Captura Primer Extensão: Recuperação Sequence alvejado a partir de Fontes de DNA altamente degradadas

Este vídeo explica a técnica de captura por extensão de primer ou PECA, que permite a recuperação direcionada de sequências de DNA a partir de fontes de DNA altamente fragmentadas com número extremamente baixo de cópias. Utilizamos esta técnica para sequenciar genomas mitocondriais completos de ossos de neandertais com mais de 40.000 anos de idade, e o método pode ser empregado para a captura de quaisquer pequenas regiões-alvo ou polimorfismos de nucleotídeo único, provenientes de muitos indivíduos. Os principais passos deste procedimento são: amplificação por PCR de uma biblioteca primária de DNA, quantificação da biblioteca amplificada por PCR quantitativo, extensão primária no alvo, captura em microesferas dos produtos de extensão primária para remover fragmentos não alvo, e eluição e sequenciamento dos alvos capturados e lavados.

Olá, sou Adrian Briggs do laboratório de Shanti Payable, do Departamento de Genética do Instituto Max Plank de Antropologia Evolutiva em Leipzig. Hoje vamos mostrar um procedimento para isolar sequências específicas de DNA de interesse a partir de uma fonte complexa e altamente degradada de DNA, como ossos antigos. Utilizamos este procedimento para estudar a diversidade genética mitocondrial de Homo neanderthalensis ou homem de Neandertal.

Vamos começar. O DNA utilizado em nosso experimento provém de ossos de Neandertais com idade entre 40.000 e 70.000 anos, encontrados em diversos locais ao longo da distribuição geográfica dos Neandertais. Um osso é primeiramente exposto à luz ultravioleta durante a noite para descontaminar a superfície de qualquer DNA estranho.

Uma broca fina é usada para produzir entre 100 e 500 miligramas de pó ósseo. O DNA é extraído do pó ósseo utilizando um procedimento descrito no artigo de 2007 intitulado *Comparison and Optimization of Ancient DNA Extraction*, de Nadine Rohland e Michael Hofreiter. O extrato de DNA é então convertido em uma biblioteca de sequenciamento pela adição de sítios universais de ligação de adaptadores às extremidades de todos os fragmentos de DNA, pois uma biblioteca 454 gerada a partir de um osso de Neandertal contém apenas pequenas quantidades de DNA, às vezes apenas alguns picogramas. Essa biblioteca primária de DNA é primeiramente amplificada por PCR usando primers de PCR em emulsão correspondentes aos primers universais da biblioteca.

Para preparar a mistura de PCR para amplificação da biblioteca, combine os seguintes reagentes em um tubo de PCR: utilize 10 microlitros de tampão PCR 10 X GAMP, dois microlitros de cloreto de magnésio, dois microlitros de BSA, um microlitro de mistura de dNTP, três microlitros de cada um dos primers MPCR 4,54 forward e reverse, um microlitro de DNA polimerase amply gold e 25 microlitros de modelo da biblioteca. Por fim, adicione 45 microlitros de água grau PCR para obter um volume total de 100 microlitros. A DNA polimerase amply tech gold é estável à temperatura ambiente, portanto, não é necessário trabalhar com gelo.

Após preparar a reação de PCR, coloque o tubo de PCR em um termociclador iniciando com uma etapa de desnaturação a 95 graus Celsius por 12 minutos, seguida por 14 ciclos de 95 graus Celsius por 30 segundos, 60 graus Celsius por um minuto e 72 graus Celsius por um minuto. Ao final desses 14 ciclos, realize uma etapa final a 72 graus Celsius por cinco minutos, após a qual o tubo de PCR pode ser mantido indefinidamente a 10 graus Celsius até o uso, após a conclusão da amplificação por PCR, seguida pela purificação do produto de PCR utilizando uma coluna de centrifugação Kyogen MinLu de acordo com as instruções do fabricante; elua o DNA da coluna com 50 microlitros do tampão EB fornecido com o kit MinLu antes da extensão primária e captura do produto.

A PCR quantitativa deve ser realizada em alíquotas das bibliotecas não amplificadas e amplificadas para quantificar e verificar a qualidade do produto da biblioteca amplificada. A biblioteca amplificada em 14 ciclos deve conter várias milhares de vezes mais DNA do que a biblioteca primária. Caso contrário, as condições de amplificação devem ser verificadas e repetidas.

Os iniciadores de captura de extensão primária, que serão usados para capturar as sequências de interesse da biblioteca amplificada, devem ser projetados como iniciadores normais de PCR para complementar uma região alvo desejada com uma temperatura de fusão ideal de 60 graus Celsius até a extremidade cinco prima de cada uma dessas sequências alvo nesta sequência de cauda de 12 bases, e incluir um resíduo de biotina na extremidade cinco prima. Até 150 iniciadores PEC podem ser usados juntos em uma única mistura multiplex preparada a partir de estoques de 200 micromolares. Para a reação de extensão primária, prepare uma mistura de PCR em um tubo de PCR apropriado adicionando cinco microlitros de tampão PCR GAMP 10 X, dois microlitros de cloreto de magnésio, um microlitro de BSA, 0,5 microlitro de dNTPs, cinco microlitros da mistura de iniciadores de captura de extensão primária, 0,5 microlitro de DNA polimerase tack gold, dois microlitros do DNA da biblioteca amplificada em 14 ciclos e, finalmente, 31 microlitros de água grau PCR, obtendo um volume total de 50 microlitros.

Se o modelo da biblioteca amplificada contiver mais de uma vez 10 à 12ª potência cópias por microlitro, o modelo deve ser primeiramente diluído com tampão EB para que não mais de duas vezes 10 à 12ª potência cópias sejam adicionadas à mistura de reação. Após preparar o tubo de PCR, coloque-o no termociclador e configure-o para uma única corrida de reação. Inicie com uma desnaturação de 12 minutos a 95 graus Celsius, seguida por um minuto a 60 graus Celsius e cinco minutos a 72 graus Celsius para extensão primária.

E quando o ciclo único for concluído, 72 graus Celsius para manter o produto da PCR até a próxima etapa. Para evitar o emparelhamento não específico dos iniciadores e capturar diretamente 150 microlitros do tampão PBI ou PB do kit de purificação Kyogen Ute nos tubos de reação de PCR, enquanto a mistura de reação permanece no termociclador mantido a 72 graus Celsius. Fazendo isso, inativa-se a polimerase enquanto a temperatura é muito alta para a extensão não específica dos iniciadores-alvo, feche os tubos, vortexie brevemente e, em seguida, centrifugue a solução com uma centrífuga de bancada.

Utilize apenas tampão PBI ou PB nesta etapa, pois outros tampões de ligação, como o Qiagen PM Buffer, podem interferir no processo de captura subsequente. Em seguida, remova a mistura do tubo de PCR e transfira para uma coluna de centrifugação Rogen MinLu para purificação, conforme instruções do fabricante, como feito anteriormente, eluindo o DNA da coluna com 30 microlitros do tampão EB fornecido com o kit MinLu. A fim de remover todos os fragmentos que não hibridizaram com os iniciadores PEC, é realizada uma etapa de captura baseada em microesferas.

Primeiro, ressuspenda uma solução estoque de M 270 strip dividido em microesferas por meio de vortex e retire uma quantidade de microesferas equivalente a 25 microlitros por amostra. Lave as microesferas duas vezes com 500 microlitros de tampão BW duas vezes e ressuspenda no mesmo volume de BW duas vezes do volume originalmente retirado das microesferas. Prepare 25 microlitros da suspensão.

Para cada amostra, adicione 25 microlitros do DNA eluído purificado a 25 microlitros da suspensão de microesferas, reservando os cinco microlitros restantes para quantificação posterior. Misture o DNA e a suspensão de microesferas pipetando para cima e para baixo e agitando com a ponta perpet, e depois gire lentamente em um rotador de bancada durante 15 minutos à temperatura ambiente. Após a mistura, transfira o conteúdo para um novo tubo de PCR de 1,5 mililitro.

Durante a etapa anterior de incubação com rotação, algum DNA não alvo pode ter aderido à parede do tubo. Assim, transferir a suspensão de microesferas para um novo tubo evita a possibilidade de esse DNA não alvo ser liberado nos produtos finais. Durante a etapa de eluição térmica, utilize o coletor de partículas magnéticas para pelotizar as microesferas; após 10 a 20 segundos, todas as microesferas terão migrado para a parede do tubo, deixando um sobrenadante claro que deve ser removido para lavar as microesferas. Adicione 500 microlitros de tampão BW uma vez ao tubo e vortex por cerca de três segundos em velocidade baixa.

Uma vez com o tubo na posição vertical e outra com o tubo invertido, nenhum grânulo deve permanecer aderido à parede do tubo. Utilizando uma centrífuga de bancada, centrifugue a suspensão por um a três segundos, apenas o tempo suficiente para retirar todo o líquido das paredes do tubo. Retorne o tubo ao MPC e aguarde de 10 a 20 segundos até que todos os grânulos sejam coletados na lateral do tubo.

Em seguida, remova o sobrenadante SUP. A primeira lavagem está agora concluída. Repita este procedimento mais quatro vezes após a última lavagem com BW e remoção do sobrenadante.

Adicione 500 microlitros de tampão de lavagem quente uma vez. Misture a suspensão por meio de vortexagem breve e centrifugação como antes, e então agite o tubo por dois minutos a 65 graus Celsius em um agitador térmico a 1000 RPM, após uma breve centrifugação para remover traços do sobrenadante dentro de um minuto após a retirada do bloco térmico. Este passo removerá fragmentos que podem estar se ligando aos iniciadores PEC, mas que não foram alongados na etapa de extensão de iniciador. Reuspenda o pellet em 30 microlitros de tampão EB e transfira a mistura para um tubo PCR fresco de 1,5 mililitro.

Incube o tubo no ciclador térmico a 95 graus Celsius por três minutos. Pelotize as esferas no coletor de partículas magnéticas. Deve levar de 10 a 20 segundos para que o sobrenadante fique completamente límpido; remova então o sobrenadante S para um tubo novo e rotulado.

Tendo cuidado para não transferir nenhuma esfera. Mantenha o sobrenadante, que contém o produto capturado de fragmentos de DNA. As esferas podem ser descartadas nesta etapa.

Para amplificar o produto capturado, prepare uma mistura de PCR com volume total de 100 microlitros, conforme feito na parte dois, e realize as mesmas condições de ciclagem de PCR. Novamente, após a amplificação por PCR do produto capturado ser concluída, realize a purificação utilizando uma coluna de centrifugação Qiagen Ute, como anteriormente feito na seção dois, eluindo o DNA da coluna com 50 microlitros de tampão Eeb. O produto está agora pronto para sequenciamento de alto rendimento. Projetamos 574 iniciadores PEC para cobrir todo o genoma mitocondrial de Neandertal.

Dividimos esses em quatro misturas multiplex e duas rodadas seriais de captura por extensão primária em bibliotecas de cinco fósseis de Neandertal provenientes de quatro sítios na Eurásia, com idades estimadas entre 40.000 e 70.000 anos, gerando entre 170.000 e 500.000 sequências por indivíduo e alinhando os resultados a uma sequência de referência mitocondrial. Descobrimos que o procedimento de PEC havia enriquecido maciçamente o DNA mitocondrial, alcançando cobertura completa ao longo do DNA mitocondrial para cada indivíduo, com uma cobertura média entre 18 e 56,3 vezes. Com esses resultados, foi possível gerar uma sequência de genoma mitocondrial completo de alta qualidade para cada indivíduo.

Em seguida, realizamos uma comparação filogenética dessas sequências com uma amostra mundial de humanos atuais e nossos parentes vivos mais próximos, o chimpanzé e o bonobo. Isso confirmou descobertas anteriores de que o DNA mitocondrial de Neandertal está estreitamente relacionado, mas claramente distinto do DNA mitocondrial dos humanos modernos. Além disso, a comparação entre as próprias sequências de Neandertal revelou uma diversidade genética extremamente baixa nesses indivíduos, inferior à encontrada entre os humanos em todo o mundo hoje e semelhante à observada em europeus contemporâneos.

Essas evidências, combinadas com uma análise da evolução proteica nas sequências neandertais, sugerem que os neandertais tinham um tamanho populacional historicamente pequeno, o que é consistente com evidências arqueológicas indicando que a densidade populacional neandertal nunca atingiu os níveis alcançados pelos humanos modernos. Acabamos de mostrar como realizar a captura por extensão de primatas para amplificar e capturar sequências-alvo em preparação para o sequenciamento de alto rendimento. Ao seguir este procedimento, é importante respeitar todas as especificações de temperatura no termociclador, mas esteja ciente de que os iniciadores podem ter temperaturas de hibridização diferentes, de modo que você talvez precise ajustar a temperatura de hibridização conforme seus iniciadores específicos, além de ter cuidado em todos os passos de lavagem para remover o máximo possível de líquido.

Portanto, obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.