Microvolume determinação da concentração de proteína utilizando o NanoDrop 2000c Espectrofotômetro

A tecnologia NanoDrop combina fibra óptica e tensão superficial para armazenar e medir pequenas quantidades de amostras, como ácidos nucléicos e proteínas. Uma pequena gota de amostra é pipetada diretamente no pedestal inferior. Um pedestal óptico superior então envolve a amostra para formar uma coluna.

O pedestal se move automaticamente para ajustar o comprimento ideal do caminho. Encurtar o comprimento do caminho elimina a necessidade de realizar diluições para a maioria das amostras de proteínas, a medição ocorre em segundos e os resultados do espectro de vis são exibidos. Olá, sou Lynn Kalhorn nos Laboratórios NanoDrop da Thermo Fisher Scientific.

Hoje mostraremos um procedimento para determinar a concentração de proteínas usando um espectrofotômetro de microvolume inovador. O espectrofotômetro NanoDrop 2000 C usa um sistema inovador de retenção de amostras que depende da tensão superficial dos líquidos para manter e medir amostras de microvolume entre dois pedestais ópticos sem o uso de cubetas ou capilares. A amostra de micros é colocada diretamente no topo da superfície de detecção e uma coluna de líquido é criada entre as extremidades das fibras ópticas por tensão superficial.

Esta coluna de líquido forma um caminho óptico vertical. Uma lâmpada de flash de xenônio fornece a fonte de luz e um espectrômetro utilizando uma matriz CCD linear é usado para analisar a luz que passa pela amostra. A remoção de dispositivos de contenção tradicionais, como cubetas, do sistema tem várias vantagens.

Quantidades muito pequenas de amostra são necessárias para a medição. A limpeza de um a dois microlitros requer simplesmente a limpeza das superfícies ópticas com um lenço de laboratório e o comprimento do caminho muda automaticamente em tempo real durante a medição. Além disso, encurtar o comprimento do caminho permite a medição de concentrações mais altas, o que elimina efetivamente a necessidade de realizar a diluição para a maioria das amostras de proteína.

Nos casos em que um veterinário é necessário, como estudos cinéticos, o NanoDrop 2000 C oferece uma opção veterinária no mesmo espectrofotômetro. Para este protocolo, usaremos a opção de pedestal de micro volume para determinar a concentração de proteína. O método da proteína A dois 80 é aplicável a proteínas purificadas que contêm resíduos de triptofano, tirosina e fenilalanina ou ligações de cissulfeto de cisteína cisteína e exibem absorbância a 280 nanômetros.

Para iniciar este procedimento, selecione a aplicação da proteína A two 80 no menu principal. Se a janela de verificação do comprimento de onda aparecer, certifique-se de que o braço esteja abaixado, selecione o tipo de sample a ser medido na lista suspensa. A configuração padrão é recomendada para a maioria das misturas de proteínas desconhecidas nas quais uma ABSORÇÃO é igual a um miligrama por mililitro.

Se medir uma proteína purificada previamente caracterizada, então o coeficiente de extinção em massa ou o coeficiente de extinção molar podem ser inseridos. Para determinar a concentração de proteína com mais precisão, escolha as unidades de concentração na lista suspensa adjacente à caixa codificada por cores. Em seguida, estabeleça um espaço em branco.

Usando um tampão apropriado, é importante usar o tampão no qual a proteína está suspensa. O tampão usado deve ter o mesmo pH e uma força iônica semelhante à da solução da amostra. Devido à variabilidade na tensão superficial entre diferentes proteínas, recomendamos carregar dois microlitros de amostras para garantir a formação adequada da coluna.

Para carregar, toque a ponta da pipeta de baixa retenção na superfície do pedestal inferior enquanto expele a solução para evitar que a solução adira à parte externa da ponta da pipeta, expulse menos do que a quantidade total de amostra para evitar a explosão e a introdução de bolhas na amostra. Depois que a amostra for carregada, abaixe o braço e clique em branco. Quando o apagamento estiver concluído, limpe a solução em branco dos pedestais inferior e superior.

Usando um lenço seco de laboratório antes de tirar uma alíquota para medição, é importante garantir que a amostra seja homogênea. Misture a amostra suavemente, mas completamente, por vórtice suave usando um RPM de nível médio para evitar a introdução de microbolhas no fluido. Insira uma ID de amostra no campo apropriado.

Carregue dois microlitros da primeira amostra conforme mostrado anteriormente para o blank, abaixe o braço e clique em medir Quando a medição estiver concluída, limpe a amostra dos pedestais inferior e superior. Usando um lenço seco de laboratório, meça todas as outras amostras da mesma maneira usando uma alíquota nova de dois microlitros de amostra para cada medição. Um lenço de laboratório comum sem fiapos geralmente é suficiente para limpar os pedestais ópticos entre as medições.

O único solvente que é incompatível e não deve ser usado são as soluções de ácido fluorídrico e os reagentes contendo surfactantes podem descondicionar as superfícies do pedestal de medição ao longo do tempo, impedindo a formação da coluna de líquido da amostra. Um achatamento da gota no pedestal inferior é indicativo de que a superfície óptica está se tornando incondicionada para recondicionar. As superfícies do pedestal as lustram vigorosamente usando um lenço de laboratório ou o método preferido é usar o composto de recondicionamento de pedestal NanoDrop PR conforme as instruções.

Se a amostra for uma solução proteica não caracterizada, lisado celular ou extrato de proteína bruta, recomendamos o uso de um dos métodos colormétricos pré-configurados disponíveis no NanoDrop 2000 C. Esses métodos colormétricos incluem BCAP seis ensaios 60 Bradford e Lowy. O ensaio BCA será demonstrado aqui. Os reagentes necessários para o ensaio de BCA estão contidos no kit compatível com agente redutor de perfuração da thermos scientific BCA, reagente A, B, C, A, reagente B e padrões de albumina de soro bovino.

Usaremos o conjunto de albumina pré-diluída de pierce, pois nossos padrões se referem à literatura do Pierce BCA para determinar quais padrões de ensaio são apropriados para sua circunstância. Para preparar os reagentes, primeiro equilibre todas as proteínas desconhecidas e padrões de proteína à temperatura ambiente e misture bem por vórtice suave. Use um RPM de nível médio para evitar a introdução de microbolhas no fluido.

Uma vez que as bolhas podem afetar negativamente as leituras. Prepare reagente de trabalho fresco suficiente para os padrões e amostras a serem medidos usando uma proporção de 50 para um de reagente A para B.In neste exemplo, prepararemos três mililitros de reagente de trabalho para cobrir os padrões de referência cinco e seis amostras. O ensaio BCA regular cobre uma faixa dinâmica mais ampla e usa uma proporção de reagente para proteína de 20 para um, enquanto o ensaio de micro BCA é mais sensível e tem uma faixa dinâmica mais estreita usando uma proporção de reagente para proteína de um para um.

Como estamos realizando o ensaio regular de BCA, prepararemos uma proporção de 20 para um de reagente de trabalho para amostra. Adicione 190 microlitros de reagente de trabalho a cada tubo com tubos suficientes para cobrir todas as amostras e padrões. Em seguida, adicione 10 microlitros de padrão ou amostra a cada um dos tubos contendo reagente.

Misture bem por vórtice suave. Incube os tubos a 37 graus Celsius por 30 minutos. Após a incubação, deixe as reações se equilibrarem à temperatura ambiente por cerca de 10 minutos.

Ao contrário do método da proteína A dois 80, o método da proteína BCA requer que uma curva padrão seja gerada antes que as concentrações de proteína da amostra possam ser medidas. Para gerar uma curva padrão, comece selecionando o método BCA da proteína no menu principal. Se a janela de verificação do comprimento de onda for exibida, verifique se o braço está abaixado.

Insira os valores para cada concentração padrão na tabela do painel direito. O software permite a referência e até sete padrões adicionais. A referência e/ou os padrões podem ser medidos em réplicas.

Estabeleça um espaço em branco usando o buffer apropriado. O branco para ensaios métricos de cores é geralmente deionizado. Pipete dois microlitros de água no pedestal inferior e abaixe o braço.

Clique em branco. Apenas um branco é necessário para cobrir todas as medições subsequentes da referência e dos padrões. Estabeleça a referência pipetando um Eloqua de dois microlitros apenas de reagente funcional e tampão sem proteína no pedestal inferior.

Abaixe o braço e clique em medir. Na guia de padrões, destaque o padrão desejado e pipete dois microlitros do padrão desejado no pedestal inferior. Abaixe o braço e clique em medir.

Repita o processo para todos os padrões. Para visualizar a curva padrão, clique em exibir curva padrão. Depois que todos os padrões forem medidos, clique no botão amostras.

Insira o ID da amostra, carregue dois microlitros de amostra no pedestal inferior e clique em medir. Uma nova alíquota de dois microlitros de amostra deve ser usada para cada medição. Quando a medição estiver concluída, limpe a amostra dos pedestais inferior e superior usando um lenço seco de laboratório.

O resultado é então obtido à medida que a concentração final da amostra é calculada automaticamente usando a curva padrão. Acabamos de mostrar duas maneiras de determinar a concentração de proteínas, seja por uma medição direta de dois 80 ou por um método métrico de cor indireto, cada um usando o espectrofotômetro NanoDrop 2000 C de micro volume. Isso é tudo.

Obrigado por assistir.