A gravação óptica de atividade elétrica na Guiné-porco Networks Enteric usando Tensão sensível Corantes

Este vídeo demonstra a dissecação e subsequente obtenção de imagens de preparações do sistema nervoso entérico estimuladas eletricamente, utilizando o corante sensível à voltagem natal styre perineum D quatro A-N-E-P-P-D-H-Q. Um pequeno segmento do intestino é retirado de um porquinho-da-índia eutanasiado e dissecado para expor primeiramente a submucosa e, finalmente, o plexo mioentérico para gravações ópticas. Eletrodos são posicionados sobre um tecido montado e corado com D para A-N-E-P-P-D-H-Q após a captura de uma imagem inicial de alta resolução.

Alterações ópticas que indicam atividade elétrica são registradas com a câmera de alta velocidade. Durante a aquisição de alta velocidade, é aplicada uma estimulação elétrica. A imagem de alta resolução é então sobreposta ao mapa de pixels da câmera de alta velocidade para análise usando o neuro plex.

Olá, sou Brian Salzberg, diretor do Laboratório de Óptica Celular ou loco, como gostamos de chamá-lo, no Departamento de Neurociência da Universidade da Pensilvânia. Meu nome é Analia Obide. Também sou membro do laboratório de óptica celular.

Hoje vamos mostrar um procedimento para registrar a atividade elétrica de redes neuronais mamíferas intactas utilizando corantes sensíveis à voltagem. Utilizamos este procedimento para estudar a conectividade neuronal dentro e entre as duas redes que compõem o sistema nervoso entérico, também conhecido como o segundo cérebro ou o cérebro do intestino. Então, vamos começar.

Inicie o preparo das preparações submucosas e do plexo entérico removendo o intestino delgado de um porquinho-da-índia Hartley com peso entre 150 e 200 gramas ou com idade de duas a três semanas, que tenha sido anestesiado por inalação de isoflurano e decapitado. Em seguida, remova o conteúdo do intestino lavando o lúmen com uma solução M199 DM aquecida e oxigenada. Corte um segmento intestinal com oito a dez centímetros de comprimento, certificando-se de preservar a polaridade.

Transfira-o para uma placa de vidro de 10 centímetros revestida com sard contendo M1 99 DM à temperatura ambiente. Coloque a placa sobre um microscópio estereoscópico com iluminação de campo escuro. Em seguida, usando tesoura, abra a borda mesentérica e utilize alfinetes para insetos para montar o segmento intestinal com a mucosa voltada para cima.

É extremamente importante manter uma tensão uniforme para que, após fixar o tecido, ele exiba uma forma retangular com as fileiras de vilosidades mucosas alinhadas regularmente, segurando pinças finas de Dumont com pontas retas em uma posição quase horizontal. Remova a mucosa agarrando a vilosidade em uma extremidade do segmento intestinal e puxando ao longo do eixo longitudinal do tecido. Continue separando fitas de mucosa para expor a submucosa contendo os gânglios submucosos e a vasculatura submucosa.

Em seguida, usando uma tesoura muito fina, faça um corte na camada submucosa seguindo a orientação das fibras musculares circulares. Então, levante suavemente a submucosa com a pinça fina enquanto empurra o músculo circular para baixo com a tesoura, e corte ao longo das bordas longitudinais.

Liberar a submucosa do restante da preparação à medida que a separação progride. Faça agora um segundo corte seguindo a orientação das fibras musculares circulares, a uma distância de 1,5 a três centímetros do primeiro, para definir o tamanho final da preparação submucosa; o segmento submucoso resultante possui de 30 a 50 micrômetros de espessura e apresenta aparência etérea. Transfira-o para outro recipiente Sylgard contendo M1 99 DM fresco e fixe-o suavemente e sem tensão.

Em seguida, coloque a placa em uma câmara oxigenada à temperatura ambiente para uso posterior. O segmento intestinal original deve agora estar desprovido de mucosa e submucosa, e o músculo circular deve estar exposto. Este segmento é agora utilizado para obter uma preparação do plexo mientérico, expondo assim o plexo mientérico.

Elimine o máximo possível da camada de músculo circular utilizando pinças finas de ponta reta para puxar para longe os feixes de fibras de cada lado do preparado. O plexo mientérico exposto não pode ser separado da camada longitudinal de músculo e da camada subjacente de CI. Transfira o preparado do plexo mientérico para um novo recipiente revestido com sard contendo M1 99 M oxigenado. Em seguida, fixe levemente a amostra, que contém músculo vivo. Alguns minutos antes do experimento óptico, transfira o preparado para um novo recipiente menor, revestido com syl guard, já preenchido com M1 99 DM contendo dois micromolares de nefe para prevenir a contração muscular, e fixe-o com cuidado colocando múltiplas pinças muito finas ao redor da periferia.

Certifique-se de que a tensão esteja uniformemente distribuída e de que o tecido esteja completamente plano contra a base da proteção de silício. O preparo do tecido está agora pronto para experimentos fisiológicos. Prepare uma solução estoque de cinco a 50 microgramas por mililitro de DAI quatro A-N-E-P-P-D HQ em M1 99 M com dois micromolares de nifedipina em um frasco de vidro e cubra-o com folha de alumínio.

O etanol da solução estoque deve compor menos de 0,5% da solução ao M1 99 DM com Nifedipina que estava cobrindo a preparação e substitua-o pela solução de corante preparada. Usando volume suficiente do marcador para cobrir completamente o tecido, incube em temperatura ambiente por 10 a 30 minutos. Após a incubação, lave a preparação com M1 99 M mais NEFE oxigenado, substituindo todo o conteúdo da câmara.

A gravação óptica da atividade neuronal em preparações estimuladas eletricamente é realizada usando um sistema composto por um microscópio de fluorescência epidual ereto equipado com um divisor de imagem, uma câmera de alta velocidade e baixa resolução de precisão, uma câmera preto e branco de alta resolução, um gerador de estímulos controlado por computador e um micromanipulador. Todo o aparato é montado sobre uma mesa ativa de isolamento de vibração e cercado por pesadas cortinas acústicas e um teto de Mylar para minimizar vibrações aéreas. Embora a aquisição de imagens de ambas as câmeras possa ser realizada usando um único computador executando simultaneamente o Neuro Plex e o Global Lab Image Two ou qualquer outro software de aquisição de imagens, a configuração mostrada aqui emprega dois computadores, cada um controlando uma câmera separada, para iniciar os experimentos ópticos.

Coloque a câmara contendo a amostra corada e peneirada na platina do microscópio. Como o D four A e o EPPD HQ são corantes impermanentes de membrana que fluorescem apenas quando em um ambiente lipídico, neurônios saudáveis de uma preparação entérica corada devem apresentar a aparência de balões vazios sob qualquer aumento superior a 20 x ao serem observados. Utilize os filtros HQ 5 35 50 para excitação, HQ 5 72 LP four emissão e um espelho dicromático de 5 65 nanômetros.

Em seguida, utilizando os controles do micromanipulador, posicione uma matriz linear de eletrodos com múltiplos canais na extremidade oral do tecido, certificando-se de que o eletrodo esteja afastado do objetivo do microscópio. Uma matriz linear contendo 10 eletrodos de tungstênio distribuídos ao longo de um vão de um centímetro é capaz de excitar várias vias neuronais independentes e é particularmente adequada para o estudo de circuitos ganglionares interconectados. Para os dados representativos, no entanto, utilizamos um eletrodo estimulador caseiro com dois terminais.

Use cera adesiva para posicionar um eletrodo de terra na extremidade oposta da câmara antes de realizar uma gravação funcional; adquira uma imagem em preto e branco de alta resolução da região da qual a atividade elétrica será registrada, para auxiliar na visualização. O contraste pode ser invertido, de modo que a fluorescência apareça escura. Para aplicar estimulação por corrente utilizando o gerador de estímulos controlado por computador, primeiro programe o dispositivo selecionando a intensidade, duração, frequência e número de estímulos apropriados, bem como o atraso em relação ao início da aquisição de dados ópticos.

Para garantir que a estimulação ocorra dentro dos limites da aquisição de dados ópticos, configure o gerador de estímulo como um dispositivo controlado pelo neuro plex. Em seguida, defina os parâmetros de aquisição no neuro plex indicando taxa de quadros, número de quadros e ganho da câmera. Para obter a definição completa de um potencial de ação, a taxa de quadros deve ser definida em um mínimo de um quilohertz.

Como D four A e E-P-P-G-H-Q exibem uma diminuição na fluorescência durante a despolarização que é linearmente relacionada à mudança de voltagem, inverta a exibição dos sinais ópticos no neuro plex para que os potenciais de ação não apareçam de cabeça para baixo. Inicie a aquisição. Lembre-se de adquirir uma nova imagem em preto e branco com alta resolução de cada campo de visão antes de realizar cada uma das gravações funcionais.

Após a conclusão da aquisição, utilize o neuro plex para analisar os resultados offline. Uma área da tela chamada exibição de página mostra a imagem bruta da preparação conforme capturada pela câmera de alta velocidade de 80 por 80 como um quadro individual. Quando o modo de página é quadro absoluto sobreposto, a imagem de alta resolução adquirida com a segunda câmera é sobreposta ao mapa de pixels da imagem bruta usando os comandos de exibição do neuro plex.

Isso exige a alteração do modo de página de traço absoluto para traços e a seleção da imagem sobreposta dentro do comando de exibição. Use o mouse para selecionar pixels individuais ou grupos de pixels na imagem mostrada na exibição da página. As saídas dessas regiões de interesse aparecerão como traços na janela de exibição de traços, revelando as magnitudes das alterações ópticas registradas por esses pixels em função do tempo.

A inversão da escala de cinza na imagem de alta resolução melhora a visualização na exibição do modo de rastreamento e é altamente recomendável exibir uma saída analógica do estimulador. Selecione o canal de saída analógica para inclusão na janela de exibição do rastro. Essa saída indica o momento exato dos estímulos aplicados durante o experimento.

Para visualizar os dados como um filme, utilize os comandos de filme no neuro plex para exibir quadros consecutivos dentro de um conjunto de dados usando escalas de cores pseudocromáticas ajustadas à variação máxima e mínima da intensidade de fluorescência. Um gânglio de uma preparação do plexo mioentérico corado com DIA four A-N-E-P-P-D-H-Q foi registrado com uma câmera de alta resolução e um objetivo de 60 x. Durante a aquisição dos dados, a preparação foi estimulada com uma série de cinco pulsos a 40 hertz.

Com cada pulso apresentando uma amplitude de 15 miliampères e uma duração de 0,5 milissegundos, quatro regiões de interesse ou ROI foram identificadas e traçados foram gerados para exibir os dados ópticos médios nas regiões selecionadas na sequência de quadros em pseudocores. As primeiras regiões de resposta óptica da despolarização da membrana, indicativas de atividade neuronal, aparecem como amarelo a vermelho. Esses dados indicam que a atividade estimulada pelo EV ocorre em regiões discretas de cada gânglio, sendo principalmente conduzida por axônios de passagem. As ROI dois, três e quatro identificam neurônios individuais a várias distâncias da ROI um.

A figura dois ilustra, com ampliação de 10 x, as vias anatômicas pelas quais a informação pode se propagar; as setas indicam a direção seguida pelo estímulo para ativar o gânglio mientérico identificado. Acabamos de mostrar os componentes de uma configuração óptica para registrar atividade elétrica com corantes sensíveis à voltagem e como, quando esta tecnologia é aplicada ao sistema nervoso entérico, abre-se a possibilidade de estudar a conectividade funcional dentro e entre duas redes mamíferas intactas sob o campo do microscópio. Ao utilizar a tecnologia de registro óptico, a atenção aos detalhes é extremamente importante.

As fontes de ruído, ópticas, mecânicas e elétricas precisam ser cuidadosamente controladas e a saúde da preparação precisa ser meticulosamente preservada. Assim, o domínio de todas as etapas individuais deste protocolo é essencial para obter sucesso na gravação óptica. É isso aí.

Muito obrigado por assistir e boa sorte em seus experimentos.