Spinal Cord Eletrofisiologia
18 de janeiro de 2010
A demonstração do isolamento do cabo do mouse neonatal espinhal para estudos eletrofisiológicos.
Ok. Olá, meu nome é Alan Meyer e sou assistente de pesquisa no Laboratório faf do Instituto Salk. Hoje vou mostrar como realizar uma laminectomia ventral para isolar a medula espinhal de um camundongo. Além disso, mostrarei como fixar a medula espinhal a um eletrodo. Para registrar sua atividade neural, você precisará preparar duas soluções para a medula espinhal: uma para a dissecação e outra para o banho de registro.
A única diferença entre as duas soluções será a concentração de cloreto de cálcio. Primeiro, será necessário preparar uma solução de 10 X-A-C-S-F. Isso exigirá os reagentes listados abaixo.
Inicie adicionando 100 mililitros do 10 X-A-C-S-F a um balão volumétrico de um litro. Em seguida, encha o balão com água, mas deixe espaço para não transbordar. Quando gasificado, as soluções com uma concentração gasosa de 5%CO2 e 95%O2.
Para reduzir o pH e oxigenar a solução, adicione um mililitro de sulfato de magnésio um molar. Em seguida, adicione um mililitro de uma solução de cloreto de cálcio um molar à solução de dissecção e adicione dois mililitros de cloreto de cálcio um molar à solução de gravação. Camundongos com idades entre E 16,5 e P 4 podem ser utilizados nestes experimentos.
Inicie a dissecação do camundongo decapitando-o rapidamente com tesoura afiada. Em seguida, corte ao longo da linha média ventral até alcançar a cauda. Depois, usando pinça, eviscere o camundongo e lave com a solução A CSF.
Utilize a solução salina artificial com cloreto de cálcio de um milimolar para realizar a dissecação. Coloque o camundongo no recipiente de dissecação e fixe-o inserindo um alfinete em cada uma das quatro patas e um alfinete na base da cauda. Nosso objetivo nesta etapa será isolar a medula espinhal cortando ao longo da linha pontilhada vermelha, separando a coluna vertebral da lâmina que envolve a medula espinhal.
Isso permitirá expor a medula espinhal. Em seguida, siga ao longo da linha para recortar as meninges e as raízes espinais, liberando a medula espinhal. Localize a coluna vertebral e use uma das mãos com uma pinça para segurar firmemente a coluna vertebral e a outra com uma tesoura pequena.
Para remover a medula espinhal, mantenha a tesoura em um ângulo baixo. Para evitar perfurar a medula com as pontas da tesoura, vamos agora dissecar a medula espinhal. Seguindo ao longo da linha vermelha, corte as meninges e as raízes espinais.
Para remover a medula espinhal, você pode cortar ao longo de ambos os lados da medula e, em seguida, cortar ao longo da linha média ventral. É importante manter a tesoura em um ângulo baixo para não perfurar a medula espinhal. É importante evitar cortar as raízes muito próximas à medula espinhal.
Em seguida, transfira a medula espinhal para o banho de registro e conecte os eletrodos às raízes espinhais. Posicione o eletrodo próximo à raiz. Depois, usando sucção, aspire suavemente o nervo para dentro do eletrodo.
Obrigado por assistir e espero que este vídeo seja útil em seus futuros experimentos.
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Visão Geral
Este artigo demonstra o isolamento da medula espinhal de camundongos neonatos para estudos eletrofisiológicos. O procedimento inclui a realização de uma laminectomia ventral e a fixação da medula espinhal a um eletrodo para gravação da atividade neural.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Eletrfisiologia
Contexto
- O isolamento da medula espinhal é crucial para o estudo da atividade neural.
- Técnicas eletrofisiológicas permitem a medição de sinais neurais.
- A concentração de cloreto de cálcio é importante para as soluções de dissecação e gravação.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar a técnica para isolar a medula espinhal de camundongos neonatos.
- Mostrar como fixar a medula espinhal a um eletrodo.
- Facilitar a gravação da atividade neural.
Métodos Utilizados
- Procedimento de laminectomia ventral para isolamento da medula espinhal.
- Preparação das soluções de dissecação e gravação.
- Uso de eletrodos para gravação da atividade neural.
Resultados Principais
- Isolamento bem-sucedido da medula espinhal de camundongos neonatos.
- Fixação eficaz da medula espinhal aos eletrodos.
- Gravação de atividade neural demonstrada.
Conclusões
- A técnica é viável para estudos eletrofisiológicos.
- A preparação das soluções é fundamental para resultados bem-sucedidos.
- Este método pode ser aplicado em diversos contextos de pesquisa em neurociência.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo permite o isolamento da medula espinhal de camundongos neonatos para avaliação eletrofisiológica da circuitaria geradora de padrão central, apoiando a redução de riscos mecanicistas na validação de alvos para distúrbios neuromusculares. O método fornece um sistema relevante para a doença, permitindo investigar a função da rede locomotora e avaliar os efeitos de compostos sobre a sinalização neural. Ele aumenta a confiança preditiva no estágio inicial de descoberta ao permitir a medição quantitativa de respostas eletrofisiológicas a partir de um modelo pré-clínico validado.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas relacionadas ao desenvolvimento do circuito locomotor e ao engajamento de alvos neuromusculares.
- Valor Operacional: Fornece um preparo reprodutível de tecido da medula espinhal para gravação eletrofisiológica consistente.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Apoia a padronização de ensaios por meio de soluções de dissecação controladas e concentrações definidas de cloreto de cálcio para garantir a estabilidade do banho de registro.
- Valor Operacional: Facilita a preparação de sistemas biológicos validados para fluxos de trabalho de triagem de compostos e detecção de sinais em etapas subsequentes.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Oferece um sistema relevante para a doença para avaliar alterações na atividade neural associadas a fenótipos locomotores em modelos pré-clínicos.
- Valor Operacional: Permite a continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica, fornecendo leituras eletrofisiológicas quantificáveis.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra aos fluxos de trabalho de descoberta precoce ao fornecer preparações isoladas da medula espinhal que permitem a realização de testes de hipóteses e a elucidação de vias para alvos neuromusculares.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre a função de geradores de padrão central e a modulação de circuitos neurais.
- Triagem: Permite a preparação de ensaios por meio de soluções padronizadas de dissecação e gravação com composição iônica definida.
- Análises: Gera medidas eletrofisiológicas quantitativas das raízes nervosas ventrais para comparar condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao fornecer uma saída mensurável para a modulação de alvos relacionados à locomoção.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável de preparação de tecido neural aplicável em diversos programas de descoberta neuromuscular.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista na função dos circuitos locomotores.
- Valor Operacional: Garante padronização e reprodutibilidade por meio de preparações definidas de soluções e técnicas de dissecação.
- Valor Estratégico: Melhora decisões de avanço ou interrupção ao permitir avaliação precoce dos efeitos do composto na sinalização neural.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de alvos neuromusculares com base em perfis de resposta eletrofisiológica.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em dissecação de camundongos neonatos e técnicas de registro eletrofisiológico.
- Depende de instrumentação para fixação do eletrodo de sucção e aquisição de sinais neurais.
- Necessita padronização entre equipes na preparação das soluções de dissecação e registro.
- Envolve considerações de adaptação ao ser aplicado a diferentes estágios de desenvolvimento ou modelos de doenças.
- Limitado pela necessidade de controle preciso da concentração de cloreto de cálcio para manter a viabilidade do tecido durante o registro.
