Estudos genéticos de proteínas de reparo do DNA Humano Utilizando Levedura como um sistema modelo

Os plasmídeos WRN são digeridos com a endonuclease de restrição cell one e MLU one, e os fragmentos são purificados a partir de um gel. Esses vetores de expressão digeridos com cell one até os fragmentos WN de MLU one são então ligados aos sítios de cell one a MLU one do vetor de levedura. O plasmídeo de múltiplas cópias também contém um marcador selecionável TRP one.

Construtos W Rrn são transformados em levedura seguindo protocolos padrão e os transformantes são selecionados em meio sintético completo com glicose, sem triptofano. Transformantes individuais são então estriados em meio sintético completo com glicose, sem triptofano, e as placas são incubadas a partir da placa mestre. Para analisar a restauração do fenótipo de crescimento lento em SGS transformado com WRN, três principais transformantes de cepas duplo mutantes são estriados em placas contendo glicose ou galactose.

Para analisar o efeito da expressão de WRN na sensibilidade a HU e MMS, realiza-se um ensaio de crescimento em placas para determinar a distribuição do ciclo celular em células de levedura que expressam WRN. É realizada a coloração com DAPI. A expressão de WRN em hospedeiro heterólogo é analisada por meio de análise de Western blot.

Olá, sou Robert Broch da seção sobre casos de DNA Hela no laboratório de gerontologia molecular do Instituto Nacional sobre o Envelhecimento, um dos institutos dos Institutos Nacionais de Saúde. Olá, sou Monica Agarwal, também da seção sobre casos de DNA Hela no laboratório de genética molecular do Instituto Nacional sobre o Envelhecimento. Compreender os papéis das proteínas humanas de reparo do DNA e das vias genéticas é um desafio acessível para muitos pesquisadores.

Estudos genéticos em sistemas de mamíferos têm sido limitados devido à falta de ferramentas prontamente disponíveis, incluindo linhagens celulares genéticas mutantes, sistemas regulatórios de expressão e marcadores seletivos apropriados. Hoje mostraremos procedimentos que envolvem a levedura como sistema modelo para investigar as funções moleculares e celulares de uma enzima de desenrolamento do DNA, conhecida como helicase, na prevenção do envelhecimento precoce. Utilizamos esses procedimentos em nosso laboratório para caracterizar geneticamente o papel do produto do gene humano burner, que é defeituoso na reparação do DNA e na manutenção da estabilidade genômica na desordem de envelhecimento precoce.

Síndrome de Werner é um dos cinco casos de helicases da família RecQ humana no leste. Existe apenas um mutante nomeado para estudar o papel do Werner humano na resposta ao estresse de replicação. Nós examinamos o efeito da expressão de Werner em fundo genético mutante no leste sobre diversos parâmetros biológicos.

Então vamos começar. Como utilizaremos levedura como hospedeiro heterólogo, nosso primeiro passo será clonar o gene humano Werner ou sua variante em um vetor de levedura. Os plasmídeos Werner foram digeridos com a endonuclease de restrição Sal I e Mlu I, e os fragmentos purificados serão então ligados aos sítios Sal I e Mlu I do vetor de expressão em levedura, que está sob regulação de um promotor induzível por galactose.

O plasmídio multicópia também contém um marcador seletivo TRP1. Esses plasmídios de expressão de Werner são então transformados nas linhagens apropriadas de levedura tróficas para triptofano utilizadas neste estudo. Os transformantes são selecionados por plaqueamento da suspensão em meio sintético completo com glicose.

Na ausência de triptofano, incubar as placas a 30 graus Celsius por três a quatro dias até que as colônias apareçam. Após o crescimento das colônias, repicar os transformantes individuais em meio sintético completo com glicose e incubar as placas a 30 graus Celsius por dois a três dias. Em seguida, as linhagens mutantes de levedura que expressam o gene humano weer e suas variantes são analisadas quanto a fenótipos celulares pelas técnicas demonstradas nas seções seguintes.

Os três principais mutantes apresentam um defeito grave de crescimento. No entanto, a mutação no gene SGS um suprime o fenótipo de crescimento lento do mutante três principais para examinar o efeito da expressão de Werner sobre o crescimedimento de linhagens selvagens de S Gs um ou S Gs um três principais, estrie as linhagens correspondentes com o vetor ou plasmídeo de expressão de Werner em placas de meio sintético completo sem triptofano, mas contendo 2% de glicose ou 2% de galactose como controle positivo. O efeito da expressão de SGS um foi determinado incubando as placas a 30 graus por dois dias.

As linhagens selvagem e mutante sgs um transformadas com vetor ou Werner não mostram diferença em seus padrões de crescimento. No entanto, a linhagem dupla mutante sgs um top três transformada com Werner cresce significativamente mais devagar do que a dupla mutante sgs um top três transformada com vetor, para avaliar os requisitos funcionais de Werner na restauração do fenótipo de crescimento lento. Na linhagem de fundo sgs um top três, estrias das linhagens sgs um top três transformadas com mutantes do domínio catalítico de Werner foram semeadas em placas sintéticas completas sem triptofano, contendo 2% de glicose ou 2% de galactose, após dois dias.

A incubação da mutante da exonuclease Werner indicada como E 84 A restaura o fenótipo de crescimento lento semelhante ao de Werner, demonstrando assim que a atividade exonucleásica não é necessária para a restauração do fenótipo de crescimento lento nas três primeiras posições. A mutante da helicase Werner cresce bem, demonstrando portanto que a atividade helicásica de Werner é necessária para a restauração do fenótipo de crescimento lento nas três primeiras posições. Para determinar a capacidade de Werner de afetar a taxa de crescimento de sgs.

Uma cepa do top três com níveis mais baixos de expressão proteica estria sgs umas três cepas do top três transformadas com o vetor Werner ou sgs um em placas sintéticas completas sem triptofano, mas contendo concentrações crescentes de galactose. Incube todas as placas a 30 graus Celsius por dois dias. O mutante Warner e a exonuclease Warner restauram o fenótipo da inclinação do top três em todos os níveis de galactose.

No entanto, os mutantes da helicase Werner não apresentam esse comportamento. Foi demonstrado que o mutante duplo SGS um top three é menos sensível do que o mutante simples top three ao agente alquilante de DNA metil metano SULFONATO ou MMS ou ao inibidor da replicação hidroxoureia ou HU, para determinar o efeito da expressão de Werner sobre a sensibilidade ao MMS e ao HU das linhagens SGS um ou S GS um top three. Cultive linhagens de levedura transformadas com vetor ou com Werner em meio sintético completo com rafinose, sem triptofano, a 30 graus Celsius como controle.

Utilize uma linhagem parental selvagem transformada com vetor para reinocular todas as culturas em meio sintético completo com raflnose, sem triptofano, e cultive a 30 graus Celsius até a fase logarítmica inicial. Quando as culturas estiverem na fase logarítmica inicial, prepare diluições seriadas de dez vezes, até uma diluição de 10.000 vezes, dessas linhagens utilizando meio sintético completo sem triptofano; aplique quatro microlitros de cada diluição em placas de meio sintético completo com GAL, sem triptofano, contendo 10 milimolares de HU ou 0,0025% de MMS; incube as placas a 30 graus Celsius por quatro dias. Um mutante duplo SGS um topo três que foi transformado com sgs selvagem.

Uma delas é atrasada na fase tardia SG2 do ciclo celular, resultando em morfologia em forma de haltere. Em contraste, leveduras do tipo selvagem completam a divisão celular, deixando menos células com formato de haltere para estudar a distribuição do ciclo celular da linhagem sgs um top três transformada com Werner. Primeiro, cultive culturas em crescimento logarítmico das seguintes linhagens em meio sintético completo com RAF, sem triptofano, a 30 graus Celsius durante a noite.

SGS um dos três principais transformados com o vetor Werner ou SGS um e o vetor transformado da linhagem parental selvagem reinoculam as culturas em OD 0,05. Após a reinoculação, cresça as culturas até OD 0,5 e recolha por centrifugação. A expressão de Werner é então induzida pela adição de galactose a 2% de concentração. Deixe as culturas crescerem a 30 graus Celsius por seis horas.

Após seis horas, colha as culturas e recolha as células por centrifugação. Após a centrifugação, transfira as culturas para tubos de microcentrífuga, lave as células uma vez com PBS. Em seguida, fixe as células em etanol 70% durante 20 minutos à temperatura ambiente; após lavar as células fixadas duas vezes com PBS, re-suspenda as células em um volume de PBS.

Coloque a suspensão celular em uma lâmina e adicione o vector shield. Use meio de montagem com DAPI na concentração de um micrograma por mililitro. Examine as lâminas em um microscópio XI Saxo vert para identificar células com núcleos em formato de haltere, característico de células de levedura na fase SG2 do ciclo celular.

Para determinar a expressão da proteína Werner ou sua variante em cepas de levedura SGS um ou SGS um top três transformadas, comece cultivando as cepas por seis horas em meio contendo galactose para induzir a expressão da proteína Werner. Após coletar as células por centrifugação, lave-as com PBS e re-suspenda-as.

Um tampão de lise alcalina. Ferva as células por cinco minutos, depois clarifique por centrifugação e neutralize com ácido clorídrico um molar. Esses lisados estão agora prontos para eletroforese em géis de SDS poliacrilamida de 8 a 16% para determinar o nível de expressão da proteína Warner sob a influência de concentrações variáveis de galactose.

Primeiro, induza as culturas com concentrações variáveis de galactose durante seis horas. Em seguida, recolha as células por centrifugação e re-suspenda-as em tampão contendo inibidores de protease. Adicione perlas de vidro de 425 a 600 mícrons à mistura e rompa as células por vortexagem em alta velocidade por um minuto, seguido de resfriamento em gelo por um minuto.

Repita por um total de oito vezes. Em seguida, centrifugue o homogeneizado resultante por cinco minutos a 15.000 G e colete a fração sobrenadante. Após medir a quantidade de proteína nas frações de lisado pelo método de Bradford, separe concentrações iguais de proteína em géis de poliacrilamida SDS de 8 a 16%. A expressão de Werner é então determinada por Western blot. Expressão de Werner em sgs.

Um TOP3 restaura o fenótipo de crescimento lento de top3, conforme mostrado nestas fotografias. Quando cepas sgs1 top3 transformadas com o vetor Werner ou sgs1 são estriadas em uma placa SC sem triptofano contendo 2% de glicose ou 2% de galactose. A expressão induzida por galactose de Werner faz com que a cepa sgs1 top3 cresça mais lentamente.

Em contraste, a linhagem parental do tipo selvagem ou a linhagem SGS um transformada com o Werner não é afetada em seu crescimento, indicando que o crescimento lento conferido pelo Werner é específico para o fundo sgs um top three. Quando linhagens SGS um top three transformadas com variantes do Werner foram estriadas em placas de SC sem triptofano contendo 2% de glicose ou 2% de galactose, respectivamente.

O Werner com exonuclease inativa ainda foi capaz de restaurar o fenótipo de crescimento lento. Isso demonstra que a atividade helicase ATPase do Werner, mas não a atividade exonuclease, é necessária para restaurar o fenótipo de crescimento lento do top three. Em um fundo SGS um top three, o Werner restaurou o fenótipo de crescimento lento de SGS um top three ao longo de toda a faixa de concentração de GAL.

Esses resultados indicam que a restauração do fenótipo de crescimento lento no mutante sgs um top três ocorre em baixos níveis de expressão da proteína Werner. Quando culturas em crescimento logarítmico de cepas sgs, um top três transformadas com Werner ou suas variantes foram depositadas em placas SC de triptofano contendo glicose ou galactose e MMS ou HU, em diluições seriadas de dez em dez, observamos que a expressão de Werner aumentou a sensibilidade ao MMS e à HU da cepa SGS um top três. Além disso, esse efeito sobre a sensibilidade ao MMS e à HU no contexto SGS um top três requer a atividade helicase da ATPase Werner, mas não a atividade exonuclease.

Por fim, a expressão de Werner também restaura o atraso característico de duas SGs do topo três, conforme indicado pelo aumento da população de células grandes fundidas. Nas células mutantes sgs um topo três expressando Werner. Em comparação com sgs, células um topo três transformadas com vetor foram coradas com Dabi.

Para visualizar os núcleos e as setas indicam núcleos não divididos expressão Werner. Nos sgs transformados, uma das três células superiores foi induzida pela adição de concentrações indicadas de galactose e as células foram colhidas seis horas após a indução. Quantidades iguais de lisado celular total foram carregadas em géis de SDS de poliacrilamida de 8 a 16%, seguido por detecção em western blot utilizando anticorpo anti-Warner.

Mostramos como investigar os fenótipos celulares associados a linhagens mutantes definidas de levedura para esclarecer as funções celulares e moleculares do gene humano learner mediadas por suas atividades catalíticas e interações proteicas. A levedura pode ser usada como organismo modelo para estudar as funções do gene em vias definidas. Ao realizar esses procedimentos, é importante selecionar uma linhagem mutante de levedura apropriada para discernir o papel do gene em estudo em vias definidas.

É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.