Name: Eletroforese em Gel de gradiente desnaturante (DGGE) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-02-25T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Aprenda a técnica de eletroforese em gel de gradiente desnaturante para perfilar comunidades bacterianas em biofilmes microbianos usando sequências de 16S rRNA. Este método permite analisar a diversidade genética e dinâmica temporal das espécies.

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Os autores não têm nada a declarar.

eletroforese em gel de gradiente desnaturante (dgge)

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

Eletroforese em Gel de gradiente desnaturante (DGGE)

Ok. Olá, meu nome é Celeste Peterson e sou pesquisadora na Universidade de Harvard, estudando comunidades microbianas de biofilmes. Estou caracterizando as comunidades bacterianas analisando sua sequência de 16S rRNA e como essa sequência muda ao longo do tempo e no espaço. Para isso, estou utilizando a eletroforese em gradiente desnaturante (DDGE).Esta não é uma eletroforese normal do meu poço, ela precisa ser mantida a 60 graus durante a execução e o tampão precisa ser bombeado continuamente. Então, vamos aquecer o tampão por cerca de uma hora até que atinja 60 graus, e então poderemos executar a eletroforese. Agora vou lavar esta placa com uma solução diluída de uc, removendo possíveis impurezas, e acender a luz.Qualquer coisa desse tipo pode causar regularidades. É importante remover toda a água. Assim, quando montar o gel, colocarei esse chip na parte externa do gel.Então, o gel ficará entre essas duas placas de vidro e o chip estará na parte externa, sem afetar o gel no interior. Agora vou montar o gel nessas braçadeiras e, em seguida, apertá-las e fixá-las girando para a direita. Como em qualquer gel, é importante garantir que a parte inferior esteja alinhada.Para evitar a formação de bolhas, agora viramos o gel e o colocamos aqui para ser selado com a junta. É importante que, ao fazer isso, as placas do gel estejam alinhadas corretamente com a junta. Os botões laterais então se encaixam e você pressiona para baixo a fim de criar o selamento.Então, esta é uma seringa de 30 mil. E esta parte e esta parte acompanham o kit da Bio-Rad e simplesmente se encaixam assim. E isso serve apenas para remover a água em excesso dos tubos.Então, coloque o tubo sobre o gel para carregar o gel. Primeiro, insira um adaptador no tubo e, em seguida, uma agulha com esse pequeno adaptador, posicionando-a exatamente no centro do gel, de modo que fique bem abaixo do vidro inferior. Em seguida, esse adaptador com fio é inserido no tubo longo e será conectado a duas seringas idênticas contendo as soluções de alta e baixa densidade.Essas são soluções previamente preparadas. Na azul, adicionei um corante aqui que apenas indica que esta é a solução mais desnaturante, e esta é a solução de gradiente menos densa, a de baixa densidade. E elas contêm todos os componentes necessários.E agora vou preparar, na verdade, o dobro da quantidade semanal. E uma vez que você tiver a mistura, tem cerca de cinco a sete minutos para preencher o gel antes que o colón suba. E agora enchemos a seringa com o suco da solução.Então, vou preenchê-lo com cerca de 15 da solução. E, para remover quaisquer bolhas de ar, vou virá-lo de cabeça para baixo e apertar suavemente até que a bolha de ar superior desapareça. Agora, este pequeno parafuso aqui vai encaixar-se nesta ranhura.Este adaptador será alinhado com este grampo aqui e será fixado firmemente com um grampo em forma de C. Em seguida, esta tubulação será conectada à seringa. O mesmo procedimento é realizado do outro lado com a matriz de alta densidade, quando for o momento da administração.E então vou girar esta roda com um movimento constante no sentido horário. Primeiro, a solução azul sairá primeiro, porque é a mais densa, e formará a parte inferior do gel. Depois de algum tempo, a solução transparente começará a preencher o gel e o gradiente será formado.Um momento é o suave em um ângulo e, assim que você terminar de despejar o gel, lave imediatamente seus tubos porque eles irão polimerizar. Vai, é o grupo ali. E então pressione para baixo. Então este pequeno, e do outro lado, farei a mesma coisa. Está bem.Olá, meu nome é Celeste Peterson e sou pesquisadora na Universidade de Harvard, estudando comunidades microbianas. Estou caracterizando as comunidades bacterianas analisando sua sequência de 60 F e como essa sequência muda ao longo do tempo e no espaço. Para isso, estou utilizando DDGE.Então, DGE é eletroforese em gel desnaturante. A ideia básica é que há um gradiente e, à medida que o DNA se move ao longo do gradiente, ele é desnaturado. Assim, diferentes espécies de 16S irão parar em pontos distintos ao longo do gradiente.E assim acaba se tornando uma impressão digital das diferentes espécies de sexiness na comunidade. Portanto, o objetivo do meu experimento é verificar quais organismos estão presentes na comunidade e como isso está mudando ao longo do tempo e do espaço. Posso então realizar a eletroforese em gel de sexiness DDD e recortar as bandas para identificar as espécies representadas em cada comunidade.Então, um dos maiores problemas ao realizar um gel de DDG é determinar o gradiente que seja o mais adequado. Isso é algo que precisa ser ajustado experimentalmente, dependendo da comunidade específica, para identificar o tipo de gradiente ideal. O gradiente que estou utilizando hoje é de 35 a 55% de ureia.Um dos grandes problemas que pode ocorrer com esta técnica é o surgimento de borras nas inclinações. E descobri que, por qualquer motivo, uma das melhores coisas a fazer é eletroforetizar os géis por um tempo muito prolongado, após o que as borras desaparecem. Bem, hoje estou usando apenas para comunidades bacterianas gerais, mas isso também pode ser usado para uma família específica de bactérias, a fim de observar como essas mudam ao longo do tempo, e esses géis costumam ser muito limpos.Você também pode analisar mutações em genes individuais com DDGE.

denaturing-gradient-gel-electrophoresis-dgge

Research

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Biology

Biologia

Desnaturação uréia eletroforese em gel de poliacrilamida é usado para separar single-stranded DNA ou RNA até um limite de 500 nucleotídeos. Uréia em combinação com amostras de calor desnatura e não estruturadas cadeias simples migrar dentro da matriz de gel de acordo com seu peso molecular.

Desnaturação Uréia Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (PAGE Urea)

Um protocolo de base para a separação de fragmentos de DNA usando electroforese em gel de agarose é descrito.

Electroforese em gel de agarose para separação dos fragmentos de DNA

Este vídeo demonstra a separação bidimensional semi-desnaturante de fibras amilóides em gel de agarose em gel de agarose. A técnica separa os agregados amilóides polimórficos com base em seu tamanho heterogêneo.

Eletroforese em gel de agarose semi-desnaturante bidimensional: uma técnica para separar fibras amilóides polimórficas com base na heterogeneidade de tamanho

Neste vídeo, demonstramos um método de eletroforese em gel bidimensional que separa proteínas individuais de uma mistura complexa de proteínas obtida de tecidos tumorais de adenoma hipofisário humano não funcional (NFPA). As proteínas são separadas com base em sua carga elétrica na primeira dimensão e posteriormente separadas com base em pesos moleculares na segunda dimensão.

Eletroforese em gel de poliacrilamida bidimensional: uma técnica de separação para análise de proteínas em mistura de proteínas complexas com base na carga e no peso molecular

A detecção rápida e a quantificação confiável dos eventos de edição de RNA em escala genômica permanecem desafiadoras e atualmente dependem de métodos de sequenciamento direto de RNA. O protocolo descrito aqui usa a eletroforese de gel de gradiente de microtemperatura (μTGGE) como um método simples, rápido e portátil de detectar a edição de RNA.

Uma abordagem não-sequencial para a detecção rápida da edição de RNA

Este vídeo demonstra o protocolo de um ensaio in vitro angiogênese que recapitula vários estágios de angiogênese. Lapso de tempo imagens de germinação, formação de lúmen, ramificação e anastomose - características-chave da angiogênese - são mostrados.

Otimizado de fibrina Gel Assay Bead para o Estudo da angiogênese

Nós descrevemos um protocolo para a microfabricação do dispositivo de geração de gradiente microfluídicos que pode gerar gradientes espaciais e temporais bem definidos em microambiente. Nesta abordagem, o dispositivo de geração de gradiente microfluídicos pode ser usado para estudar a migração celular dirigido, a embriogênese, cicatrização de feridas, e metástase de câncer.

Um dispositivo de geração de Gradient microfluídicos de Biologia Celular

Nós demonstramos que a expressão de receptores de mais de fator de crescimento epidérmico (EGFR) aumenta a motilidade das células-tronco neurais (NSCs) usando um romance agarose gel com base em dispositivo microfluídicos. Esta tecnologia pode ser facilmente adaptável a outros sistemas de células de mamíferos, onde fontes de células são escassos, como células-tronco neurais, ea volta em torno do tempo é crítica.

Avaliar motilidade celular Neural Stem Usando um dispositivo Agarose Gel baseado microfluídicos

SDD-AGE é uma técnica útil para a detecção e caracterização de amilóide como polímeros nas células. Aqui nós demonstramos uma adaptação que torna esta técnica passível de aplicações em larga escala.

Triagem para Agregação de amilóide por Semi-desnaturação Eletroforese Gel Detergente-Agarose

Nós descrevemos um método para extração de DNA genômico de alto peso molecular a partir da biomassa planctônica concentrou-se em 0,22 mM filtros Sterivex, seguido por centrifugação em gradiente de cloreto de césio densidade para purificação.

Extração de DNA de 0,22 mM Sterivex Filtros e Césio cloreto de centrifugação em gradiente de densidade

Aprenda a técnica de eletroforese em gel de gradiente desnaturante para perfilar comunidades bacterianas em biofilmes microbianos usando sequências de 16S rRNA. Este método permite analisar a diversidade genética e dinâmica temporal das espécies.

Eletroforese em Gel de gradiente desnaturante (DGGE)

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