vou aspirar e adicionar 400 microlitros do meio de crescimento. Contei minhas células utilizando um citômetro Hema e vou semear cerca de 100.000 células por poço nesta placa de 24 poços.Cada experimento exige um número diferente de células por poço. Para o meu ensaio específico, 100.000 células têm funcionado bem. Colocarei as células no incubador de cultura de tecidos, a 37 graus e 5% de CO₂, e deixarei em cultura por aproximadamente um dia.Eles aderirão ao laminado e se espalharão após 24 horas. Vou adicionar os fatores de crescimento desejados para o meu ensaio específico.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Aqui nós mostramos o nosso método para isolar do mouse epidérmicas células da crista neural haste (EPI-NCSC). Técnica envolve a micro-dissecando folículos bigode, isolando o bojo e placeing-lo em cultura de tecidos. EPI-NCSC começam a emigrar a partir de explantes saliência para o substrato dentro de 3-4 dias.

Rato Epidérmico Neural Stem Cell Crest (EPI-NCSC) Culturas

Este protocolo de vídeo demonstra a aplicação do ensaio neurosphere para o isolamento e expansão de células-tronco neurais do eminências ganglionares do dia 14 de embriões de rato-cérebro.

Estabelecer embrionárias de rato Cultura de Células-tronco neurais utilizando o ensaio Neurosphere

Isolamento de crista neural embrionário a partir do tubo neural facilita o uso...

Isolamento e cultivo de células da crista neural do tubo neural embrionário murino

Este vídeo demonstra um protocolo detalhado para isolar as paredes laterais do ventrículo do cérebro de camundongo adulto e realizar a dissociação enzimática do tecido para obter células únicas. Essas células são então submetidas a condições específicas de cultura que aumentam seletivamente a proliferação de células-tronco neurais e promovem sua diferenciação em co-culturas de oligodendrócitos e astrócitos.

Obtenção de uma cultura mista de oligodendrócitos e astrócitos a partir de células-tronco neurais de camundongos adultos

Este vídeo demonstra um método para a geração in vitro de células progenitoras neurais (NPCs) a partir de células-tronco embrionárias de camundongos (mESCs). As mESCs são cultivadas em suspensão para formar corpos embrióides (EBs), que são então guiados para se diferenciar em NPCs por meio de tratamento com ácido retinóico em uma cultura aderente.

Uma técnica para gerar células progenitoras neurais a partir de células-tronco embrionárias de camundongos

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para a produção simultânea de culturas de células precursoras neurais, quer como monocamadas aderentes ou neuroesferas, a partir da zona subventricular e giro dentado de ratinhos adultos individuais.

Um rato, duas culturas: isolamento e cultivo de células-tronco neurais Adulto de as duas zonas neurogênica Individual Ratos

Este protocolo descreve em detalhes o método para gerar progenitores neurais a partir de células-tronco embrionárias usando um método de monocamada sem soro. Esses progenitores podem ser usados para derivar tipos de células neurais maduras ou para estudar o processo de especificação neural e são passíveis de escalonamento de formato multipoço para triagem de compostos.

Diferenciação Neural of Mouse Células-Tronco Embrionárias em soro livre de cultura em monocamada

O estabelecimento de sistemas de cultura para a expansão de células-tronco neurais adultas (aNSCs) permite o exame e a aplicação de aNSCs para terapia. A zona subcalosa (SCZ) foi recentemente reconhecida como uma nova região formadora de neuroblastos em camundongos adultos. Aqui, são descritos métodos para o isolamento, expansão e diferenciação de SCZ-aNSCs.

Isolamento e Cultura de células estaminais adultas neurais do Subcallosal Zona Rato

Aqui, apresentamos uma nova técnica microcirúrgica para o isolamento de células-tronco neurais da Eminência ganglionar embrião de rato E13 .

Isolamento e cultura de células-tronco neurais embrionárias de rato

Descrevemos o procedimento para a diferenciação in vitro de células-tronco embrionárias do rato em células neuronais usando o método de queda de suspensão. Além disso, realizamos uma análise fenotípica abrangente através do RT-qPCR, imunofluorescência, RNA-seq e citometria de fluxo.

Diferenciação e caracterização de progenitores neurais e neurônios de células-tronco embrionárias do rato

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