Perfil de anticorpos por sistemas de imunoprecipitação luciferase (LIPS)

Este vídeo demonstra os passos envolvidos na realização do ensaio. Antígenos são expressos em células CO uma como fusões recombinantes de luciferase de vagalume ou antígeno rook. Extratos brutos são obtidos e utilizados sem purificação.

O ensaio lips é iniciado pela incubação de extratos brutos de antígeno de rook com SRA do paciente. Em poços de microplaca, a mistura de anticorpo e antígeno é então transferida para uma placa de filtro de 96 poços contendo perlas de proteína A G para capturar moléculas de IgG após a lavagem da placa de filtro contendo as perlas de proteína AG. O antígeno de rook ligado ao anticorpo é medido pela adição de substrato linine e as unidades de luz são medidas com um luminômetro.

Olá, sou a Dra. Catherine Chang do Laboratório de Biologia Sensorial do Instituto Nacional de Pesquisa em Saúde Dental e Craniofacial. Hoje vamos mostrar o procedimento para os sistemas de imunoprecipitação de luciferase em lábios. Utilizamos o método de lábios em nosso laboratório para medir os títulos de anticorpos com o objetivo de diagnosticar doenças e/ou infecções.

Subst estratifica estados da doença, monitora vacinação e outras aplicações envolvidas na geração de perfis de anticorpos. Então, vamos começar. Antes de iniciar a transfeção, os plasmídeos para fusões de luciferase de vanilla são preparados com antecedência conforme descrito no artigo de biotecnologia do BMC.

O DNA plasmidial de BYO et al. 2005 é preparado utilizando um kit MIDI prep com um rendimento de um a três miligramas e armazenado como uma solução estoque de um miligrama por mililitro a menos 20 graus Celsius. As células Cost one utilizadas na transfeção são cultivadas em DMEM com 10% de FCS utilizando protocolos-padrão de cultura de tecidos. Um dia antes da transfeção, semeie as células Cost one em novas placas de 100 por 20 milímetros com aproximadamente duas vezes 10 à sexta potência de células por placa e incube a 37 graus Celsius no dia seguinte.

O custo de uma célula deve ser de 80 a 95% de confluência, permitindo que o reagente de transfeção do gene FU6 aqueça até a temperatura ambiente enquanto aguarda o aquecimento do gene FU. Rotule tubos microfuga de polipropileno de 1,5 mililitro para cada DNA plasmidial a ser transfectado, tomando cuidado para não tocar na parede lateral dos tubos. Adicione seis microlitros do gene de fusão FU6 aos tubos, que já devem conter 94 microlitros de meio ótimo, e incube por cinco minutos. À temperatura ambiente, adicione um a dois microgramas do plasmídeo para a construção de fusão do antígeno Luciferase, misturando mediante inversão do tubo várias vezes, centrifugue brevemente e incube à temperatura ambiente por 15 minutos.

Transfira toda a solução ótima de fusão de DNA para as células gotejando-a uniformemente no meio dos cos. Incube as células transfectadas dos cos por dois dias e, em seguida, proceda à colheita. Para iniciar a colheita da proteína de fusão, remova o meio e lave as células com seis mililitros de PBS.

Remova qualquer resíduo de PBS do recipiente de cultura celular, adicione 1,4 mililitros de tampão de lise frio e retire as células com uma espátula celular, transferindo rapidamente metade do lisado para cada um de dois tubos microcentrífuga de 1,5 mililitro sobre gelo. Um Branson SOLIDIFIER one 50 é usado para romper as células. Coloque o tubo de microcentrífuga contendo o lisado celular sobre gelo e aplique pulsos por cinco segundos.

Cinco segundos e cinco segundos. Com configurações de sonicação de dois, dois e quatro, respectivamente. Centrifugue o lisado celular a 12.500 RPM por dois minutos e quatro.

Centrifugue a quatro graus Celsius. Inverta suavemente os tubos entre as centrifugações para remover os detritos soltos aderidos à parede do tubo. Em seguida, transfira cuidadosamente o sobrenadante, sem perturbar o pellet, dos dois tubos para um novo tubo microcêntrifuga gelado.

Para medir as unidades de luz ou lu do lisado, dilua um microlitro de lisado com oito microlitros de PBS em um novo tubo microcêntrifuga, adicione diretamente 100 microlitros de um substrato de luciferina à mistura diluída e meça imediatamente a luminiscência no tubo utilizando um luminômetro de tubo com leitura de cinco segundos a partir deste passo. Lembre-se de usar precauções de segurança ao trabalhar com amostras S humanas e animais para preparar uma placa-mestre de soro, a fonte de anticorpos de pacientes para perfilagem de antígenos. Primeiro, adicione 450 microlitros do tampão A a cada poço de uma placa de microtitulação de polipropileno de 96 poços profundos.

Nesta etapa, um corante, o vermelho de fenol, também pode ser incluído no tampão A para atuar como um marcador no monitoramento de edições futuras da amostra de SRA e em outras etapas do ensaio de lips. Em seguida, adicione 50 microlitros de soro de cada amostra a cada poço contendo 450 microlitros de tampão. Observação: esta é uma diluição de um para 10 do SRA no tampão.

Normalmente, o SRA não é adicionado às duas últimas fileiras da placa-mestre porque essas são reservadas para os brancos de tampão antes de armazenar a placa-mestre para uso futuro. É agitada extensivamente por uma a duas horas em uma plataforma rotativa. A 650 RPM, o soro permanece estável por pelo menos um mês, ou mais, a quatro graus Celsius, e a placa pode ser selada com parafina para evitar evaporação, caso seja armazenada antes de realizar o ensaio de lips. Organize uma planilha contendo os números de identificação das amostras e suas respectivas fileiras na placa-mestre. Placas microtituladoras de polipropileno de 96 poços rasos são utilizadas como placas de trabalho para testar soros.

No primeiro passo, adicione 40 microlitros do tampão A em cada poço da placa de 96 poços utilizando uma pipeta micrométrica de oito canais. Em seguida, retire 10 microlitros de soro diluído da placa-mestre e adicione diretamente em cada poço da placa de trabalho utilizando uma pipeta micrométrica de oito canais. Após o uso, feche a placa-mestre com parafilm, recoloque a tampa da placa-mestre, cubra com filme plástico e armazene a quatro graus Celsius.

Em seguida, é preparada uma mistura mestra contendo o extrato antigênico de rook, de forma que um vezes 10 à sétima ul seja adicionado em 50 microlitros do tampão A a cada poço. Prepare essa mistura mestra e pipete 50 microlitros da mistura antigênica de rook para cada poço. Cubra a placa com uma tampa de poliestireno e incube em agitador rotativo a 100 rpm por uma hora.

À temperatura ambiente durante a incubação, retire um alíquota de 1,5 mililitro de uma suspensão de microesferas de proteína A-G a 30% em PBS da geladeira. Adicione cinco microlitros ao fundo de cada poço de uma nova placa de filtro HTS de 96 poços. Após a incubação da placa por uma hora, transfira os 100 microlitros da mistura de reação entre o antígeno e o anticorpo para as placas de filtro HTS de 96 poços contendo as microesferas de proteína A-G, utilizando uma micropipeta multicanal. Incube a placa de filtro de 96 poços em agitador rotatório por mais uma hora adicional a 100 RPM à temperatura ambiente.

Em seguida, lave a placa de filtração utilizando uma estação de trabalho automatizada Biome FX com um manifold a vácuo. Cada poço é lavado oito vezes com 100 microlitros de tampão A, seguido por duas lavagens com 100 microlitros de PBS. Após a última lavagem, desligue o vácuo. Remova a placa de filtração e seque-a com uma pilha de toalhas de papel ou papel filtro, certificando-se de remover a umidade da parte superior e inferior da placa. Um luminômetro de microplacas Burt hold LB960 Centro é utilizado para determinar a luminiscência em cada poço da placa.

Ligue a máquina e lave o injetor com água destilada. Durante o ciclo de lavagem do injetor, o substrato INE é usado para escorva e operação da máquina e é preparado utilizando o kit de substrato ranil da Promega, seguindo as instruções do fabricante; normalmente, são necessários seis mililitros de uma mistura de substrato por placa. Carregue a mistura de substrato no luminômetro, abra um arquivo de programa contendo as configurações para injeção do substrato e leitura da placa.

Para essas medições, 50 microlitros de substrato soine são injetados. A placa é agitada por dois segundos, seguido por uma leitura de luminescência de cinco segundos.

Inicie o programa que inicia a leitura da placa após a execução e remova imediatamente a placa de filtro microtituladora para evitar derramamento no luminômetro. Os dados são automaticamente exportados do programa microwind para um formato Excel para análise adicional. Média dos resultados de duas execuções diferentes com os mesmos soros.

Para gerar os valores de título lu para cada amostra, recomenda-se que as amostras duplicatas apresentem alta concordância entre os valores de título nas duas execuções. Para a plotagem dos dados, os valores de título lu podem ser ajustados ainda mais, subtraindo-se os brancos de tampão, conforme mostrado aqui.

A sensibilidade e a especificidade do ensaio também podem ser calculadas utilizando pontos de corte derivados da média mais três ou cinco desvios-padrão das amostras controle. Acabamos de mostrar como medir os títulos de anticorpos usando LIPS, que exige mínima otimização do ensaio e, devido à sua simplicidade, pode ser usado para gerar dados de alta qualidade em menos de duas semanas para qualquer antígeno específico. Ao trabalhar com soro humano, é importante lembrar de tomar as precauções de segurança apropriadas.

E tenha em mente que o LIPS é altamente escalonável e, por isso, pode ser usado para analisar um pequeno número de amostras com lavagem manual ou uma placa completa utilizando uma estação de trabalho robótica. Dada essa versatilidade, acreditamos que o LIPS será extremamente útil na análise soroantigênica e terá amplas implicações na análise de doenças e na saúde pública em geral. Bom, é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos de caracterização de anticorpos.