Name: Função de monitorização cardíaca em larval Drosophila melanogaster Para estudos fisiológicos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-16T17:02:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Aprenda a monitorar a função cardíaca em larvas de Drosophila melanogaster para estudos fisiológicos. Este método demonstra preparações intactas e dissecadas, permitindo análise de potenciais elétricos e atividade de canais iônicos.

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Financiamento fornecido pelo Bolsas Ribble G. no Departamento de Biologia, os pesquisadores Kentucky Jovem e Educação de Graduação-Eureka! Office (Univ. de KY).

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<li>Bodmer, R., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+homeobox-containing+gene%2C+msh-2%2C+is+transiently+expressed+early+during+mesoderm+formation+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A new homeobox-containing gene, msh-2, is transiently expressed early during mesoderm formation of Drosophila.</a> Development. 110, 661-669 (1990).</li>
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<li>Dasari, S., Viele, K., Turner, A. C., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+p-CPA+and+MDMA+on+physiology%2C+development+and+behavior+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22European+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Influence of p-CPA and MDMA on physiology, development and behavior in Drosophila melanogaster.</a> European J. Neurosci. 26, 424-438 (2007).</li>
<li>Dowse, H., Ringo, J., Power, J., Johnson, E., Kinney, K., White, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+congenital+heart+defect+in+Drosophila+caused+by+an+action-potential+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">A congenital heart defect in Drosophila caused by an action-potential mutation.</a> J. Neurogenetics. 10, 153-168 (1995).</li>
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<li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+minimal+hemolymph-like+solution%2C+HL3.1%2C+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J. Neurogenetics. 18, 377-402 (2004).</li>
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<li>Johnson, E., Sherry, T., Ringo, J., Dowse, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+cardiac+pacemaker+of+Drosophila%3A+cellular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+B%2C+Biochem.%2C+Systemic%2C+Environmental+Physiol%22%5BJournal%5D)">Modulation of the cardiac pacemaker of Drosophila: cellular mechanisms.</a> J. Comp. Physiol. B, Biochem., Systemic, Environmental Physiol. 172, 227-236 (2002).</li>
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<li>Zornik, E., Paisley, K., Nichols, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+transmitters+and+a+peptide+modulate+Drosophila+heart+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Neural transmitters and a peptide modulate Drosophila heart rate.</a> Peptides. 20, 45-51 (1999).</li>
</ol>

<ol><li> Ferramentas de dissecção: Fine # 5 pinças e tesouras finas (todos obtidos a partir de Ferramentas Ciência Fine (EUA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139) </li><li> Dissecando microscópio com função de zoom para dissecção e freqüência cardíaca de contagem. Focal para a estimulação do coração que isto é necessário também. </li><li> Para gravações extracelular e intracelular um microscópio composto com os objetivos de pé (4 x e 20x) é usado. Amplificador intracelular padrão e A / D placa para gravação em linha para um computador. Sinais elétricos são registrados na linha de uma interface PowerLab/4s (ADInstruments, Austrália). Nós usamos software padrão de ADInstruments chamado gráfico ou Âmbito. </li><li> Produtos químicos: Todos os produtos químicos salinos são obtidos da Sigma Chemical Company (St. Louis, MO). </li><li> Para gravações intracelular usamos um tubo de vidro capilar (30-31-0 catalogo de FHC, Brunswick, ME, 04011, EUA) e para a gravação macropatch focal e eletrodos de estimulação usamos Kimax-51, Kimble Art Products. N º 34.502, ID 0,8 1,1 milímetros, comprimento 100mm. O eletrodo intracelular deve ter uma resistência de 20 a 30 mOhm. O eletrodo é construído por macropatch quebrando a ponta do vidro após uma ponta fina foi feita a partir de um extrator de eletrodo. A ponta fora quebrado precisa ser uma ruptura perpendicular limpo sobre 20Hm de diâmetro. A dica é, então, o calor polido para cerca de 10μM diâmetro interno para a gravação focal extracelular. Para o eletrodo estimulando a conduzir o coração usamos uma ponta final de cerca de 20-50 m de diâmetro. O eixo do eletrodo é executado ao longo de um elemento de aquecimento para fazer com que ele dobre cerca de 45 graus com uma curvatura gradual. Isso produz um apartamento ou lúmen eletrodo perpendicular ao longo do tubo de coração como o ângulo com o micro-manipulador irá produzir cerca de mais 45 graus para a preparação. </li></ol>

função de monitorização cardíaca em larval drosophila melanogaster para estudos fisiológicos

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

Apresentamos vários métodos para gravar a função cardíaca no larval<em&gt; Drosophila</em&gt;. As abordagens permitem que a freqüência cardíaca a ser medido em larvas sem restrição todo. Para o controle direto do ambiente em torno do coração outra abordagem utiliza as larvas dissecadas e remoção dos órgãos internos, a fim de banhar o coração em compostos desejados. O coração exposto também permite que os potenciais de membrana para ser monitorado e que pode dar uma visão das correntes iônicas geradas pelo miócitos e para condução elétrica do coração ao longo do tubo. Essas abordagens têm várias vantagens e desvantagens para futuros experimentos que são discutidos. A preparação do coração larval fornece um modelo adicional além do<em&gt; Drosophila</em&gt; Esqueléticos MNJ para investigar o papel da regulação de cálcio intracelular na função celular. Aprender mais sobre as correntes subjacentes iônico que forma os potenciais de ação em miócitos em várias espécies, pode-se esperar obter uma alça sobre as disfunções conhecida iônicos associados a genes específicos responsáveis ​​por várias doenças em mamíferos.

Apresentamos várias maneiras de monitorar a função cardíaca na larva de<em&gt; Drosophila</em&gt; Para avaliar questões relacionadas com a função de junções, mutações canal iônico, modulação da atividade de marcapasso e estudos farmacológicos.

Função de monitorização cardíaca em larval Drosophila melanogaster Para estudos fisiológicos

Apresentamos diversos métodos para registrar a função cardíaca em larvas de Drosophila. As abordagens permitem medir a frequência cardíaca em indivíduos não contidos e...

Drosophila é geneticamente atrativa para investigações sobre o desenvolvimento e a função do coração e da atividade marcapasso subjacente. Este procedimento mostra como preparar larvas intactas e dissecadas e como monitorar a frequência cardíaca. O preparo dissecado também permite a gravação de potenciais extracelulares ou intracelulares para investigar ainda mais a função dos canais iônicos.Olá, sou Robin Cooper, membro do corpo docente do Departamento de Biologia da Universidade de Kentucky. Hoje, meus alunos, Ann Cooper, Kyla Ryman, Matt Ward e Easter Boku, mostrarão vários procedimentos para monitorar a frequência cardíaca em larvas de Drosophila. O seguinte método sem restrição é chamado de fazenda de formigas porque as larvas são visualizadas dentro de um único plano focal.Para melhor visualização das larvas, utilize um microscópio estereoscópico com uma objetiva básica de dois x e uma objetiva de tubo de 0,5 x para obter a melhor resolução espacial e ampliação em um retângulo de um centímetro por 0,5 centímetro. Fotografias e vídeos podem ser registrados por meio de uma câmera acoplada a uma montagem ocular. Para iniciar este método, coloque uma larva entre duas lâminas de vidro, com uma fina camada de alimento em meio delas.As lâminas são mantidas a uma distância de um a 1,5 milímetros com espaçadores de plástico em todos os quatro lados. Incline o preparo entre 20 e 45 graus por alguns minutos para incentivar a larva a manter a cabeça voltada para baixo. Ajuste o espelho do microscópio para obter o melhor contraste do coração ou das duas traqueias, a fim de observar as batidas cardíacas.O método da cola é uma montagem permanente para imobilizar larvas em uma lâmina de vidro. Para iniciar o método da cola, coloque uma lamínula limpa sobre uma lâmina de vidro. Coloque uma pequena gota de cola instantânea em um dos cantos da lamínula.Em seguida, lave as larvas com água. Para remover o excesso de alimento, absorva o líquido com um lenço de papel ou com o canto de uma toalha de papel. Uma vez que a larva esteja completamente lavada, pegue-a delicadamente com pinças limpas e coloque-a sobre a lâmina, longe da lamínula, sob o microscópio, posicionando a larva de barriga para baixo.O estômago apresentará sulcos horizontais tênues ao longo dele, com pelos pretos finos. O dorso das larvas deve ficar voltado para cima e apresenta duas listras paralelas, que são as traqueias. Usando um segundo par de pinças dedicado exclusivamente ao manuseio da cola, pegue uma pequena quantidade da gota na extremidade da lâmina e coloque-a no canto do lado oposto.Use uma quantidade mínima, apenas o suficiente para cobrir a ponta da pinça. Pegue o animal e coloque-o sobre a cola, garantindo que ele permaneça com o lado ventral para baixo, com a boca preta voltada para baixo.Os ganchos devem estar na borda ou próximo à borda da lamínula, nos ganchos bucais e na espiral marrom. Não devem tocar a cola. Pressione suavemente as larvas para achatá-las.Para aplicar uma substância de teste, é melhor dispensar pequenas gotas com uma seringa próxima à cabeça da larva. Observe a frequência cardíaca contando o número de vezes que as espirais pulsam em um minuto. Para observações mais longas, as larvas podem ser alimentadas no local e umedecidas para prevenir desidratação. Para fazer uma placa de dissecação utilizável sob o microscópio, use um bisturi para cortar um orifício de dois centímetros de diâmetro no centro de um pedaço de fita magnética e cole-o em uma lâmina de vidro.Use pinos de dissecação que foram dobrados e colados em clipes de papel para facilitar a fixação. Durante a dissecação, posicione uma larva de estrela-do-mar intacta no terço posterior na placa de dissecação. Com o lado dorsal voltado para cima, a traqueia deve ser visível através da cutícula.Coloque dois alfinetes nas larvas em ambos os lados dos ganchos bucais e outros dois alfinetes em ambos os lados das espiráculos. Em seguida, adicione soro fisiológico para manter as larvas úmidas. Depois, faça uma incisão horizontal próxima à extremidade posterior, seguida por um corte longitudinal que deve prosseguir ao lado dos espiráculos em direção à cabeça do animal.Levante um pino dorsal e prenda-o sob a cutícula. Use o pino para abrir. Abra a cavidade corporal.Repita com os outros três alfinetes. Uma vez que o animal tenha sido fixado aberto, remova as vísceras tendo o cuidado de não danificar a traqueia ou o coração. Algumas estruturas, incluindo o cérebro e alguns corpos adiposos, estão ligadas ao coração e poderão danificá-lo ao serem removidas.Deixe o preparo repousar em um banho salino HL três por três a cinco minutos após a dissecação; os registros intracelulares e de campo são realizados neste preparo enquanto agentes farmacológicos são aplicados diretamente no coração. O tempo total para esta etapa de dissecação é de três a seis minutos. Para realizar o estímulo elétrico, primeiramente é necessário confeccionar eletrodos focais; para fazer um eletrodo focal, passe um eletrodo de vidro sobre um elemento aquecedor para polir a ponta com chama e criar uma curvatura gradual de aproximadamente 45 graus. Monte um eletrodo focal cheio com salina HL três à temperatura ambiente no manipulador, com a ponta voltada para baixo.Certifique-se de que o fio do estimulador está tocando a solução salina dentro do eletrodo e de que o estimulador está desligado. Fixe uma preparação fresca de dissecação cardíaca no microscópio. Coloque o fio de aterramento na solução salina.Tendo cuidado para não tocar os pinos nem perturbar a preparação. Mantenha o foco no eletrodo enquanto usa o manipulador para movê-lo para baixo, dentro da solução salina. Uma vez na solução salina, posicione a ponta do eletrodo com a luz voltada para baixo contra o coração, tocando-o levemente.Uma vez posicionado o eletrodo, ajuste a frequência do estimulador em dois hertz com a voltagem no nível mais baixo. Ligue o estimulador. Ajuste a frequência para aproximadamente três hertz e aumente lentamente a voltagem até que o batimento cardíaco acelere, sincronizando-se com o ritmo do estimulador.O ritmo pode agora ser manipulado por meio do estimulador. Podem-se adicionar compostos para verificar se eles afetam a contração ou a condução elétrica. Para realizar gravações de potenciais de campo, preencha um eletrodo de gravação macro do tipo patch com o meio de banho e fixe-o em um manipulador sobre um microscópio composto.Conecte o eletrodo a um amplificador e ao sistema de gravação. Use o manipulador para posicionar suavemente a luz do eletrodo sobre o coração de uma preparação de dissecação fixada ao microscópio. Toque levemente o coração com a ponta do eletrodo.As gravações de campo agora podem ser realizadas para registrar potenciais de campo de outra região do coração. Levante suavemente a ponta do eletrodo e mova-a para uma nova área com o manipulador, depois abaixe novamente a ponta para realizar as gravações de potenciais de campo. Permite o monitoramento preciso da frequência e duração dos sinais elétricos no coração para medir os potenciais transmembrana de miócitos larvais.Primeiro, certifique-se de que a luz de um eletrodo afiado preenchido com cloreto de potássio 3 molar esteja plana contra o coração em um ângulo de aproximadamente 45 graus em relação à vertical. Uma vez adequadamente posicionado, toque suavemente o coração com a ponta do eletrodo e introduza a ponta em uma célula. O eletrodo pode ser reutilizado se não estiver quebrado.Os registros intracelulares permitem medir a base iônica do potencial de ação e as formas características dos potenciais para examinar os efeitos de mutações nos canais iônicos ou de moduladores de canais. Assim, acabamos de mostrar como realizar registros cardíacos, bem como como obter potenciais intracelulares e de campo. Você pode usar essas técnicas para analisar alterações cardíacas, manipulações farmacológicas e alterações genéticas.Ao realizar este procedimento, é importante não puxar uma estrutura relacionada que esteja presa ao coração nem pressionar com muita força com o eletrodo focal. Também com o método da cola, tenha cuidado para não colar a boca ou a esfera. Assim sendo, é isso.Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Este relatório descreve um método para medir a atividade larval de Drosophila usando o TriKinetics Drosophila Activity Monitor. O dispositivo emprega feixes infravermelhos para detectar movimentos de até 16 animais individuais. Os dados podem ser analisados para representar parâmetros de movimento, incluindo taxas e posições dos animais dentro das câmaras de ensaio.

Medição da Actividade larval no<em&gt; Drosophila</em&gt; Monitor de Atividade

Aqui, os protocolos experimentais são descritos para preparar Drosophila em diferentes estágios de desenvolvimento e realizar imagens ópticas longitudinais de batimentos cardíacos de Drosophila usando um sistema de microscopia de coerência óptica (OCM) personalizado. As alterações morfológicas e dinâmicas cardíacas podem ser caracterizadas quantitativamente pela análise dos parâmetros estruturais e funcionais do coração a partir de imagens de OCM.

Drosophila Preparação e imagem longitudinal do coração Função In Vivo Usando Optical Coherence Microscopy (OCM)

O protocolo descreve um ensaio simples para identificar larvas de Drosophila melanogaster que estão enfrentando a hipóxia sob os níveis de oxigénio atmosférico normal. Este protocolo permite hipóxicos larvas ser distinguido de outros mutantes que mostram fenótipos sobrepostos como lentidão ou crescimento lento.

Um ensaio de buraqueira/Tunneling para deteção de hipóxia em larvas de Drosophila melanogaster

Este protocolo descreve um método para registrar a atividade elétrica descendente do sistema nervoso central Drosophila melanogaster para permitir que o custo-eficiente e conveniente de teste de agentes farmacológicos, mutações genéticas das proteínas neurais, e/ou o papel das vias fisiológicas inexploradas.

Eletrofisiológica gravação da atividade do sistema nervoso Central de terceiro ínstar Drosophila Melanogaster

O presente protocolo descreve a geração de Drosophila melanogaster expressando opsinas eNpHR2.0 ou ReaChR no coração para imagem OCT e ritmo cardíaco optogenético. Instruções detalhadas para imagem de Drosophila OCT e modulação de batimentos cardíacos, incluindo a simulação de parada cardíaca restauradora, bradicardia e taquicardia em animais vivos em diferentes estágios de desenvolvimento, são relatadas.

Desenvolvendo Modelos de Melanogaster Drosophila para Imagem e Controle Optogenético da Função Cardíaca

O protocolo apresenta um método de alto rendimento e custo-benefício para avaliar a neurotoxicidade na mosca-da-fruta por meio da quantificação da disfunção locomotora como alternativa aos modelos tradicionais de mamíferos. Tem como objetivo avaliar os efeitos neurotóxicos de compostos farmacêuticos, agentes ambientais ou modificações genéticas usando um modelo sensível, reprodutível e eticamente favorável.

Análise comportamental da disfunção locomotora em Drosophila melanogaster como leitura de neurotoxicidade

Aprenda a monitorar a função cardíaca em larvas de Drosophila melanogaster para estudos fisiológicos. Este método demonstra preparações intactas e dissecadas, permitindo análise de potenciais elétricos e atividade de canais iônicos.

Função de monitorização cardíaca em larval Drosophila melanogaster Para estudos fisiológicos

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