Medir a tensão de membrana induzida com Di-8-ANEPPS
19 de novembro de 2009
Campo elétrico externo induz uma tensão na membrana de uma célula, chamado de tensão de membrana induzida (ΔΦ). Usando o corante potenciométrica di-8-ANEPPS, é possível medir a ΔΦ não invasiva. Este vídeo mostra o protocolo para a medição ΔΦ utilizando di-8-ANEPPS.
Para um biólogo, uma célula é o tijolo fundamental da vida, contendo uma série de organelas diferentes, cada uma desempenhando funções específicas e, em conjunto, permitindo que a célula realize suas funções vitais sob uma perspectiva elétrica. No entanto, a estrutura interna não é muito importante, e a célula pode ser vista como um citoplasma condutor envolto por uma membrana isolante e rodeado por um meio externo condutor. Um pequeno desequilíbrio nas concentrações iônicas, com íons em excesso acumulando-se próximo à membrana, resulta no potencial de repouso da membrana.
Colocar uma célula em um campo elétrico provoca uma redistribuição local de carga em ambos os lados da membrana. O resultado é a tensão induzida na membrana, que se sobrepõe à tensão de repouso e desaparece após a interrupção do campo. Com formas celulares simples, a tensão induzida na membrana pode ser calculada analiticamente para uma célula esférica.
É dado pela equação de Schwan, que afirma que a tensão é proporcional à intensidade do campo e ao tamanho da célula, e segue a função co-seno ao longo da membrana. Para formas celulares mais complexas, a tensão induzida pode desviar consideravelmente da função co-seno e deve ser determinada numericamente, utilizando um computador potente, ou experimentalmente, com o uso de um corante métrico de potencial. Um dos corantes métricos de potencial amplamente utilizado para esse fim é o diet AIPs.
Um corante rápido cujos espectros de excitação e emissão dependem da voltagem da membrana, os AIPs tornam-se fortemente fluorescentes ao se ligarem à membrana, com a variação da intensidade da fluorescência proporcional à variação da voltagem da membrana. Este vídeo mostra o protocolo para medir a voltagem da membrana induzida utilizando AIPs. Neste exemplo, células de ovário de hamster chinês são utilizadas, semeando-se as células em câmaras com 100.000 células por câmara.
Na cultura em meio HAMF 12, suplementado com soro fetal bovino, L-glutamina e antibióticos, incubar as células em seu meio de cultura por duas a quatro horas para obter células aderidas de formato esférico, ou por 16 a 20 horas para obter células individuais aderidas com formatos mais complexos. Preparar uma solução estoque de 10 milhões de MO de diet aaps dissolvida em DMSO no frasco original. Algumas linhagens celulares podem exigir adição de onic para facilitar a incorporação do corante na membrana. Transferir um mililitro de spinners, modificação do meio mínimo essencial (SMEM), para um tubo EOL contendo 2,5 microlitros de onic 20% e três microlitros de diet aaps 10 milimolar.
Isso produz uma solução de carregamento contendo aproximadamente 30 micromolar de diet aaps e 0,05% de onic. Substitua o meio de cultura na câmara pela solução de carregamento. Transfira a câmara para a geladeira por 10 minutos a quatro graus Celsius nesta temperatura.
A internalização do corante através da membrana plasmática é amplamente inibida após a coloração; cuidadosamente, lave várias vezes o corante residual com SMEM puro. Por fim, deixe 1,5 mililitros de SMEM na câmara. As células são observadas usando um microscópio de fluorescência com objetivo de imersão em óleo, um monocromador e uma câmera CCD.
No software de aquisição, defina o comprimento de onda de excitação em 419 nanômetros e escolha um filtro de passagem de banda ajustado em aproximadamente 605 nanômetros, embora não aplicado aqui. O diet aaps também permite medições ratiométricas de tensão de membrana. Coloque a câmara com as células sobre a platina do microscópio, posicione os eletrodos na parte inferior da câmara e conecte-os ao gerador de pulsos.
Neste exemplo, é gerado um pulso quadrado com amplitude de 35 volts e duração de 50 milissegundos. Utilizando uma fonte de tensão contínua e um comutador controlado por microprocessador, o pulso é entregue a um par de eletrodos, criando um campo elétrico entre eles e induzindo a tensão da membrana. A entrega do pulso deve ser sincronizada com a aquisição da imagem.
Localize as células de interesse, aplique um único pulso elétrico ou uma sequência de pulsos para cada pulso. Adquira duas imagens de fluorescência: a imagem controle imediatamente antes do pulso e a imagem do pulso durante o pulso, devido à baixa resposta do corante. As alterações na fluorescência são difíceis de distinguir e tornam-se evidentes apenas após o processamento; abra as imagens para cada pulso.
Subtraia o fundo tanto na imagem controle quanto na imagem de pulso. Escolha uma célula e defina a região de interesse de modo que ela corresponda à membrana. Meça a fluorescência ao longo dessa região nas imagens controle e de pulso e transfira os valores para uma planilha para cada pulso.
Subtraia os dados do controle dos dados do pulso e divida o resultado pelos dados do controle para obter as variações relativas de fluorescência. Se uma sequência de pulsos for aplicada, os valores de variação relativa determinados para cada pulso podem ser médias. Para obter uma medida mais confiável, transforme as variações relativas de fluorescência na voltagem induzida na membrana.
Utilizando uma curva de calibração, uma estimativa aproximada dessa curva pode ser obtida a partir da literatura, mas para maior precisão, ela deve ser medida para cada configuração específica. Trace a tensão em função do comprimento do arco relativo. A curva também pode ser suavizada utilizando um filtro adequado para células esféricas.
O gráfico resultante é semelhante a um cosseno, em concordância com a equação de Schwan. Para formas celulares mais complexas, o mesmo procedimento produz distribuições espaciais mais intricadas da voltagem da membrana.
Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para medir a tensão induzida na membrana (ΔΦ) em células utilizando o corante potenciométrico di-8-ANEPPS. A tensão induzida ocorre quando uma célula é colocada em um campo elétrico, levando à redistribuição de cargas através da membrana.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Eletrfisiologia
- Biologia Celular
- Dinâmica de Membrana
Contexto
- As células são estruturas condutoras envoltas por uma membrana isolante.
- A voltagem de membrana em repouso é influenciada por desequilíbrios na concentração iônica.
- A voltagem de membrana induzida pode ser calculada ou medida experimentalmente.
- O Di-8-ANEPPS é um corante utilizado para medição não invasiva das alterações de voltagem da membrana.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar um método para medir a tensão induzida na membrana em células.
- Ilustrar o uso do di-8-ANEPPS na microscopia de fluorescência.
- Fornecer um protocolo detalhado para os pesquisadores seguirem.
Métodos Utilizados
- Preparação de culturas celulares em meios específicos.
- Carregamento das células com o corante di-8-ANEPPS.
- Aplicação de pulsos elétricos para induzir voltagem na membrana.
- Imagem de fluorescência para medir alterações na voltagem da membrana.
Resultados Principais
- O protocolo permite a medição da tensão induzida na membrana em diversas formas celulares.
- As alterações na intensidade da fluorescência correlacionam-se com os níveis de tensão induzida.
- O processamento de dados permite a determinação precisa da tensão da membrana.
- Os resultados estão de acordo com as previsões teóricas para células esféricas.
Conclusões
- O método fornece uma abordagem confiável para o estudo da dinâmica da voltagem da membrana.
- O Di-8-ANEPPS é eficaz para medições não invasivas em células vivas.
- Uma calibração adicional pode aprimorar a precisão das medições em diferentes configurações.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A medição da voltagem induzida na membrana fornece uma leitura não invasiva da eletrofisiologia celular, permitindo a validação de alvos na modulação de canais iônicos e vias associadas à membrana. Esta abordagem auxilia na redução de riscos mecanicistas ao associar alterações biofísicas induzidas por compostos a resultados funcionais em células vivas. O método aumenta a confiança preditiva no estágio inicial de descoberta ao quantificar a dinâmica da voltagem da membrana como biomarcador tradutível para modelos neuronais, cardíacos e de células excitáveis.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas envolvendo fluxo iônico e modulação do potencial de membrana.
- Valor Operacional: Apoia a validação funcional de alvos ao correlacionar alterações na fluorescência do corante com mudanças eletrofisiológicas induzidas por compostos.
- Valor Preditivo: Aumenta a confiança na identificação de compostos líderes por meio de leituras quantitativas e em tempo real da voltagem da membrana.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Prepara sistemas biológicos validados para triagem subsequente com protocolos padronizados de carregamento de corante e aquisição de imagens.
- Saída Quantitativa: Gera alterações na intensidade de fluorescência proporcionais à voltagem da membrana, permitindo análise de resposta à dose.
- Escalabilidade: Permite a reutilização da plataforma em diferentes tipos celulares e parâmetros de pulso para avaliação consistente de compostos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Aplica-se a modelos de células excitáveis onde a voltagem da membrana atua como biomarcador tradutível para fenótipos neuronais e cardíacos.
- Continuidade Pré-clínica: Conecta a eletrofisiologia da fase de descoberta com a validação pré-clínica por meio de deslocamentos de voltagem mensuráveis e reprodutíveis.
- Decisões Ajustadas ao Risco: Orienta critérios de avanço ao identificar compostos que induzem alterações significativas e reprodutíveis na voltagem da membrana.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a verificação da hipótese do alvo até a otimização do composto líder, particularmente para campanhas de triagem de moduladores de canais iônicos e de membrana.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao medir como compostos alteram a voltagem induzida na membrana em resposta a pulsos de campo elétrico.
- Triagem: Oferece prontidão para ensaios por meio de leituras de fluorescência reprodutíveis que refletem mudanças em tempo real na voltagem da membrana.
- Análises: Fornece medições quantitativas por meio de alterações relativas na fluorescência convertidas em voltagem induzida utilizando curvas de calibração.
- Pesquisa Translacional: Estabelece conexão com a continuidade pré-clínica ao utilizar a voltagem da membrana como biomarcador em sistemas celulares excitáveis relevantes para doenças.
- Reutilização Corporativa: Funciona como uma capacidade reutilizável de eletrofisiologia em diversos projetos que exigem leituras do potencial de membrana.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva no engajamento do alvo, redução da ambiguidade mecanicista na modulação de canais iônicos.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade de medições de voltagem baseadas em corantes entre laboratórios.
- Valor Estratégico: Tomadas de decisão mais eficazes sobre prosseguir ou interromper projetos, eficiência no uso de capital e redução de riscos biológicos em fases avançadas em programas focados em eletrofisiologia.
- Impacto no Portfólio: Priorização e decisões de avanço ajustadas ao risco com base em limiares quantitativos de voltagem da membrana.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em microscopia de fluorescência, eletrofisiologia e protocolos de manipulação de corantes.
- Necessita de instrumentação incluindo microscópio de fluorescência com monocromador, câmera CCD, gerador de pulsos e câmaras para eletrodos.
- Exige padronização entre equipes para carregamento do corante, lavagem e condições de imagem, a fim de garantir reprodutibilidade.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes formas celulares, já que a distribuição de tensão induzida varia conforme a geometria, de acordo com a equação de Schwan.
- Inclui limitações práticas, como fotodegradação do corante, necessidade de calibração para cada configuração e sincronização da aplicação de pulsos com a aquisição de imagens.
