Purificação da população de células específicas de separação de células de fluorescência Ativado (FACS)

Olá, sou Hope Campbell, especialista em citometria de fluxo do Instituto de Pesquisa Sanguínea do Centro de Sangue do Wisconsin. Olá, sou STR Baso, estudante de pós-graduação no laboratório da Dra. Bonnie Dieter. Também estou no Instituto de Pesquisa Sanguínea do Centro de Sangue do Wisconsin.

Hoje vamos realizar um procedimento de isolamento de células utilizando a triagem de células ativada por fluorescência. Utilizamos este procedimento em laboratório para estudar a função de linfócitos e populações de células mieloides. Vamos começar.

Neste procedimento, linfócitos B e T CD4 serão purificados a partir de linfócitos de camundongo. O número inicial de células-alvo deve ser calculado com base na quantidade de células necessária e na taxa de recuperação da máquina utilizando este método. A taxa de recuperação típica para linfócitos B e T CD4 é de 85 a 90%. A população inicial de linfócitos de baço (SP) é composta aproximadamente por 60 a 70% de linfócitos B e 20 a 30% de linfócitos T.

Assim, se você começar com 100 vezes 10 elevado a seis células, será capaz de recuperar de 50 a 60 milhões de células B e de 20 a 30 milhões de células T antes do início dos procedimentos. As soluções e reagentes necessários para o protocolo devem ser colocados no gelo. Estes incluem tampão de marcação composto por solução salina tamponada com fosfato contendo 3% de soro fetal bovino, tampão de suspensão composto por 25 milimolares de HEPES preparado em solução salina balanceada de Hank ou HBSS contendo 3% de soro fetal bovino, uma solução de 25 milimolares de hep B preparada em soro fetal bovino, anticorpos de marcação e microesferas para compensação.

Este protocolo também requer os seguintes materiais e reagentes. Tubos cónicos de 15 mililitros, tubos de fluxo de poliestireno ou polipropileno de 12 por 75 milímetros. Uma peneira de nylon, trien azul e um citômetro de hemácias devem também ser preparados com antecedência para realizar este procedimento.

Adicione 300 microlitros da solução de FCS de HEPES aos tubos de fluxo ou um mililitro da solução de FCS de HEPES a tubos cónicos de 15 mililitros. Estes devem ser colocados no gelo até o início do processo de coleta. Comece gerando uma suspensão de células individuais da população celular desejada.

Se as células isoladas com este procedimento forem cultivadas, todo o preparo celular deve ser realizado em uma câmara de cultura de tecidos. Utilizando técnica estéril, lave as células uma vez adicionando tampão de marcação gelado e ressuspenda-as invertendo o tubo várias vezes.

Em seguida, centrifugue as células por sete a oito minutos a aproximadamente 250 ×g e 4 °C. As condições de lavagem podem variar conforme o tipo e a concentração de células. Para citos, lave até 200 × 10⁶ células com 10 mililitros de tampão de marcação.

Remova cuidadosamente o sobrenadante por aspiração, de modo que o pellet celular permaneça intacto. Em seguida, re-suspenda as células em tampão de marcação gelado numa concentração de até 50 vezes 10 à sexta por 100 microlitros. Re-suspenda o pellet celular agitando levemente o tubo ou fazendo uma vortexagem suave.

Em seguida, transfira de 0,25 a uma vez 10⁶ células para um novo tubo de fluxo de 12 por 75 milímetros de poliestireno ou polipropileno sobre gelo. Reserve este tubo para uso posterior como amostra controle não corada. Ao primeiro tubo, adicione anticorpos primários à suspensão celular para atingir a concentração final desejada. Neste caso, são utilizados anticorpos anti-CD20 conjugados com PE Texas Red para colorir as células B, enquanto anticorpos anti-TCRβ conjugados com ZI e/ou anticorpos anti-CD4 conjugados com 700 são utilizados para colorir as células T, misturando-se ao bater levemente na base do tubo ou por agitação suave.

Vortexe e, em seguida, coloque as células no gelo e incube no escuro por 20 a 30 minutos. Após a incubação, lave as células marcadas por ressuspensão, suspendendo-as em 10 mililitros de tampão gelado, e centrifugue como antes, após a remoção cuidadosa do sobrenadante. Repita este passo para lavar as células uma segunda vez.

Por fim, ressuspenda as células no tampão de suspensão gelado. Se os anticorpos primários não estiverem diretamente conjugados a um fluoróforo, adicione anticorpos secundários marcados ou estreptoavidina conjugada à suspensão celular e, novamente, incube as células no gelo, no escuro, por 20 a 30 minutos após a incubação. Lave as células duas vezes com tampão de suspensão gelado.

Após ressuspender as células em tampão de suspensão gelado, determine a concentração e a viabilidade celular utilizando um corante vital, como azul de tripano, e um hemocitômetro. Ajuste a concentração celular para 10 a 20 vezes 10⁶ células por mililitro, adicionando tampão de suspensão, a fim de evitar o entupimento do equipamento com aglomerados de células que podem ter morrido durante o isolamento.

Procedimento e coloração. Filtre as células através de um funil com peneira imediatamente antes de iniciar o protocolo de separação. O tamanho dos poros da peneira deve ser escolhido conforme o tipo celular; para citócitos, utiliza-se uma peneira com poros de 40 micrômetros.

Colete as células filtradas em um tubo cônico de 15 litros ou em tubos de fluxo de 12 por 75 milímetros, dependendo do volume. Coloque as células no gelo enquanto o citômetro é preparado para o procedimento de separação. Se estiver usando microesferas de compensação da BD como controles positivos monocromáticos, prepare um tubo controle para cada cor utilizada no ensaio, além de um tubo controle negativo não corado.

Após agitar vigorosamente as suspensões de microesferas, adicione uma gota de cada suspensão de microesferas, negativa e positiva, a 100 microlitros de tampão de suspensão para cada cor utilizada e para o controle negativo. Em seguida, adicione um microlitro do anticorpo marcado a cada tubo de controle positivo. Neste experimento, um tubo é preparado utilizando anticorpos PE Texas'Red B dois 20.

Um com anticorpos anti-ETCR beta e outro com anticorpos anti-CD4 700 lor, misturados agitando suavemente a base dos tubos, e incubados por 15 a 30 minutos no escuro, à temperatura ambiente. Lave as microesferas uma vez com dois mililitros de tampão de marcação e centrifugue a 200 ×g por 10 minutos. Remova o sobrenadante por aspiração e reconstitua o pellet de microesferas em 200 a 500 microlitros de tampão de marcação.

A configuração do buffer do citômetro de fluxo varia conforme o fabricante e deve ser realizada apenas por pessoal devidamente treinado. O procedimento de separação celular aqui descrito será realizado utilizando o BD defects aria. Antes da separação, selecione o bico apropriado conforme o tipo celular a ser separado.

Os tamanhos disponíveis para a cânula são 70 micrômetros, 100 micrômetros e 130 micrômetros. O tamanho da cânula deve ser pelo menos três vezes maior que o da célula a ser classificada; para linfócitos, seleciona-se a cânula de 70 micrômetros. A classificação asséptica de células pode ser realizada utilizando a opção de classificação asséptica do instrumento.

Utilizando esta opção, todo o percurso do fluxo de revestimento é descontaminado com etanol 70% de acordo com as instruções do fabricante. Certifique-se de substituir os filtros do revestimento e de substituir o PBS por PBS estéril. Uma vez que o citômetro esteja pronto para uso, coloque os tubos de coleta pré-resfriados contendo alto teor de SBF no dispositivo de coleta apropriado.

Os dispositivos de coleta disponíveis podem acomodar até dois tubos cónicos de 15 mililitros, quatro tubos de 12 por 75 milímetros ou quatro microtubos. Utilize tubos de 12 por 75 milímetros para coletar menos de 1,5 vezes 10 à sexta células e tubos cónicos de 15 mililitros para coletar entre 1,5 vezes 10 à sexta e 4,5 vezes 10 à sexta células.

Coloque o dispositivo de coleta apropriado na câmara de coleta de separação. Direcione os fluxos laterais para o dispositivo de coleta instalado para separações multicoloridas. O citômetro deve primeiro ser calibrado para compensar a sobreposição espectral entre os detectores.

O exemplo mostrado aqui ilustra a sobreposição entre os espectros de emissão de fit E e PE. Essa sobreposição, indicada na área sombreada escura, é chamada de spillover. Neste caso, o spillover de PE seria detectado no canal de fit E e o spillover de fit E seria detectado no canal de PE.

Esse vazamento deve ser corrigido para eliminar a fluorescência residual de um corante em outro canal. O processo de correção do vazamento é chamado compensação, necessário para realizar a compensação manual. Utilize um software de citometria para configurar um modelo que inclua um gráfico bivariado para exibir a dispersão frontal (FSC) e a dispersão lateral (SSC) e um histograma para cada fluoróforo que será utilizado.

O método para configurar esses gráficos varia conforme o software. Coloque o tubo de controle negativo na porta de carregamento do citômetro e inicie a aquisição de dados enquanto a amostra estiver em execução. Ajuste o FSC e o SSC para posicionar a população de interesse na escala adequada.

Em seguida, ajuste as configurações do PMT de fluorescência para posicionar a população negativa ou autofluorescência na porção extrema esquerda do histograma. Registre o tubo controle negativo. Remova o tubo controle negativo do porta-tubos do citômetro e substitua-o pelo primeiro tubo de controle positivo com.

Agora inicie a aquisição. Repita este processo para cada um dos tubos controle positivo, registrando os dados de cada tubo. Para cada controle positivo, desenhe um intervalo ou caixa ao redor dos eventos registrados no histograma.

Em seguida, desenhe outro portão de intervalo na porção negativa do histograma. Ao realizar a compensação manual, leve em consideração cada fluoróforo utilizado no experimento ajustando a mediana dos positivos até que esta seja igual à mediana dos negativos. Para ajustar a mediana, modifique os valores de sobreposição espectral, aumentando ou diminuindo-os até que as medianas de cada parâmetro fluorescente coincidam o mais próximo possível.

Usando as configurações estabelecidas com as amostras de controle positivo e negativo, prepare-se para o procedimento de separação determinando as configurações de porte para a amostra experimental. Coloque o tubo de células a serem separadas na porta de carregamento do citômetro e inicie a aquisição usando uma velocidade de nove a dez mil eventos por segundo. Selecione um gráfico de dispersão para exibir a dispersão para frente versus a dispersão lateral.

A dispersão direta é um indicador geral do tamanho celular e é colocada no eixo X, enquanto a dispersão lateral é um indicador da granularidade celular e é colocada no eixo Y. Agora, delimite a população de interesse. Uma vez determinadas as janelas, verifique se a temperatura da porta de carregamento do citômetro está ajustada a quatro graus Celsius.

Em seguida, coloque o tubo da amostra experimental na porta de carregamento. Pressione a opção de classificação e inicie a aquisição; os tubos de coleta devem ser colocados sobre gelo à medida que forem sendo preenchidos. Continue a classificação até que o número desejado de células tenha sido coletado ou até que o tubo da amostra esteja vazio.

Em seguida, interrompa a classificação selecionando novamente o botão de classificação e remova a amostra do porto de carregamento. A seguir, coloque o tubo de coleta diretamente sobre o porto de carregamento do citômetro e adquira de 500 a 1000 eventos. Utilizando as mesmas configurações empregadas na classificação de células T, o procedimento de classificação aumentou a pureza de 21 para 99%. Para células B, a população inicial de células B de 5% foi aumentada para 98% após a classificação.

Portanto, acabamos de mostrar como purificar populações de células B e T a partir de leucócitos por citometria de fluxo. Lembre-se, a citometria de fluxo pode ser utilizada para purificar qualquer população celular, desde que uma suspensão de células únicas possa ser gerada e os anticorpos apropriados estejam disponíveis. Além disso, células marcadas geneticamente com marcadores fluorescentes podem ser facilmente purificadas sem o uso de anticorpos.

Além disso, lembre-se sempre de utilizar os controles adequados para seus experimentos e verifique sempre a configuração do laser de citometria de fluxo para garantir que você esteja usando os fluorocromos corretos e certifique-se de utilizar portas apropriadas, de modo que envolvam adequadamente suas populações. É isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.