Um método rápido de alta capacidade para Ribonucleoproteínas Mapping (RNPs) no pré-mRNA Humanos

Para mapear os locais de ligação das proteínas ribonucleares em pré-mRNAs, comece ladrilhando a região designada do NNA prem de interesse em 30 janelas de nucleotídeos e sintetize os oligos lado a lado em uma matriz. Os oligos são fervidos da matriz e precipitados com um RNP de interesse. O pool inicial total é rotulado com SCI três e o pool vinculado é rotulado com SCI cinco, e ambos são aplicados à matriz de detecção.

A matriz é então verificada e o software de extração de recursos é usado para interpretar os resultados. Sais. Olá, sou Kate Watkins, do laboratório do irmão Will Fair no Departamento de MCB da Brown University. Hoje vou mostrar a você um procedimento rápido e barato para determinar a localização precisa de um complexo de proteína de RNA em prem RA no laboratório, sintetizar prem A como um pool de oligonucleotídeos sobrepostos.

Este pool pode então ser separado em uma fração ligada e não ligada por co-imunoprecipitação e então analisado por um microarray. Embora esse procedimento tenha muitas aplicações, nós o usamos para estudar vários fatores de emenda e seu papel e emenda alternativa. Então vamos começar.

Para iniciar este procedimento, use o navegador de genoma uc SC para baixar genes específicos, junções de emenda ou outras áreas de interesse a partir das quais projetar o pool A prem. Selecione as janelas de interesse e, em seguida, coloque-as lado a lado computacionalmente com um comprimento de leitura de 30 nucleotídeos e uma sobreposição de 20 nucleotídeos para que cada oligo seja deslocado 10 nucleotídeos do anterior. Agora que os oligos longos de 30 nucleotídeos são definidos, flanqueiam cada um com sequências de primers universais.

Envie os oligos para a Agilent para impressão em um microarray de oligonucleotídeos personalizado. Assim que o microarray chegar, comece a recuperar os oligos de DNA de sua superfície, colocando a lâmina de cobertura da matriz em uma câmara de hibridização de matriz e pipetando suavemente 500 microlitros de água deionizada na lâmina. Coloque a corrediça do microarray voltada para baixo em cima da corrediça da tampa de modo que as etiquetas em cada corrediça se enfrentem e tome cuidado para evitar bolhas de ar que podem interromper o processo de recuperação de oligo.

Feche a câmara de hibridização e gire-a durante a noite a 99 graus Celsius em um forno de hibridização No dia seguinte, remova cuidadosamente a matriz da câmara e retire a água, que agora contém os oligos liberados da superfície da matriz. Coloque o pool de oligo liberado em um tubo einor de 1,5 mililitro e sonice para quebrar aglomerados potenciais a 50% de amplitude três vezes por pulsos de três a cinco segundos de cada vez. Em seguida, amplifique o pool por PCR de baixo ciclo usando primers universais com um promotor T anexado à sua extremidade.

O número de ciclos necessários pode variar dependendo da eficiência da recuperação de oligo. Evite amplificar demais, que é visível como uma banda manchada em um gel de acrilamida. Finalmente, use o kit de script mega curto de Amon para transcrever RNA.

Terminar a reação de transcrição por extração de fenil clorofórmio do RNA, seguida de precipitação de etanol usando acetato de sódio e também azul de glico como transportador. Resus suspende o pellet de RNA em 105 microlitros de tampão TE. Para determinar com precisão a concentração do RNA.

Use o verde ribo para gerar uma curva padrão. Em seguida, meça usando um leitor de placa de fluorescência. O pool de RNA agora está pronto para a co-imunoprecipitação para iniciar a retirada.

Primeiro, prepare as esferas magnéticas combinando as esferas dinamizadas da proteína A e da proteína G em uma proporção de um para um para um com um volume final de 50 microlitros por reação. Concentrar os grânulos num só local utilizando um suporte de separação magnética para remover o sobrenadante. Em seguida, lave duas vezes com um volume igual de XPBS frio após a segunda lavagem.

Resus, suspenda as esferas em um volume igual de XPBS frio e adicione dois nanogramas do perion anticorpo. Essa quantidade pode variar dependendo do anticorpo, portanto, a experimentação pode ser necessária para encontrar as condições ideais para ligar o anticorpo às contas. Incube a mistura durante a noite a quatro graus Celsius em uma plataforma rotativa.

De manhã, adicione dois microgramas por reação de RNA total de levedura sonicada para bloquear a ligação inespecífica e gire por mais 30 minutos a quatro graus Celsius. Uma vez concluída a etapa de bloqueio, novamente, use o rack magnético para remover o sobrenadante. Em seguida, lave os grânulos duas vezes com um XPBS frio, deixando o PBS da segunda lavagem na alíquota do tubo de 50 microlitros da mistura de grânulos em novos tubos.

Um tubo para cada reação co IP. As contas estão agora prontas para o coip. Em seguida, prepare a mistura principal combinando o pool de oligo de RNA com o extrato de célula nuclear.

Como fonte de RNP, pegue uma alíquota de 50 microlitros da mistura master como proteção total da amostra Os primers, que são versões de RNA dos primers universais, podem ser adicionados para evitar a ligação de proteínas à sequência de primers ou a introdução de estrutura secundária ao RNA. Para iniciar a co-imunoprecipitação, retirar o sobrenadante das alíquotas do cordão e ressuspender os grânulos em 120 microlitros da restante mistura principal. Agite as reações a quatro graus Celsius por uma a duas horas.

No final da incubação, um pequeno Eloqua, incluindo as contas, pode ser removido de cada co. Para testes adicionais de eficiência ou especificidade de ligação, coloque o restante das reações no ímã e remova o sobrenadante. Seguindo com uma a duas lavagens com um XPDS frio.

O RNA ligado ao anticorpo nas esferas através do RNP é a amostra IP. Suspenda novamente os grânulos IP em 50 microlitros de 1% SDS em tampão 0.1 XTE e aqueça as amostras a 65 graus Celsius por 15 minutos. Para eluir o RNA, remover o sobrenadante, que agora contém o RNA que estava anteriormente ligado às esferas e limpar por extração de fenil clorofórmio, seguida de uma precipitação de etanol, ressuspender o pellet em 50 microlitros de tampão 0,1 XT.

Em seguida, transcreva as amostras usando os primers universais reversos. Em seguida, a PCR amplifica as amostras com os primers universais, um dos quais deve conter um promotor T sete. O número de ciclos necessários para amplificar a piscina dependerá da eficiência do co-ip.

Usando o kit de script mega shorts da ambion, transcreva as amostras novamente, mas desta vez adicione dois microlitros de UTP do alelo amino em vez do T sete UTP que acompanha o kit. O alelo amino UTP será usado posteriormente para marcar o RNA com os olhos laterais. Quando a transcrição estiver completa.

O extrato de fenilclorofórmio e o etanol precipitam as amostras. Não use azul de glico ou acetato de amônio, que podem interferir na hibridização das amostras com a matriz. Resus suspende o pellet em 4,5 microlitros de carbonato de sódio 0,1 molar.

Para rotular as amostras primeiro, adicione 2,5 microlitros de água livre de nuclease à amostra total. Adicione três microlitros de S3 e à amostra IP três microlitros de SCI cinco. Incube no escuro por uma hora.

À temperatura ambiente, termine a reação adicionando seis microlitros de quatro molares de hidroxilamina HCL a cada amostra, misture bem e centrifugue. Incubar brevemente por 15 minutos À temperatura ambiente, purificar as amostras rotuladas por extração de fenil clorofórmio, seguida de precipitação de etanol. A maior parte da cor é puxada para baixo na fase orgânica com os nucleotídeos livres, de modo que os pellets podem não ser visivelmente coloridos.

Resus suspende cada pellet em 50 microlitros de 0,1 XTE. Siga as instruções do kit de hibridização de matriz Agilent para preparar a amostra de microarray com a seguinte exceção. Não fragmente o RNA: Depois de adicionar o tampão de fragmentação, adicione imediatamente o tampão de hibridização para interromper a fragmentação.

Coloque as amostras na matriz e hibride a 50 graus Celsius por três horas enquanto a matriz está girando. Preparar as seguintes soluções de 50 ml em tubos cónicos de 50 ml. Um tubo de dois tampão SC excedente, dois tubos de um tampão marítimo excedente e um tubo de água deionizada.

Após a incubação de três horas, solte cuidadosamente o sanduíche de lâminas da matriz e coloque no tampão de dois XSSC. Usando uma pinça. Separe cuidadosamente a matriz da corrediça de cobertura.

Remova cuidadosamente a corrediça da tampa, tomando cuidado para não tocar na matriz. À medida que o slide é puxado para fora, feche o cônico e inverta suavemente por 60 segundos. Usando a pinça, transfira a matriz para uma solução XSSC.

Tampe o tubo e inverta suavemente por um minuto. Em seguida, transfira a matriz para a segunda solução XSSC e, novamente, inverta suavemente por mais um minuto. Por fim, transfira a matriz para o tubo de água deionizada e inverta suavemente por 30 segundos.

Seque a matriz colocando as bordas do slide em um lenço umedecido. Continue a girar a matriz no pano, certificando-se de não interromper o lado que contém os oligos. Coloque a matriz em um tubo cônico vazio e prossiga para escanear a matriz.

Prossiga para verificar a matriz. Aqui está uma matriz representativa. Cada recurso ou oligo é colorido em verde para o pool total não enriquecido ou vermelho para o pool enriquecido com IP.

O sinal em cada recurso é normalizado para a intensidade total nesse canal. A saída final é a razão logarítmica do canal vermelho sobre o canal verde. Em cada característica da matriz, a pontuação média em cada coordenada genômica é mapeada para o local fornecido.

Uma ilustração dessa etapa de média é dada para três oligos de 30 nucleotídeos sobrepostos com pontuações de dois, quatro e 0,5, onde a pontuação média de enriquecimento para cada janela de 10 nucleotídeos é mostrada. Aqui está um exemplo de um esquema de ligação para a proteína de ligação rastreada poliperina PTB no gene CLTA, as características do gene são fornecidas ao longo da parte inferior e as pontuações médias de enriquecimento logarítmico para o S ligado ao PTP são representadas por barras verticais vermelhas escuras. As barras vermelhas claras mostram áreas que não são enriquecidas para ligação PTP.

Acabei de mostrar como criar de forma rápida e eficiente um pool de oligonucleotídeos que se encaixa em regiões de interesse, como axônios fatiados alternadamente. Analisamos nossos pools por microarray, mas também é possível sequenciá-los por sequenciamento luminoso, Lexi ou sequenciamento Sanger mais tradicional. Ao fazer este procedimento, é importante lembrar que a criação do pool está aberta a modificações no nível do RNA ou da proteína.

No nível do RNA, podemos introduzir regiões autólogas, mutações de doenças, polimorfismos ou mutações aleatórias na sequência de oligonucleotídeos. No nível da proteína, o fator de ligação ao RNA pode ser modificado por fosforilação ou outras modificações pós-traducionais. Além disso, o ambiente de ligação pode ser manipulado para aumentar ou diminuir os níveis de fatores adicionais que competem ou interagem com a proteína de ligação ao RNA de interesse.

Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.