Eletroforese em Gel de gradiente desnaturante (DGGE)

Ok. Olá, meu nome é Celeste Peterson e sou pesquisadora na Universidade de Harvard, estudando comunidades microbianas de biofilmes. Estou caracterizando as comunidades bacterianas analisando sua sequência de 16S rRNA e como essa sequência muda ao longo do tempo e no espaço. Para isso, estou utilizando a eletroforese em gradiente desnaturante (DDGE).

Esta não é uma eletroforese normal do meu poço, ela precisa ser mantida a 60 graus durante a execução e o tampão precisa ser bombeado continuamente. Então, vamos aquecer o tampão por cerca de uma hora até que atinja 60 graus, e então poderemos executar a eletroforese. Agora vou lavar esta placa com uma solução diluída de uc, removendo possíveis impurezas, e acender a luz.

Qualquer coisa desse tipo pode causar regularidades. É importante remover toda a água. Assim, quando montar o gel, colocarei esse chip na parte externa do gel.

Então, o gel ficará entre essas duas placas de vidro e o chip estará na parte externa, sem afetar o gel no interior. Agora vou montar o gel nessas braçadeiras e, em seguida, apertá-las e fixá-las girando para a direita. Como em qualquer gel, é importante garantir que a parte inferior esteja alinhada.

Para evitar a formação de bolhas, agora viramos o gel e o colocamos aqui para ser selado com a junta. É importante que, ao fazer isso, as placas do gel estejam alinhadas corretamente com a junta. Os botões laterais então se encaixam e você pressiona para baixo a fim de criar o selamento.

Então, esta é uma seringa de 30 mil. E esta parte e esta parte acompanham o kit da Bio-Rad e simplesmente se encaixam assim. E isso serve apenas para remover a água em excesso dos tubos.

Então, coloque o tubo sobre o gel para carregar o gel. Primeiro, insira um adaptador no tubo e, em seguida, uma agulha com esse pequeno adaptador, posicionando-a exatamente no centro do gel, de modo que fique bem abaixo do vidro inferior. Em seguida, esse adaptador com fio é inserido no tubo longo e será conectado a duas seringas idênticas contendo as soluções de alta e baixa densidade.

Essas são soluções previamente preparadas. Na azul, adicionei um corante aqui que apenas indica que esta é a solução mais desnaturante, e esta é a solução de gradiente menos densa, a de baixa densidade. E elas contêm todos os componentes necessários.

E agora vou preparar, na verdade, o dobro da quantidade semanal. E uma vez que você tiver a mistura, tem cerca de cinco a sete minutos para preencher o gel antes que o colón suba. E agora enchemos a seringa com o suco da solução.

Então, vou preenchê-lo com cerca de 15 da solução. E, para remover quaisquer bolhas de ar, vou virá-lo de cabeça para baixo e apertar suavemente até que a bolha de ar superior desapareça. Agora, este pequeno parafuso aqui vai encaixar-se nesta ranhura.

Este adaptador será alinhado com este grampo aqui e será fixado firmemente com um grampo em forma de C. Em seguida, esta tubulação será conectada à seringa. O mesmo procedimento é realizado do outro lado com a matriz de alta densidade, quando for o momento da administração.

E então vou girar esta roda com um movimento constante no sentido horário. Primeiro, a solução azul sairá primeiro, porque é a mais densa, e formará a parte inferior do gel. Depois de algum tempo, a solução transparente começará a preencher o gel e o gradiente será formado.

Um momento é o suave em um ângulo e, assim que você terminar de despejar o gel, lave imediatamente seus tubos porque eles irão polimerizar. Vai, é o grupo ali. E então pressione para baixo. Então este pequeno, e do outro lado, farei a mesma coisa. Está bem.

Olá, meu nome é Celeste Peterson e sou pesquisadora na Universidade de Harvard, estudando comunidades microbianas. Estou caracterizando as comunidades bacterianas analisando sua sequência de 60 F e como essa sequência muda ao longo do tempo e no espaço. Para isso, estou utilizando DDGE.

Então, DGE é eletroforese em gel desnaturante. A ideia básica é que há um gradiente e, à medida que o DNA se move ao longo do gradiente, ele é desnaturado. Assim, diferentes espécies de 16S irão parar em pontos distintos ao longo do gradiente.

E assim acaba se tornando uma impressão digital das diferentes espécies de sexiness na comunidade. Portanto, o objetivo do meu experimento é verificar quais organismos estão presentes na comunidade e como isso está mudando ao longo do tempo e do espaço. Posso então realizar a eletroforese em gel de sexiness DDD e recortar as bandas para identificar as espécies representadas em cada comunidade.

Então, um dos maiores problemas ao realizar um gel de DDG é determinar o gradiente que seja o mais adequado. Isso é algo que precisa ser ajustado experimentalmente, dependendo da comunidade específica, para identificar o tipo de gradiente ideal. O gradiente que estou utilizando hoje é de 35 a 55% de ureia.

Um dos grandes problemas que pode ocorrer com esta técnica é o surgimento de borras nas inclinações. E descobri que, por qualquer motivo, uma das melhores coisas a fazer é eletroforetizar os géis por um tempo muito prolongado, após o que as borras desaparecem. Bem, hoje estou usando apenas para comunidades bacterianas gerais, mas isso também pode ser usado para uma família específica de bactérias, a fim de observar como essas mudam ao longo do tempo, e esses géis costumam ser muito limpos.

Você também pode analisar mutações em genes individuais com DDGE.