Purificação da população de células específicas de separação de células de fluorescência Ativado (FACS)

Olá, sou Hope Campbell, especialista em citometria de fluxo do Blood Research Institute no Blood Center of Wisconsin. Olá, sou STR Baso, um estudante de pós-graduação no laboratório da Dra. Bonnie Dieter. Também estou no Instituto de Pesquisa de Sangue do Hemocentro de Wisconsin.

Hoje vamos fazer um procedimento de isolamento de células usando classificação de células ativadas por fluorescência. Usamos esse procedimento em laboratório para estudar a função de linfócitos e populações de células mieloides. Vamos começar.

Neste procedimento, quatro células T B e CD serão purificadas de citos de camundongos. O número inicial de células-alvo deve ser calculado com base no número de células necessárias e na taxa de recuperação da máquina usando este método. A taxa de recuperação típica para células T B e CD quatro é de 85 a 90% A população inicial de citos SP é de aproximadamente 60 a 70% de células B e 20 a 30% de células T.

Assim, se você começar com 100 vezes 10 elevado a seis células, poderá recuperar de 50 a 60 milhões de células B e 20 a 30 milhões de células T antes de começar os fatos. As soluções e reagentes necessários para o protocolo devem ser colocados em gelo. Isso inclui tampão de coloração consistindo de solução salina tamponada com fosfato com tampão de suspensão de soro de bezerro fetal a 3% consistindo de HEPs de 25 milimolares preparados em solução salina balanceada de Hank ou HBSS contendo soro de bezerro fetal a 3% de solução de hepatite B de 25 milimolares preparada em soro de bezerro fetal, anticorpos de coloração e contas de compensação.

Este protocolo também requer os seguintes suprimentos e reagentes. Tubos cônicos de 15 mililitros, tubos de fluxo de poliestireno ou polipropileno de 12 por 75 milímetros. Um filtro de células de náilon trien blue e um hemocitômetro classificando os tubos de coleta também devem ser preparados com antecedência para fazer isso.

A 300 microlitros da solução he's FCS para tubos de fluxo ou um mililitro da solução HEPs FFC S para tubos cônicos de 15 mililitros. Estes devem ser colocados no gelo até o início do processo de coleta. Comece gerando uma única suspensão celular da população de células desejada.

Se as células isoladas, usando este procedimento serão cultivadas. Toda a preparação celular deve ser realizada em uma coifa de cultura de tecidos. Usando a técnica estéril, lave as células uma vez adicionando tampão de coloração a frio e suspendendo novamente as células invertendo o tubo várias vezes.

Em seguida, centrifugue as células por sete a oito minutos a cerca de 250 GS a quatro graus Celsius. As condições de lavagem podem variar de acordo com o tipo e a concentração da célula. Para citos, lave até 200 vezes 10 para as seis células com 10 mililitros de tampão de coloração.

Remova cuidadosamente o sobrenadante por aspiração para que o pellet celular permaneça intacto. Em seguida, ressuspenda as células em tampão de coloração gelada a uma concentração de até 50 vezes 10 elevado a sexto por 100 microlitros. Ressuspenda o pellet celular sacudindo ou agitando suavemente o tubo.

Em seguida, transfira 0,25 a uma vezes 10 das seis células para um novo tubo de fluxo de poliestireno ou polipropileno de 12 por 75 milímetros no gelo. E deixe isso de lado para usar mais tarde como a amostra de controle não corada para o primeiro tubo, adicione anticorpos primários à suspensão celular para atingir a concentração final desejada. Aqui, os anticorpos anti B dois 20 conjugados vermelhos do PE Texas são usados para corar as células B, enquanto os anticorpos anti TCR R beta e 700 anti CD quatro conjugados ZI são usados para corar as células T misturadas sacudindo o fundo do tubo ou pela luz.

Em seguida, coloque as células no gelo e incube no escuro por 20 a 30 minutos. Após a incubação, lave as células marcadas com Resus, suspendendo-as em 10 mililitros de suspensão gelada, tampão e centrifusão como antes, após remoção cuidadosa do sobrenadante. Repita esta etapa para lavar as células uma segunda vez.

Finalmente, ressuspenda as células em suspensão gelada Tampão. Se os anticorpos primários não forem diretamente conjugados a um fluoro quatro, adicione anticorpos secundários marcados ou AVID estreptocócico em conjugado à suspensão celular e, novamente, incube as células no gelo no escuro por 20 a 30 minutos após a incubação. Lave as células duas vezes com tampão de suspensão gelado.

Após a suspensão das células em tampão de suspensão gelada. Determine a concentração e a viabilidade celular usando um corante vital, como azul trian e hemocitômetro. Ajuste a concentração de células para 10 a 20 vezes 10 elevado à sexta célula por mililitro, adicionando tampão de suspensão para evitar entupir a máquina de fax com aglomerados de células que podem ter morrido durante o isolamento.

Procedimento e coloração. Filtre as células através de um filtro de gotejamento imediatamente antes de iniciar o protocolo de classificação. O tamanho dos poros do filtro deve ser escolhido dependendo do tipo de célula, para citos é usado um filtro com um tamanho de poro de 40 micrômetros.

Colete as células filtradas em um tubo cônico de 15 litros ou tubos de fluxo de 12 por 75 milímetros, dependendo do volume. E coloque as células no gelo enquanto o citômetro é configurado para o procedimento de classificação. Se estiver usando contas comp BD como controles positivos de cor única, prepare um tubo de controle para cada cor usada no ensaio mais um tubo de controle negativo não corado.

Depois de vórtice completo as suspensões de talão, adicione uma, solte cada uma das suspensões de talão negativo e positivo em um buffer de suspensão de 100 microlitros para cada cor usada e o controle negativo. Em seguida, adicione um microlitro do anticorpo marcado a cada tubo de controle positivo. Neste experimento, um tubo é preparado usando PE Texas'Red B dois anticorpos 20.

Um usando anticorpos beta ETCR fit e outro usando anticorpos lor 700 CD quatro misturados sacudindo o fundo dos tubos e incubar por 15 a 30 minutos no escuro à temperatura ambiente. Lave as contas uma vez com dois mililitros de coloração, tampão e centrifugue a 200 Gs por 10 minutos. Remova o sobrenadante por aspiração e ressuspenda o grânulo em 200 a 500 microlitros de coloração.

A configuração do tampão do citômetro de fluxo varia dependendo do fabricante e só deve ser realizada por pessoal devidamente treinado. O procedimento de classificação de células aqui será realizado usando a ária de defeitos BD. Antes de classificar, selecione o bico apropriado, dependendo do tipo de célula a ser classificada.

Os tamanhos disponíveis para a ária de fatos são 70 micrômetros, 100 micrômetros e 130 micrômetros. O tamanho do bico deve ser pelo menos três vezes o tamanho da célula a ser classificada para linfócitos, o bico de 70 micrômetros é selecionado. A classificação asséptica de células pode ser realizada usando a opção de classificação asséptica do instrumento.

Usando esta opção, todo o caminho da bainha é descontaminado com etanol 70% de acordo com as instruções do fabricante. Certifique-se de substituir os filtros de bainha e substituir o PBS por PBS estéril. Quando o citômetro estiver pronto para funcionar, coloque os tubos de coleta pré-resfriados contendo heaps FCS no dispositivo de coleta apropriado.

Os dispositivos de coleta disponíveis podem conter até dois tubos cônicos de 15 mililitros. Quatro tubos de 12 por 75 milímetros ou quatro microtubos. Use tubos de 12 por 75 milímetros para coletar menos de 1,5 vezes 10 para a sexta célula e tubos cônicos de 15 mililitros para coletar 1,5 vezes 10 para seis a 4,5 vezes 10 para a sexta célula.

Coloque o dispositivo de coleta apropriado na câmara de coleta de classificação. Direcione os fluxos laterais para o dispositivo de coleta instalado para classificações multicoloridas. O citômetro primeiro deve ser calibrado para levar em conta a sobreposição espectral entre os detectores.

O exemplo mostrado aqui ilustra a sobreposição entre os espectros de emissão do ajuste E e pe. Essa sobreposição mostrada na área sombreada escura é chamada de transbordamento. Aqui, o transbordamento de PE seria detectado no canal E de ajuste e seria detectado no canal de PE.

Este transbordamento deve ser corrigido para eliminar a fluorescência residual de um andar quatro em outro canal. O processo de correção do transbordamento é chamado de compensação para realizar a compensação manual. Use o software de citometria para configurar um modelo que inclua um gráfico bivariado para exibir o FSC de dispersão direta e o SSC de dispersão lateral e um histograma para cada fluro que será usado.

O método para configurar esses gráficos varia de acordo com o software. Coloque o tubo de controle negativo na porta de carregamento do citômetro e comece a aquisição de dados enquanto a amostra está correndo. Ajuste o FSC e o SSC para colocar a população de interesse em escala.

Em seguida, ajuste as configurações de PMT de fluorescência para colocar a população negativa ou a autofluorescência na parte mais à esquerda do histograma. Registre o tubo de controle negativo. Remova o tubo de controle negativo da porta de carregamento do citômetro e substitua-o pelo primeiro tubo de controle positivo.

Agora comece a aquisição. Repita este processo para cada um dos tubos de controle positivo registrando os dados de cada tubo. Para cada controle positivo, desenhe uma porta de intervalo ou caixa ao redor dos eventos registrados no histograma.

Em seguida, desenhe outra porta de intervalo na parte negativa do histograma. Ao fazer a compensação manual, leve em consideração cada fluro usado no experimento, ajustando a mediana dos positivos até que seja igual à mediana dos negativos. Para ajustar a mediana, ajuste os valores de sobreposição espectral, para mais ou para menos, até que as medianas de cada parâmetro fluorescente correspondam o mais próximo possível.

Utilizando as regulações estabelecidas com as amostras de controlo positivo e negativo, preparar-se para o procedimento de separação, determinando as regulações da marcha para a amostra experimental. Coloque o tubo de células a ser classificado na porta de carregamento do citômetro e comece a aquisição usando uma velocidade de nove a 10.000 eventos por segundo. Selecione um gráfico de pontos para exibir a dispersão direta versus a dispersão lateral.

A dispersão direta é um indicador geral do tamanho da célula e é colocada no eixo x, enquanto a dispersão lateral é um indicador da granularidade da célula e é colocada no eixo Y. Agora bloqueie a população de interesse. Uma vez que os portões tenham sido determinados, verifique se a temperatura da porta de carregamento do citômetro está ajustada para quatro graus Celsius.

Em seguida, coloque o tubo de amostra experimental na porta de carregamento. Pressione a opção de classificação e comece a aquisição Os tubos de coleta devem ser colocados no gelo à medida que são preenchidos. Continue classificando até que o número desejado de células tenha sido coletado ou até que o sample tubo está vazio.

Em seguida, pare a classificação selecionando o botão de classificação novamente e remova a amostra da porta de carregamento. Em seguida, coloque o tubo de coleta diretamente na porta de carregamento do citômetro e adquira de 500 a 1000 eventos. Usando as mesmas configurações usadas para classificação de células T, o procedimento de classificação aumentou a pureza de 21 para 99%Para células B, a população inicial de células B de 5%foi aumentada para 98%após a classificação.

Então, acabamos de mostrar como purificar a população de células b e T de citos por fax. Lembre-se, os fatos podem ser usados para purificar qualquer população de células se a suspensão de uma única célula puder ser gerada e os anticorpos apropriados estiverem disponíveis. Além disso, as células se empilham geneticamente com marcadores fluorescentes podem ser facilmente purificadas sem o uso de anticorpos.

Além disso, lembre-se sempre de usar os controles adequados para seus experimentos e sempre verifique a configuração do laser de citometria de fluxo para garantir que você esteja usando os fluorocromos corretos e certifique-se de usar as portas apropriadas para que eles estejam em torno de suas populações adequadamente. Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.