Função de monitorização cardíaca em larval Drosophila melanogaster Para estudos fisiológicos

Drosophila é geneticamente atrativa para investigações do desenvolvimento e da função do coração, bem como da atividade subjacente do marcapasso. Este procedimento mostra como preparar larvas intactas e dissecadas e como monitorar a frequência cardíaca. O preparo dissecado também permite gravações de potenciais extracelulares ou intracelulares para investigar ainda mais a função dos canais iônicos.

Olá, sou Robin Cooper, membro do corpo docente do Departamento de Biologia da Universidade de Kentucky. Hoje, meus alunos, Ann Cooper, Kyla Ryman, Matt Ward e Easter Boku, mostrarão vários procedimentos para monitorar a frequência cardíaca em larvas de Drosophila. O seguinte método sem restrição é chamado de fazendinha de formigas porque as larvas são visualizadas dentro de um único plano focal.

Para melhor visualização das larvas, utilize um microscópio estereoscópico com uma objetiva básica de dois x e uma objetiva de tubo de 0,5 x para obter a melhor resolução espacial e ampliação em um retângulo de um centímetro por 0,5 centímetro. Fotografias e vídeos podem ser registrados por meio de uma câmera acoplada a uma ocular. Para iniciar este método, coloque uma larva entre duas lâminas de vidro, com uma fina camada de alimento.

As lâminas são mantidas a uma distância de um a 1,5 milímetros com espaçadores de plástico em todos os quatro lados. Incline o preparo entre 20 e 45 graus por alguns minutos para incentivar a larva a manter a cabeça voltada para baixo. Ajuste o espelho do microscópio para obter o melhor contraste do coração ou das duas traqueias, a fim de observar as batidas cardíacas.

O método da cola é uma montagem permanente para imobilizar larvas em uma lâmina de vidro. Para iniciar o método da cola, coloque uma lamínula limpa sobre uma lâmina de vidro. Coloque uma pequena gota de cola instantânea em um dos cantos da lamínula.

Em seguida, enxágue as larvas com água. Para remover o excesso de alimento, absorva o líquido com um tecido ou com o canto de uma toalha de papel. Uma vez que a larva esteja completamente enxaguada, pegue-a delicadamente com pinças limpas e coloque-a sobre a lâmina, longe da lamínula, sob o microscópio, orientando a larva com o ventre voltado para baixo.

O estômago apresentará sulcos horizontais tênues ao longo dele, com pelos pretos finos. O dorso das larvas deve ficar voltado para cima e apresenta duas listras paralelas, que são as traqueias. Usando um segundo par de pinças destinado exclusivamente ao manuseio da cola, pegue uma pequena quantidade da gota na extremidade da lâmina e coloque-a no canto do lado oposto.

Use uma quantidade mínima, apenas o suficiente para cobrir a ponta da pinça. Pegue o animal e coloque-o sobre a cola, garantindo que ele permaneça com o lado ventral voltado para baixo, com a boca preta para cima.

Os ganchos devem estar na borda ou próximo à borda da lamínula, nos ganchos bucais e na espiral marrom. Não devem tocar a cola. Pressione suavemente as larvas para achatá-las.

Para aplicar uma substância de teste, é melhor dispensar pequenas gotas com uma seringa próxima à cabeça da larva. Observe a frequência cardíaca contando o número de vezes que as espirais pulsam em um minuto. Para observações mais longas, as larvas podem ser alimentadas no local e umedecidas para prevenir desidratação. Para fazer uma placa de dissecação utilizável sob o microscópio, use um bisturi para cortar um orifício de dois centímetros de diâmetro no centro de um pedaço de fita magnética e cole-o em uma lâmina de vidro.

Use alfinetes de dissecação que foram dobrados e colados em clipes de papel para facilitar o fixação. Durante a dissecação, posicione uma larva de estrela-do-mar intacta em terço na placa de dissecação. Com o lado dorsal voltado para cima, a traqueia deve ser visível através da cutícula.

Coloque dois alfinetes nas larvas em ambos os lados dos ganchos bucais e outros dois alfinetes em cada lado das espiráculos. Em seguida, adicione soro fisiológico para manter as larvas úmidas. Depois, faça uma incisão horizontal próxima à extremidade posterior, seguida por um corte longitudinal que deve prosseguir ao lado dos espiráculos em direção à cabeça do animal.

Levante um pino dorsal e passe-o por baixo da cutícula. Use o pino para abrir e expor a cavidade corporal.

Repita com os outros três alfinetes. Uma vez que o animal tenha sido aberto com alfinetes, remova as vísceras tendo cuidado para não danificar a traqueia ou o coração. Algumas estruturas, incluindo o cérebro e alguns corpúsculos de gordura, estão ligadas ao coração e podem danificá-lo quando removidas.

Deixe o preparo repousar em um banho de solução salina HL três por três a cinco minutos após a dissecação; os registros intracelulares e de campo são realizados neste preparo enquanto agentes farmacológicos são aplicados diretamente no coração. O tempo total para esta etapa de dissecação é de três a seis minutos. Para realizar o estímulo elétrico, primeiramente é necessário confeccionar eletrodos focais; para fazer um eletrodo focal, passe um eletrodo de vidro sobre um elemento aquecedor para polir por aquecimento e criar uma curvatura gradual de aproximadamente 45 graus. Monte um eletrodo focal cheio com solução salina HL três à temperatura ambiente no manipulador, com a ponta voltada para baixo.

Certifique-se de que o fio do estimulador está tocando a solução salina dentro do eletrodo e de que o estimulador está desligado. Fixe uma preparação fresca de dissecação cardíaca no microscópio. Coloque o fio de aterramento na solução salina.

Tendo cuidado para não tocar os pinos nem perturbar a preparação. Mantenha o foco no eletrodo enquanto usa o manipulador para movê-lo para baixo, dentro da solução salina. Uma vez na solução salina, posicione a ponta do eletrodo com a luz voltada para baixo contra o coração, tocando-o levemente.

Uma vez posicionado o eletrodo, ajuste a frequência do estimulador em dois hertz com a voltagem no nível mais baixo. Ligue o estimulador. Ajuste a frequência para aproximadamente três hertz e aumente lentamente a voltagem até que a frequência cardíaca acelere, sincronizando-se com o ritmo do estimulador.

O ritmo pode agora ser manipulado por meio do estimulador. Podem-se adicionar compostos para verificar se afetam a contração ou a condução elétrica. Para realizar gravações de potenciais de campo, preencha um eletrodo de gravação macro do tipo patch com o meio de banho e fixe-o em um manipulador sobre um microscópio composto.

Conecte o eletrodo a um amplificador e ao sistema de gravação. Use o manipulador para posicionar suavemente a luz do eletrodo sobre o coração de uma preparação de dissecação fixada ao microscópio. Toque levemente o coração com a ponta do eletrodo.

As gravações de campo agora podem ser realizadas para registrar potenciais de campo de outra região do coração. Levante suavemente a ponta do eletrodo e mova-a para uma nova área com o manipulador, depois abaixe novamente a ponta para realizar as gravações de potenciais de campo. Permite o monitoramento preciso da frequência e duração dos sinais elétricos no coração para medir os potenciais transmembrana de miócitos larvais.

Primeiro, certifique-se de que o lúmen de um eletrodo agulhado preenchido com cloreto de potássio 3 molar esteja plano contra o coração em um ângulo de aproximadamente 45 graus em relação à vertical. Uma vez adequadamente posicionado, toque suavemente o coração com a ponta do eletrodo e introduza a ponta em uma célula. O eletrodo pode ser reutilizado se não estiver quebrado.

Os registros intracelulares permitem medir a base iônica do potencial de ação e as formas características dos potenciais para examinar os efeitos de mutações nos canais iônicos ou de moduladores de canais. Assim, acabamos de mostrar como realizar registros cardíacos, bem como como obter potenciais intracelulares e de campo. Você pode usar essas técnicas para analisar alterações cardíacas, manipulações farmacológicas e alterações genéticas.

Ao realizar este procedimento, é importante não puxar uma estrutura relacionada que esteja presa ao coração nem pressionar com muita força com o eletrodo focal. Também com o método da cola, tenha cuidado para não colar a boca ou a esfera. Assim sendo, é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.