Derivação de Células-Tronco Hematopoéticas murino de Células-Tronco Embrionárias

A primeira coisa que fazemos é pegar um T-25 confluente de UMSL. Então, vou apenas lavar com PBS e adicionar algumas gotas de TR e deixar repousar por alguns minutos. Posso ver que as células estão se destacando da placa. Portanto, está praticamente pronto.

Ok, agora vou coletar as células oculares com tripsina e é uma boa ideia agitar suavemente as células oculares com tripsina por um momento para dissociar as colônias antes de colocá-las na placa UN. Em seguida, essa placa permanecerá na incubadora por cerca de 30 a 45 minutos. Agora vou centrifugar essas células para coletá-las e vou apenas aspirar.

Então, eu vou apenas ressuspender daqui a alguns minutos para poder fazer a contagem. Então, eu ressuspendi e agora já contei; agora estou retirando uma alíquota e vou diluir essa alíquota até 50 mililitros, o que me dará a concentração apropriada para obter cem células por gota, apenas para verificar se as células estão boas. Então, agora temos um reservatório.

Apenas mexa um pouco novamente, despejamos isso em nosso reservatório. Ok, então já está programado. Pronto.

Agora está bem reto. Vire-o e deixe de lado. A cada duas ou três placas, eu simplesmente inclino um pouco, apenas para que o conteúdo balançe um pouco.

Ok, então são cinco placas. Vou agora colocá-las na estufa. Essas são as gotas suspensas que preparamos dois dias atrás.

Para coletar, basta agitar as placas para reunir as gotas. Vou coletar tudo e tento fazer isso com cuidado para não perturbar muito as EVs; vou pegar cinco ou seis porções de PBS e lavar as placas. Em seguida, deixamos essas placas por pelo menos 10 minutos, tempo durante o qual as EBS sedimentarão por gravidade.

Uma vez que você tenha confirmado visualmente que seus EBS se acomodaram, remova a maior parte do sobrenadante, mas não todo, porque você não quer perturbar seus, Ok. Ok, então agora e depois agite até o sexto dia. Estes são corpos embrionários que foram preparados há seis dias a partir de células-tronco embrionárias murinas e, normalmente, para coletá-los, agitamos levemente as placas.

Quando você agita suavemente as placas, os EDS tendem a se agrupar no centro do recipiente, o que facilita um pouco o seu manuseio. Agora, deixe os EDS sedimentarem por gravidade até o fundo do tubo e, em seguida, remova o meio e lave uma vez com 10 mililitros, de 10 a 12 mililitros de PBS. Ok, agora vamos deixar esses repouso, espere um momento.

Agora vou apenas remover o P. Então, adicionamos 250 microlitros da nossa mistura enzimática e adicionamos um mili, e depois colocamos simplesmente em um banho-maria a 37 graus. E de vez em quando, talvez duas vezes, passarei apenas para agitar levemente para misturar, porque os Eds sedimentaram. Agora temos este tampão de dissociação celular que é livre de enzimas, que acabamos de obter da gpro.

E vamos adicionar cerca de oito mililitros disso a cada tubo. Em seguida, vamos apenas realizar iterações com uma pipeta de cinco mililitros para dissociar; à medida que você repete essa operação, a solução ficará muito turva. Isso é apenas uma indicação visual de que as células estão sendo dispersas no meio, deixando-o bem turvo. Agora vou contar as células pelo método de exclusão com tripano; se você estiver tentando realizar uma infecção ou calcular um MOI, é muito importante fazer a contagem.

Então, vou apenas preparar um grande lote de vírus mais meio mais células na concentração apropriada mais sulfato de proteína. E, então, verifico sempre as células, novamente sou paranóico quanto às células saindo da suspensão. Por isso, estou sempre atento, e também uso um tubo pequeno, tentando ter cuidado para não provocar muitas salpicadas durante a centrifugação a 2.500 rpm.

Então, estou coletando nossas células do dia 10, que foram, guardo todas as lavagens. Eu costumava usar PI para iodeto de propídio, mas o sete não é tão brilhante. E, portanto, não apresenta vazamento em tantos canais, sendo muito mais limpo do que.

Agora nós apenas obtemos a variável, e essa é uma boa maneira de evitar perda na agulha devido ao volume. Então, eu sou Shannon McKinney Freeman. Sou pesquisadora pós-doutoranda no Laboratório de George Families, no Hospital Infantil de Boston.

Hoje vamos abordar como obter uma população de células transplantáveis a partir de células-tronco embrionárias de camundongo, transplantáveis e do sistema hematopoético. Por que realizamos este experimento? Bem, sabemos que, utilizando este sistema, podemos obter — primeiramente, o protocolo definitivo foi desenvolvido para derivar uma população de células a partir de células-tronco embrionárias que apresentassem atividade de células-tronco hematopoéticas, no sentido de serem capazes de resgatar camundongos submetidos a radiação letal, reconstituindo seu sistema hematopoético por longo período, durante toda a vida do organismo e em todas as linhagens do sangue periférico.

Por isso o protocolo foi desenvolvido. Agora estamos realizando experimentos adicionais para compreender o fenótipo da população de células dentro dessa população expandida que derivamos e que estão realmente mediando essa atividade de células-tronco hematopoiéticas. Pois não sabemos; sabemos que a população é muito heterogênea e sabemos que a célula que está realmente resgatando os camundongos é extremamente rara dentro dessa população de células.

E então estamos tentando basicamente definir seu fenótipo para que possamos purificá-lo a partir dessas células muito heterogêneas. Em seguida, estamos principalmente interessados em compreender como ele se compara funcionalmente a uma célula-tronco hematopoiética autêntica, que alguém poderia derivar da medula óssea total. Será que ele possui capacidade de reconstituição equivalente no desenvolvimento? Será que ele parece refletir uma HSC da medula óssea adulta?

Ou talvez possa ser mais semelhante a uma célula-tronco hematopoiética. Pode-se encontrar o desenvolvimento inicial, por exemplo, na medula óssea ou no fígado fetal. E, portanto, é isso que estamos tentando compreender, e queremos entender essas questões porque, em última instância, gostaríamos que este protocolo servisse como base para trabalhos semelhantes nos quais estamos interessados em realizar com células-tronco embrionárias humanas.

E acreditamos que as informações que obtemos com o sistema matemático, você sabe, beneficiarão grandemente aqueles experimentos futuros. Acho que há algumas coisas. Primeiramente, há apenas isso: é um bom modelo in vitro, é um bom modelo de características do desenvolvimento.

Portanto, estamos tentando compreender, antes de tudo, o desenvolvimento das células-tronco hematopoiéticas. Assim, trata-se de um sistema interessante que é muito simples para a expressão gênica ectópica e para observar como esses fatores influenciam o desenvolvimento das células-tronco hematopoiéticas. Isso é muito útil do ponto de vista da ciência básica.

Mas, em última instância, queremos desenvolver algum tipo de terapia baseada em células que possa ser usada clinicamente para obter, você sabe, células-tronco metabólicas transplantáveis a partir de células humanas. Mas isso provavelmente está ainda distante no futuro. Na verdade, descobrimos que a parte mais difícil não é tanto a obtenção das próprias células, mas, por meio de experimentos cuidadosos, identificamos um período em que tivemos dificuldade em fazer com que as células reconstituíssem nossos animais receptores.

E o que acabamos descobrindo foi que precisávamos prestar muita atenção à ablação dos receptores, porque essas células não são capazes. Assim, normalmente, quando se realiza um transplante em camundongos com idade avançada a partir da medula óssea, aplica-se uma radiação de 10 ou 11 Gy para a ablação dos camundongos, e as células hematopoiéticas da medula óssea são bastante capazes de resgatar os animais desse procedimento. No entanto, verifica-se que essa população de células que expandimos não é capaz de resgatar os animais de uma dose tão alta de radiação ionizante.

Então, o que precisamos fazer é ajustar com muito cuidado a dose de irradiação, prestando atenção ao tamanho dos animais, pois descobrimos que, se os animais forem muito grandes e tentarmos usar a mesma dose, eles não são efetivamente ablatados. Mas, novamente, se você não irradiar os animais o suficiente, as células não serão capazes de competir com hospedeiros mais resistentes.

Na verdade, assim que descobrimos que essa era uma variável importante, o que dificultava a observação da atividade ab dessas células, passamos a titular a dose de irradiação e também percebemos que a idade e o peso do animal são fatores muito significativos; foi então que nossos experimentos começaram a funcionar de maneira altamente reprodutível. O que descobrimos é que, se você utilizar animais com cerca de 20 gramas, entre 15 e 20 gramas, e os ablar com 9,25 gray, essa parece ser a dose ideal, que confere a essas células a vantagem necessária para reconstituir os camundongos. Sim, e acho que essa foi uma das variáveis mais importantes.

O outro, outro, outro aspecto significativo seria o número de células que você está injetando. Também realizamos titulações utilizando essas condições específicas para irradiar nosso organismo modelo. Também titulamos o número dessas células não fracionadas, desse pool heterogêneo de células que estávamos injetando em camundongos.

E descobrimos basicamente que é necessária uma dose mínima, cerca de 2 a 5 milhões de células, para resgatar os animais. Se você injetar menos que isso, os animais não são resgatados. E acho que isso indica, provavelmente, a raridade da célula que, na verdade, está mediando o resgate dentro desse compartimento heterogêneo.

Portanto, acho que as variáveis mais importantes são o número de células que você injeta e ter certeza de que, independentemente do modelo de transplante que estiver usando, você está aplicando o tubo ou uma lâmina com intensidade suficiente para dar às células a vantagem necessária para se reconstituírem, mas não tanto a ponto de elas se tornarem incapazes de promover o resgate. Essas são as variáveis principais, as grandes variáveis.