Name: Ver histórico e demonstração Fisiologia da MNJ da Muscle Opener Crayfish (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Aprenda a dissecar o músculo abridor do lagostim para estudos de fisiologia sináptica e plasticidade neuromuscular. Este método permite registrar respostas sinápticas e medir a eficácia sináptica em junções neuromusculares.

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ver histórico e demonstração fisiologia da mnj da muscle opener crayfish

Historical View and Physiology Demonstration at the NMJ of the Crayfish Opener Muscle

Aqui apresentamos algumas das descobertas chave importante feita com a preparação neuromuscular opener (MNJ) de crustáceos e mostram que ainda há muito a aprender com esta preparação modelo. Na compreensão da história pode-se entender porque até hoje essa MNJ oferece ainda um playground para ricos abordar questões sobre função de pré-e pós-sináptica e plasticidade. A viabilidade e facilidade de acesso ao terminal de eletrofisiologia intracelular, bem como extracelular e de imagem são vantagens significativas. Os mecanismos por trás da modulação da cinética de fusão vesicular e dentro dos terminais de alta e baixa de saída estão implorando para investigação. A preparação também oferece um sistema modelo testável para avaliação computacional e manipulações para examinar as principais variáveis ​​em modelos teóricos da função sináptica, por exemplo, a dinâmica do cálcio durante a curto prazo de facilitação. A complexidade sináptica da zona ativa e da natureza estatística da liberação quântica também é uma área aberta para futuras investigações tanto experimentalmente e computacionalmente.

O músculo da perna opener crustáceo é apresentado por sua importância histórica e versatilidade experimental no fenótipo muscular, fisiologia e plasticidade sináptica.

Ver histórico e demonstração Fisiologia da MNJ da Muscle Opener Crayfish

Apresentamos aqui algumas das principais descobertas realizadas com a preparação da junção neuromuscular (JNM) de crustáceos e ilustramos que existe...

Os músculos abridores obtidos da pata ambulatória de um lagostim, que são automatizados a partir do animal. Uma vez exposto o músculo, o padrão de inervação pode ser revelado por diversos procedimentos de coloração. Respostas sinápticas na forma de facilitação de curta duração são facilmente registradas a partir do músculo.Um eletrodo macro focal com placa pode ser posicionado diretamente sobre varicosidades identificadas ao longo dos terminais nervosos. Em seguida, são registradas respostas sinápticas, que podem ser utilizadas para medir a eficácia sináptica em um nível qualitativo a partir de um local definido no terminal. Olá, meu nome é Ann Cooper, do laboratório da Dra. Robin Cooper, do Departamento de Biologia da Universidade de Kentucky.Olá, sou Robin Cooper. Meu aluno e eu vamos mostrar um procedimento para dissecar o músculo abridor de lagostim e utilizá-lo para registrar respostas sinápticas com diferentes paradigmas de estimulação. Utilizamos esses procedimentos em nosso laboratório para estudar a eficácia sináptica e a relação entre a ultraestrutura sináptica e a função.Então vamos começar. Em 1879, o zoólogo TH Huxley escreveu um livro intitulado The Crayfish, que ainda é considerado hoje um guia abrangente sobre a história natural, anatomia e fisiologia deste crustáceo. Por volta dessa época na história, a caracterização do músculo abridor nas patas do lagostim estava sendo realizada, e estudos fisiológicos já estavam em andamento nos músculos do lagostim.Na verdade, os experimentos com lagostins podem ter sido os primeiros a demonstrar a facilitação na junção neuromuscular ou JNM. O Dr. Riche publicou sua pesquisa principal em seus livros-texto de medicina, que utilizava para ensinar estudantes de medicina sobre a função muscular. Nas próximas décadas, as JNMs de lagostins foram sendo descritas anatômica e fisiologicamente em relação ao desenvolvimento da tensão e à anatomia.Em 1961, Doodle e Kler demonstraram a facilitação no músculo abridor da lagosta e mostraram pela primeira vez os fenômenos de inibição pré-sináptica e relataram a natureza qualitativa da transmissão sináptica. Nesta JNM, em 1971, Sherman e Edward fizeram a descoberta seminal de que a JNM abridora na lagosta exibia facilitação de longo prazo ou FLT. Além da facilitação de curto prazo ou FCP.A partir desse período, muitos pesquisadores se concentraram nos atributos do FDS e do FTL, utilizando a junção neuromuscular do músculo abridor de lagostim para estudar os mecanismos celulares. Hoje, o preparado do músculo abridor em lagostim ainda é utilizado para estudar os fundamentos da transmissão sináptica, pois é facilmente acessível e muito resistente em comparação com muitos outros. Para obter o preparado sináptico com a pata do lagostim para dissecação, induz-se um lagostim com comprimento corporal entre seis e dez centímetros a automutilar sua primeira ou segunda pata caminhante, pinçando fortemente o segmento do podomero Iscu.Este procedimento não mata o lagostim, que é devolvido ao seu tanque de contenção. Coloque a pata do lagostim sobre um pedaço de papel de tecido no estágio do microscópio. Gire a pata até que a face externa esteja voltada para cima.Este lado é geralmente o arqueado voltado para cima. Use uma lâmina de barbear afiada para entalhar a cutícula até cortar levemente. Nesse padrão, tenha cuidado para não cortar muito distalmente na incisão de dorsal para ventral, entre a articulação do pod de medula e o pod de cobre.Deixe a cutícula no lugar por enquanto e, com a lâmina de bisturi, risque a cutícula na dieta adequada até cortar levemente apenas nesta região, no segmento da dieta adequada, em um dos lados. Depois disso, repita do outro lado, unindo os cortes proximais para evitar cortar o músculo abridor; mantenha a lâmina inclinada em direção ao músculo mais próximo. Ao cortar através da cutícula, deixe a cutícula no lugar por enquanto.Em seguida, submerja a perna em solução salina para camarão em um recipiente de dissecação com uma camada protetora de um centímetro de espessura na base. Insira um alfinete no canto dorsal cordal dentro do corte da janela feita na meite para manter a preparação fixa com pinças finas. Levante levemente a cutícula a partir da extremidade distal e, com a lâmina, corte as fibras musculares flexoras da cutícula de maneira distal para proximal.Em seguida, levante a janela da cutícula. Uma vez que a cutícula tenha sido levantada, puxe cuidadosamente o tendão para longe da cavidade da perna e corte o AEM na articulação entre meite e CARite. Tenha cuidado para cortar apenas o tendão e não o nervo principal da perna, que está localizado no lado interno do tendão.Pince o tendão no local onde foi cortado com pin&ccedil;as e retire o m&uacute;sculo flexor levantando-o na dire&ccedil;&atilde;o cordal. O nervo principal da perna e o m&uacute;sculo extensor agora est&atilde;o expostos. Prossiga at&eacute; o segmento da dieta adequada e corte na dieta adequada, na articula&ccedil;&atilde;o entre o d&aacute;ctilo e o l&iacute;pido dite.Puxe para baixo e para trás o segmento ventral da dieta adequada trimestralmente para que o músculo fixado na região cordal possa ser visualizado. Corte esses músculos com a lâmina. Tenha cuidado para não cortar o ramo nervoso motor do músculo abridor.O músculo abridor está agora exposto à solução salina. Retorne à região mais cordal do segmento meita, onde o feixe nervoso da perna geralmente contém dois feixes nervosos separados. Seccione o feixe dorsal com tesoura fina.Em seguida, segure a extremidade cortada com pin&ccedil;as e puxe suavemente em dire&ccedil;&atilde;o distal at&eacute; alcan&ccedil;ar cerca da metade do comprimento do segmento meite. Este ramo nervoso longo cont&eacute;m o nervo abridor excitat&oacute;rio. Enquanto isso, o feixe nervoso maior cont&eacute;m o neur&ocirc;nio motor inibit&oacute;rio do m&uacute;sculo abridor.Corte o preparado no segmento meite de maneira diagonal, de forma que um alfinete para insetos possa ser inserido através da face dorsal do meite. Isso posiciona a face ventral do músculo abridor para cima, de modo que fique voltada para o observador. Em seguida, remova as fibras residuais do músculo fechador que obstruem a visualização do músculo abridor.Empurrando as fibras contra a cutícula e para fora da cavidade, o nervo principal da perna que percorre ao longo do músculo abridor e penetra no dactilo lipídico pode ser suavemente puxado para cima com pinças finas e então cortado. Agora, o músculo abridor está exposto sem nenhum tecido que impeça a visualização. Um eletrodo intracelular ou um eletrodo focal tipo macro patch para registrar os potenciais pós-sinápticos excitatórios ou EPSPs coloca a preparação do músculo abridor em uma câmara de registro projetada com um eletrodo de sucção de plástico.O fato de o eletrodo estimulante estar incorporado na câmara evita a necessidade de usar um micromanipulador para posicionar um pino de eletrodo estimulante na preparação dentro do recipiente de gravação e colocar o ramo do nervo que contém o nervo excitatório no eletrodo de sucção. O músculo abridor é dividido em três regiões gerais: distal, central e proximal. Embora todo o músculo abridor seja inervado por um único neurônio motor, os njs são estruturalmente diferentes e apresentam diferenças específicas regionais na eficácia sináptica.Como as fibras mais distais são facilmente delimitadas, garantindo consistência entre os preparos, utilizaremos a região distal nesta demonstração para provocar uma resposta evocada. O axônio excitatório será estimulado seletivamente por um estimulador grass eight eight. A região distal do músculo abridor é impalada com um eletrodo intracelular agudo preenchido com cloreto de potássio três molar.Um amplificador modelo axon clamp dois B e um estágio de cabeçote A um XL lu são utilizados para registrar EPSPs intracelulares. A facilitação de curto prazo ou vários outros tipos de respostas desejadas podem ser obtidas variando as condições de estímulo. A FCP é obtida aplicando uma série de 10 ou 20 pulsos a intervalos de 10 ou 22 ms, respectivamente, ao nervo excitatório.A frequência de estimulação dentro do trem pode ser variada. A saída da grama é conectada a uma unidade de isolamento de estímulo com o cabo conectado ao fio de prata que está dentro do eletrodo de sucção de plástico. O cabo é fixado a um fio de prata no banho para registrar diretamente EPSPs focais sobre regiões identificáveis do terminal nervoso.As varicosidades sinápticas são inicialmente visualizadas com um corante fluorescente vital, quatro corante dois A SP.A. Um eletrodo de gravação macro-patch feito de vidro chix será usado aqui. A luz do eletrodo é preenchida com um meio salino de banho, trabalhando sob microscópio de fluorescência, posiciona-se a luz de um eletrodo de gravação macro-patch diretamente sobre uma única varicosidade isolada para excitar o terminal nervoso. O nervo motor excitatório é estimulado conforme demonstrado anteriormente.Respostas espontâneas, bem como respostas evocadas de qual podem ser registradas ao longo da sequência de varicosidades visualizadas ao abaixar suavemente a luz do eletrodo e elevá-la novamente. A contagem direta de eventos de qual em cada varicosidade é possível com frequências de estímulo baixas para cada resposta evocada. O número de eventos de qual pode ser determinado para uma série de respostas.Os números totais de eventos qual são contados para, em seguida, estimar o conteúdo médio de qual com base nessas contagens diretas. Uma abordagem para calcular o conteúdo médio de qual é tomar o número total nos tipos de eventos qual evocados durante a estimulação e dividir pelo número total de ensaios de estímulo usando a seguinte fórmula. Aqui é mostrado um conjunto de ensaios repetitivos de estimulação com 30 pulsos a 40 hertz.Observe a facilitação para cada execução e a resposta média se a estimulação aumentou para 60 hertz. Uma facilitação mais acentuada é observada ao se registrar com um eletrodo focal sobre uma varicosidade e estimular a um hertz. São observadas as respostas qal evocadas.Acabamos de mostrar como dissecar o músculo abridor do lagostim e utilizá-lo para registrar respostas sinápticas com diversas técnicas e paradigmas de estimulação. Ao realizar esses procedimentos, é importante lembrar-se de tratar os neurônios com cuidado, evitando puxá-los com muita força ou espremê-los. Além disso, ao posicionar o eletrodo focal tipo macro patch sobre as varicosidades visualizadas, coloque levemente o eletrodo sobre essas varicosidades e, em seguida, levante-o novamente.Outro ponto a lembrar é que você não deve expor a preparação por muito tempo à luz de mercúrio, pois isso também pode danificar o terminal nervoso. É isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este artigo demonstra como realizar gravações eletrofisiológicas de respostas sináptica no músculo extensor da perna andando de um lagostim e como os terminais nervosos são visualizados para mostrar as diferenças morfológicas bruta de alta e de baixa produção terminais nervosos.

Gravações fisiológicos de NMJs Output High and Low no músculo extensor Crayfish Leg

Os experimentos demonstram um método fácil para que os estudantes ganham experiência em examinar a estrutura muscular, respostas sináptica, os efeitos de gradientes de íons e permeabilidade em potenciais de membrana. Além disso, um sensório-motoras CNS-músculo-circuito é apresentado para mostrar um meio para testar os efeitos de compostos em um circuito neuronal.

Potenciais de membrana, Responses Synaptic, circuitos neuronais, neuromodulação e Histologia Muscle Usando a lagosta: Exercícios Laboratório Student

O objetivo principal desta experiência é entender como os neurônios sensoriais primários transmitir informações de movimentos comuns e de posições como as informações proprioceptivas para um animal. Um objetivo adicional deste relatório é apresentar a anatomia da preparação por dissecção e visualização de neurônios em um microscópio de dissecação.

Muscular órgãos receptores no abdômen Crayfish: Um Exercício em Laboratório Student Propriocepção

Neste relatório, demonstram técnicas que podem ser usados ​​para investigar a biologia do intestino posterior lagostim. Nós mostramos como dissecar um abdômen lagostas e estudar a anatomia associados, fisiologia e modulação da atividade. A atividade peristáltica e força das contrações são medidos através de um transdutor de força.

Experimentação fisiológicas com o intestino posterior Crayfish: Um Exercício Laboratório de Student

Esta é uma demonstração de como membranas biológicas podem ser compreendidos através de modelos elétricos. Nós também demonstramos os procedimentos para registrar potenciais de ação a partir do cordão nervoso ventral do crustáceo para laboratórios de estudantes orientados.

Modelagem de Membranas Biológicas, com placas de circuito e medição de sinais elétricos em Axônios: Exercícios Laboratório Student

Técnicas fisiológicas e anatômicas são demonstrados para lidar com a função e estrutura para proprioceptores articulares e receptores de tensão muscular em membros de passeio de crustáceos.

Propriocepção e tensão Receptores em Caranguejo Limbs: Exercícios Laboratório Student

Drosophila larval Dissection MNJ

Este protocolo demonstra como executar imunohistoquímica em dissecados larva Drosophila.

Drosophila larval MNJ Imunohistoquímica

Aqui nós descrevemos métodos eletrofisiológicos para medir a transmissão sináptica na junção neuromuscular de larva Drosophila. Liberação evocada é iniciado artificialmente estimulando os axônios do neurônio motor ea transmissão através do MNJ pode ser medida pela resposta pós-sináptica evocado no músculo.

Métodos eletrofisiológicos de gravação Potenciais Synaptic do MNJ de larvas de Drosophila

Método para a dissociação enzimática, rotulagem superfície e purificação por citometria de fluxo de fibro / adipogénicos e progenitores miogênica de músculo esquelético murino.

Purificação de Progenitores do músculo esquelético

Aprenda a dissecar o músculo abridor do lagostim para estudos de fisiologia sináptica e plasticidade neuromuscular. Este método permite registrar respostas sinápticas e medir a eficácia sináptica em junções neuromusculares.

Ver histórico e demonstração Fisiologia da MNJ da Muscle Opener Crayfish

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