Função de monitorização cardíaca em larval Drosophila melanogaster Para estudos fisiológicos

Drosophila são geneticamente atraentes para investigações do desenvolvimento e função do coração e atividade subjacente do marcapasso. Este procedimento mostra como fazer preparações de larvas intactas e dissecadas e como monitorar a frequência cardíaca. A preparação dissecada também permite registros de potenciais extracelulares ou intracelulares para acessar ainda mais a função do canal iônico.

Olá, sou Robin Cooper, membro do corpo docente do Departamento de Biologia da Universidade de Kentucky. Hoje, meus alunos, Ann Cooper, Kyla Ryman, Matt Ward e Easter Boku, mostrarão vários procedimentos para monitorar a frequência cardíaca em larvas de Drosophila. O seguinte método desenfreado é chamado de fazenda de formigas porque as larvas são visualizadas dentro de um plano focal.

Para melhor visualização das larvas, use um microscópio de dissecação com uma objetiva de base de dois x e uma objetiva de tubo de 0,5 x para obter a melhor resolução espacial e ampliação em um retângulo de um centímetro por 0,5 centímetro. Fotografias e vídeos podem ser gravados através de uma câmera em um suporte ocular. Para iniciar este método, coloque uma larva em um sanduíche com uma fina camada de comida entre duas lâminas de vidro.

As lâminas são mantidas de um a 1,5 milímetros de distância com espaçadores de plástico nos quatro lados. Incline a preparação entre 20 e 45 graus por alguns minutos para estimular as larvas a manter a cabeça apontada para baixo. Ajuste o espelho do microscópio para obter o melhor contraste do coração ou das duas traqueias para observar o batimento cardíaco.

O método de cola é uma montagem permanente para conter larvas em uma lâmina de vidro. Para iniciar o método de cola, coloque uma lamínula limpa em cima de uma lâmina de vidro. Coloque uma pequena gota de super cola em um canto da lamínula.

Em seguida, lave as larvas com água. Para remover o excesso de comida, absorva o líquido com um lenço de papel ou com o canto de uma toalha de papel. Depois que a larva estiver bem enxaguada, pegue-a suavemente com uma pinça limpa e coloque-a na lâmina longe da lamínula sob o microscópio, oriente as larvas em seu estômago.

O estômago terá sulcos horizontais fracos correndo ao longo dele com pêlos pretos finos. A parte de trás das larvas deve estar voltada para cima e apresenta duas listras de corrida, que são a traqueia. Usando um segundo conjunto de pinças dedicadas estritamente ao manuseio da cola, pegue uma pequena pincelada da gota no final do deslizamento e coloque-a no canto do lado oposto.

Use uma pequena quantidade apenas o suficiente para cobrir a cabeça da pinça. Pegue o animal e coloque-o sobre a cola, garantindo que ele permaneça. Lado do estômago para baixo na boca preta.

Os ganchos devem estar na borda ou perto da lamínula da tampa, dos ganchos da boca e da espiral marrom. Não deve tocar na cola. Pressione suavemente as larvas para achatá-las.

Para aplicar uma substância de ensaio, é preferível dispensar pequenas gotículas com uma seringa perto da cabeça das larvas. Observe a frequência cardíaca contando o número de vezes que as espirais pulsam em um minuto. Para observações mais longas, as larvas podem ser alimentadas no local e umedecidas para evitar a desidratação para fazer uma placa de dissecação que possa ser usada ao microscópio, use um bisturi para fazer um buraco de dois centímetros de diâmetro no centro de um pedaço de fita magnética e cole-o em uma lâmina de vidro.

Use alfinetes de dissecação que foram dobrados e colados em clipes de papel para facilitar a fixação. Durante a dissecação, coloque um terço intacto das larvas estrela na placa de dissecação. O lado dorsal para cima da traqueia deve ser visível através da cutícula.

Coloque dois pinos nas larvas de cada lado dos ganchos da boca e outros dois pinos de cada lado das espirais. Em seguida, adicione solução salina para manter as larvas úmidas. Em seguida, faça uma incisão horizontal pela extremidade do mimo, seguida de um corte longitudinal que deve continuar ao lado das espirais em direção à cabeça do animal.

Levante um pino dorsal e prenda-o embaixo da cutícula. Use o alfinete para espalhar. Abra a cavidade do corpo.

Repita com os outros três pinos. Uma vez que o animal tenha sido aberto, remova as tripas tomando cuidado para não danificar a traqueia ou o coração. Algumas estruturas, incluindo o cérebro e alguns corpos gordos, estão ligadas ao coração e o danificam quando são removidas.

Deixe a preparação relaxar em um banho de soro fisiológico HL por três a cinco minutos após a dissecção, gravações intracelulares e de campo são realizadas nesta preparação enquanto os agentes farmacológicos são aplicados diretamente no coração. O tempo total para esta etapa de dissecção é de três a seis minutos. Para realizar a estimulação elétrica, os eletrodos focais primeiro precisam ser feitos para fazer um eletrodo focal passar um eletrodo de vidro sobre um elemento de aquecimento para polir a fogo e para fazer uma curva gradual de cerca de 45 graus, monte um eletrodo focal preenchido com solução salina HL três à temperatura ambiente no manipulador com a ponta apontando para baixo.

Certifique-se de que o fio do estimulador esteja tocando a solução salina dentro do eletrodo e que o estimulador esteja desligado. Garanta uma nova preparação de dissecção cardíaca no microscópio. Coloque o fio de aterramento na solução salina.

Cuidado para não tocar nos pinos ou atrapalhar a preparação. Mantenha o foco no eletrodo enquanto usa o manipulador para movê-lo para baixo na solução salina. Uma vez na solução salina, posicione a ponta do eletrodo com o lúmen plano contra o coração e tocando-o levemente.

Assim que o eletrodo estiver posicionado, defina a frequência do estimulador em dois hertz com o voltage em sua configuração mais baixa. Ligue o estimulador. Sintonize a frequência para aproximadamente três hertz e aumente lentamente a voltagem até que os batimentos cardíacos acelerem para corresponder ao ritmo do estimulador.

O ritmo agora pode ser manipulado através do estimulador. Compostos podem ser adicionados para ver se eles afetam a contração ou a condução elétrica. Para realizar registros de potencial de campo, encha um eletrodo de registro de patch macro com meio de banho e monte-o em um manipulador em um microscópio composto.

Conecte o eletrodo a um amplificador e equipamento de gravação. Use o manipulador para abaixar o lúmen do eletrodo sobre o coração de uma preparação de dissecção presa ao microscópio. Toque levemente o coração com a ponta do eletrodo.

As gravações de campo agora podem ser feitas para registrar potenciais de campo de outra região do coração. Levante suavemente a ponta do eletrodo e mova-o para uma nova área com o manipulador e, em seguida, rebaixe as gravações de potencial de campo da ponta. Permite o monitoramento preciso da taxa e duração dos sinais elétricos no coração para medir os potenciais transmembranares dos miócitos larvais.

Primeiro, certifique-se de que o lúmen de um eletrodo afiado preenchido com cloreto de potássio de três molares esteja plano contra o coração em um ângulo de cerca de 45 graus em relação à vertical. Uma vez posicionado corretamente, toque suavemente o coração com a ponta do eletrodo e bata a ponta em uma célula. O eletrodo pode ser usado novamente se não estiver quebrado.

Os registros intracelulares permitem medir a base iônica do potencial de ação e as formas características dos potenciais para examinar os efeitos de mutações de canais iônicos ou moduladores de canais. Então, acabamos de mostrar como fazer registros cardíacos, bem como como obter potenciais intracelulares e de campo. Você pode usar essas técnicas para observar alterações cardíacas, bem como manipulações farmacológicas e alterações genéticas.

Ao realizar este procedimento, é importante não puxar uma estrutura relacionada que está presa ao coração ou pressionar com muita força com o eletrodo focal. Também com o método de cola, tome cuidado para não colar a boca ou o esférico. Então é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.