Name: Spinal Cord Eletrofisiologia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-18T16:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 59 s
Description: Aprenda a isolar a medula espinhal de camundongos neonatos para estudos eletrofisiológicos. Este método demonstra laminectomia ventral e gravação da atividade neural em eletrodos.

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Samuel L. Pfaff é professor no Laboratório de Expressão Gênica do Instituto Salk para Estudos Biológicos e um investigador no Instituto Médico Howard Hughes. Este trabalho foi financiado pelo Christopher Reeve e Dana Foundation. Joe Belcovson, Kent Schnoeker e Mike Sullivan em Recursos Multimídia do Instituto Salk prestou assistência com a fotografia e edição.

1. Prepare líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF) 1. Primeiro preparar uma 2L de um estoque de ACSF 10X sem magnésio ou cálcio. Reagentes listados na milimolar. Números de catálogo referem-se a Sigma / Aldrich. <table border="1" cellpadding="0"><tbody><tr><td colspan="4"> 2 Litros ACSF 10X (sem Mg ou Ca) </td></tr><tr><td> Reagente </td><td> mM </td><td> g/2L </td><td> Catálogo </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 40 </td><td> 5,96 </td><td> P-9333 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 1280 </td><td> 149,61 </td><td> S-7653 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 210 </td><td> 35,28 </td><td> S-6297 </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> 5 </td><td> 1,38 </td><td> S-9638 </td></tr><tr><td> Glicose </td><td> 300 </td><td> 108,12 </td><td> D-9434 </td></tr><tr><td colspan="4"> Adicionar água destilada para 2L </td></tr></tbody></table> Vamos também preparar soluções 1M de MgSO 4 e CaCl 2 em 50 mL de água para permitir ajustes na molaridade de experimento para experimento e para assegurar o cálcio permanece em solução. <table border="1" cellpadding="0"><tbody><tr><td colspan="4"> O cálcio 1M e Stocks Magnésio </td></tr><tr><td> Reagente </td><td> M </td><td> g/50mL </td><td> Catálogo </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 1 </td><td> 7,35 </td><td> C-5080 </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> 1 </td><td> 12,33 </td><td> M-5921 </td></tr></tbody></table> A solução deve ser ACSF gaseados com carbogênio (95% O2 / 5% CO2) para diminuir o pH antes da adição de cálcio ou o cálcio vai precipitar. <table border="1" cellpadding="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 1 Litro ACSF </td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Volume </td></tr><tr><td> ACSF 10X </td><td> 100mL </td></tr><tr><td> CaCl 2 1M </td><td> 1 mL (dissecação) 2 ml (gravação) </td></tr><tr><td> 1M MgSO 4 </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td colspan="2"> Adicionar ~ 800 mL de água destilada, o gás com carbogênio por 2 minutos antes da adição de cálcio </td></tr><tr><td colspan="2"> Adicionar água destilada para 1L. </td></tr></tbody></table> As bombas e tubos e pratos dissecar deve ser lavado antes e após o uso. Dissecação Enquanto dissecar, 1mM de cálcio ACSF deve ser continuamente gaseificada com carbogênio. O ACSF pode ser sugada da garrafa para o prato de dissecação e bombeada do prato de dissecação para o frasco ou enviados para o lixo. Usamos um elastômero (Sylgard, Dow Corning) prato revestido para realizar a dissecação. O rato neonatal é rapidamente decapitado com uma tesoura afiada e uma incisão feita com tesoura através do tórax e abdômen ventral. O animal é então eviscerada. O rato eviscerado é lavado com ACSF. O animal é então presa ao prato dissecando com pinos de insetos inserido através da forelimbs e na base da cauda. A coluna vertebral é removido através da realização de uma laminectomia ventral. A coluna vertebral é realizada com pinças pequenas e uma lâmina de tesoura pequena é inserido imediatamente dorsal à coluna vertebral óssea. A lâmina é cortada de um lado e depois o outro, enquanto delicadamente levantando a coluna vertebral óssea. Isto é realizado para o comprimento da coluna vertebral. A medula espinhal é retirada por um corte ao longo de cada lado da medula espinhal para cortar as raízes nervosas da coluna vertebral e cortar as meninges ao redor da medula espinhal. Cortamos nos lados esquerdo e direito, então vamos cortar as meninges anexado ao lado dorsal da medula espinhal para libertá-la. O cabo isolado é, então, preso ao prato perto da entrada de ACSF para garantir boa oxigenação se os animais adicionais são dissecados. O cabo isolado espinhal é então transferido para um prato de gravação usando uma pequena colher ou espátula. Aqui nós perfundir a preparação com oxigenada de cálcio 2mM ACSF. A medula espinhal é fixado ao prato elastômero revestido e micromanipuladores usado para mover extracelular, eletrodos de sucção toda raiz perto das raízes. Quando a ponta do eletrodo fica perto da extremidade da raiz livre, sucção suave é aplicada para desenhar a raiz para o eletrodo de sucção. Este processo pode ser repetido para gravar várias raízes simultaneamente. <img src="/files/ftp_upload/1660/1660fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Decapitação e evisceração. A. Rapidamente decapitar o mouse com uma tesoura afiada. Contribuições maior ou menor do tronco cerebral pode ser alcançada, dependendo do nível de corte. Coloque uma lâmina B. da tesoura na abertura da cavidade torácica, criado pela decapitação. Abrir o tórax e abdômen ventral à base da cauda. Retire as vísceras e lave com ACSF. <img src="/files/ftp_upload/1660/1660fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Remoção da coluna vertebral. A. Insira a lâmina da tesoura deixada no espaço entre a coluna vertebral e medula espinhal para a direita da medula espinhal e cortar os ossos postura ventral à medula. Em seguida, insira a lâmina da tesoura direito no espaço entre a coluna vertebral e medula espinhal para a esquerda da medula espinhal e corte. B. Repita esse processo durante a aplicação de tração suave para a coluna vertebral. Tome cuidado para não perfurar a medula espinhal, segurando a tesoura em um ângulo baixo. <img src="/files/ftp_upload/1660/1660fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Remoção da medula espinhal. A. Insira a lâmina da tesoura deixada no espaço entre a medula espinhal e os ossos para a direita da medula espinhal e cortar através das raízes espinhal e as meninges postura lateral para o cabo. Em seguida, insira a lâmina da tesoura direito no espaço entre a medula espinhal e os ossos para a esquerda da medula espinhal e cortar através das raízes espinhal e as meninges postura lateral para o cabo. B. Finalmente, levante suavemente o cabo rostral e cortar as meninges de conectar o cabo dorsal para as lâminas. Novamente tome cuidado para não perfurar a medula espinhal, segurando a tesoura em um ângulo baixo. Não corte as raízes muito perto da medula espinhal.

<ol><li>Myers, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+input+is+required+during+embryonic+development+to+mediate+proper+assembly+of+spinal+locomotor+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cholinergic input is required during embryonic development to mediate proper assembly of spinal locomotor circuits.</a> Neuron. 46, 37-49 (2005).</li>
<li>Goulding, M., Pfaff, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+circuits+that+generate+simple+rhythmic+behaviors+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Development of circuits that generate simple rhythmic behaviors in vertebrates.</a> Curr Opin Neurobiol. 15 (1), 14-20 (2005).</li>
<li>Gallarda, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segregation+of+axial+motor+and+sensory+pathways+via+heterotypic+trans-axonal+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Segregation of axial motor and sensory pathways via heterotypic trans-axonal signaling.</a> Science. 320, (2008).</li>
<li>Gosgnach, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V1+spinal+neurons+regulate+the+speed+of+vertebrate+locomotor+outputs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">V1 spinal neurons regulate the speed of vertebrate locomotor outputs.</a> Nature. 440 (7081), 215-219 (2006).</li>
<li>Lanuza, G. M., Gosgnach, S., Pierani, A., Jessell, T. M., Goulding, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+identification+of+spinal+interneurons+that+coordinate+left-right+locomotor+activity+necessary+for+walking+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic identification of spinal interneurons that coordinate left-right locomotor activity necessary for walking movements.</a> Neuron. 42 (3), 375-386 (2004).</li>
<li>Jiang, Z., Carlin, K. P., Brownstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+functionally+mature+mouse+spinal+cord+preparation+for+the+study+of+spinal+motor+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">An in vitro functionally mature mouse spinal cord preparation for the study of spinal motor networks.</a> Brain Res. 816 (2), 493-499 (1999).</li>
<li>Ziskind-Conhaim, L., Gao, B. X., Hinckley, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+dual+modulatory+actions+on+spontaneous+postsynaptic+currents+in+spinal+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Ethanol dual modulatory actions on spontaneous postsynaptic currents in spinal motoneurons.</a> J Neurophysiol. 89 (2), 806-813 (2003).</li>
<li>Tabak, J., Rinzel, J., O'Donovan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+activity-dependent+network+depression+in+the+expression+and+self-regulation+of+spontaneous+activity+in+the+developing+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of activity-dependent network depression in the expression and self-regulation of spontaneous activity in the developing spinal cord.</a> J Neurosci. 21 (22), 8966-8978 (2001).</li>
<li>Chub, N., Mentis, G. Z., O'Donovan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloride-sensitive+MEQ+fluorescence+in+chick+embryo+motoneurons+following+manipulations+of+chloride+and+during+spontaneous+network+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Chloride-sensitive MEQ fluorescence in chick embryo motoneurons following manipulations of chloride and during spontaneous network activity.</a> J Neurophysiol. 95 (1), 323-330 (2006).</li>
</ol>

CARE ANIMAL<br /&gt;<br /&gt; Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pelo Instituto Salk para Estudos Biológicos AIACUC.

O cordão espinhal neonatal isolado fornece um método de estudar tractable Desenvolvimento1 sistema nervoso, 2. Dentro da medula espinhal de roedores lombar neonatal, gerando circuitos centrais padrão pode produzir locomoção fictícia na presença de neurotransmissores. Este locomoção fictícia consiste de aumentos na atividade rítmica, rajadas, que são produzidos em 0,2-0,5 Hz. Estas explosões são organizados para produzir esquerda-direita alternância ao longo do comprimento do cabo de alternância e flexores e extensores (...

<table><tbody><tr><td>KCl</td><td></td><td>P-9333</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td>S-7653</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td></td><td>S-6297</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td><td>S-9638</td><td></td></tr><tr><td>Glicose</td><td></td><td>D-9434</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td>C-5080</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td><td>M-5921</td><td></td></tr><tr><td>Tesouras grandes</td><td>Fine Science Tools</td><td>14070-12</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>Tesouras finas</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-10</td><td></td></tr><tr><td>Agulhas para insetos</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 (Dow-Corning)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Frasco volumétrico de 1 L</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Frascos volumétricos de 100 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

spinal cord eletrofisiologia

Spinal Cord Electrophysiology

O cabo do mouse neonatal espinhal é um modelo para estudar o desenvolvimento de circuitos neurais e movimento locomotor. Nós demonstramos a dissecção da medula espinhal e preparação de fluido cerebrospinal artificial banho de gravação usado para estudos locomotor. Uma vez dissecada, a medula espinhal raízes nervosas ventral pode ser ligado a um eletrodo de gravação para gravar os sinais eletrofisiológicos dos circuitos centrais de geração de padrões dentro da medula lombar.

A demonstração do isolamento do cabo do mouse neonatal espinhal para estudos eletrofisiológicos.

Spinal Cord Eletrofisiologia

A medula espinhal de camundongos neonatos é um modelo para estudar o desenvolvimento de circuitos neurais e do movimento locomotor. Demonstramos a medula espinhal...

Ok. Olá, meu nome é Alan Meyer e sou assistente de pesquisa no Laboratório faf do Instituto Salk. Hoje vou mostrar como realizar uma laminectomia ventral para isolar a medula espinhal de um camundongo. Além disso, mostrarei como fixar a medula espinhal a um eletrodo. Para registrar sua atividade neural, você precisará preparar duas soluções para a medula espinhal: uma para a dissecação e outra para o banho de registro.A única diferença entre as duas soluções será a concentração de cloreto de cálcio. Primeiro, será necessário preparar uma solução de 10 X-A-C-S-F. Isso exigirá os reagentes listados abaixo.Inicie adicionando 100 mililitros do 10 X-A-C-S-F a um balão volumétrico de um litro. Em seguida, encha o balão com água, mas deixe espaço para não transbordar. Quando gasificado, as soluções com uma concentração gasosa de 5%CO2 e 95%O2.Para reduzir o pH e oxigenar a solução, adicione um mililitro de sulfato de magnésio um molar. Em seguida, adicione um mililitro de uma solução de cloreto de cálcio um molar à solução de dissecção e adicione dois mililitros de cloreto de cálcio um molar à solução de gravação. Camundongos com idades entre E 16,5 e P 4 podem ser utilizados nestes experimentos.Inicie a dissecação do camundongo decapitando-o rapidamente com tesoura afiada. Em seguida, corte ao longo da linha média ventral até alcançar a cauda. Depois, usando pinça, eviscere o camundongo e lave com a solução A CSF.Utilize a solução salina artificial com cloreto de cálcio de um milimolar para realizar a dissecação. Coloque o camundongo no recipiente de dissecação e fixe-o inserindo um alfinete em cada uma das quatro patas e um alfinete na base da cauda. Nosso objetivo nesta etapa será isolar a medula espinhal cortando ao longo da linha pontilhada vermelha, separando a coluna vertebral da lâmina que envolve a medula espinhal.Isso permitirá expor a medula espinhal. Em seguida, siga ao longo da linha para recortar as meninges e as raízes espinais, liberando a medula espinhal. Localize a coluna vertebral e use uma das mãos com uma pinça para segurar firmemente a coluna vertebral e a outra com uma tesoura pequena.Para remover a medula espinhal, mantenha a tesoura em um ângulo baixo. Para evitar perfurar a medula com as pontas da tesoura, vamos agora dissecar a medula espinhal. Seguindo ao longo da linha vermelha, corte as meninges e as raízes espinais.Para remover a medula espinhal, você pode cortar ao longo de ambos os lados da medula e, em seguida, cortar ao longo da linha média ventral. É importante manter a tesoura em um ângulo baixo para não perfurar a medula espinhal. É importante evitar cortar as raízes muito próximas à medula espinhal.Em seguida, transfira a medula espinhal para o banho de registro e conecte os eletrodos às raízes espinhais. Posicione o eletrodo próximo à raiz. Depois, usando sucção, aspire suavemente o nervo para dentro do eletrodo.Obrigado por assistir e espero que este vídeo seja útil em seus futuros experimentos.

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JoVE Journal

Biology

Biologia

A demonstração da fabricação e uso de um eletrodo de sucção extracelular usado para medir gravações eletrofisiológicas de cordas de roedores neonatal...

Spinal Cord Eletrofisiologia II: Fabricação Eletrodo de Sucção Extracelular

O vídeo demonstra a regeneração funcional das conexões proprioespinhais usando um ensaio baseado em matriz de múltiplos eletrodos (MEA). As fatias da medula espinhal são colocadas no MEA e podem se fundir. As fatias fundidas são separadas mecanicamente criando uma lesão, induzindo os neurônios proprioespinhais a crescer sobre a lesão e conectar as fatias. A atividade elétrica das fatias é avaliada para identificar a regeneração das conexões funcionais.

Estudando a regeneração de conexões funcionais entre fatias da medula espinhal usando um arranjo de múltiplos eletrodos

Este vídeo apresenta gravações eletrofisiológicas de co-culturas organotípicas de fatias da medula espinhal, capturadas usando uma matriz de múltiplos eletrodos ou dispositivo MEA. Essas gravações avaliam a regeneração neuronal entre as fatias. A atividade elétrica sincronizada observada confirma a regeneração neural bem-sucedida.

Registros eletrofisiológicos para avaliação de regenerações neuronais em fatias de medula espinhal co-cultivadas

GABAérgica inibição pré-sináptica é um poderoso mecanismo de inibição na espinal medula importante para o motor e a integração do sinal sensorial em redes da medula espinal. Subjacente despolarização aferente primário pode ser medido por registo dos potenciais de raiz dorsal (DRP). Aqui demonstramos um método in vivo de gravação de DRP em ratinhos.

Medindo Spinal pré-sináptica Inibição em Ratos por raiz dorsal Gravação Potencial<em&gt; In Vivo</em

O impulso respiratório central está localizado no tronco cerebral. A saída motora respiratória espontânea de um tronco encefálico-medula espinhal isolado é registrada pela colocação de um eletrodo na quarta raiz ventral. Essa abordagem experimental é valiosa para investigações farmacológicas ou para a avaliação de desafios respiratórios e manipulações genéticas no comportamento motor rítmico.

Eletrofisiologia no isolado do tronco encefálico-espinal Preparações do cordão umbilical de recém-nascidos Roedores permite a gravação de saída Neural Rede Respiratory

Aqui apresenta-se um protocolo que é baseado em fatias de medula espinhal cultivadas em matrizes multi-eléctrodos para estudar a regeneração funcional de ligações propriospinal in vitro.

Investigando regeneração funcional em organotï¿½icas Medula Espinhal Co-culturas cultivadas em Arrays Multi-eletrodo

Mostramos como preparar fatias oblíquas da medula espinhal em ratos jovens. Esta preparação permite que a estimulação das raízes ventrais.

A Preparação de Oblique Spinal Cord Fatias de Estimulação raiz ventral

Este manuscrito descreve métodos para registos electrofisiolicos de neurónios espinais de embriões de peixe-zebra e larvas. A preparação mantém neurónios in situ e muitas vezes envolve a dissecção mínima. Estes métodos permitem o estudo electrofisiológico de uma variedade de neurónios espinais, a partir da aquisição inicial excitabilidade eléctrica através dos primeiros estádios larvares.

zebrafish<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Preparação para gravações eletrofisiológicas da Spinal Sensorial e Motor Neurons

O uso combinado da tecnologia de matriz de microeletrodos e estimulação química induzida por 4 aminopirdina para investigar a atividade nociceptiva em nível de rede no chifre dorsal da medula espinhal é delineado.

Atividade de rede de gravação em circuitos nociceptivos da coluna vertebral usando matrizes de microeletrodos

Este protocolo descreve um método que utiliza um patch-clamp para estudar as respostas elétricas dos neurônios motores à estimulação da medula espinhal (SCS) com alta resolução espaço-temporal, o que pode ajudar os pesquisadores a melhorar suas habilidades em separar a medula espinhal e manter a viabilidade celular simultaneamente.

A Preparação Ex Vivo do Corte da Medula Espinhal para o Registro de Patch-Clamp de Células Inteiras em Neurônios Motores Durante a Estimulação da Medula Espinhal

Descrevemos um protocolo para registro extracelular multicanal espinhal juntamente com o registro da função cardíaca e análise dos neurônios do corno dorsal espinhal bloqueados cardíacos. Este método oferece uma estrutura temporalmente sincronizada para estudar os mecanismos da coluna vertebral subjacentes às alterações funcionais viscerais torácicas induzidas pela acupuntura.

Estudando os perfis de codificação da estimulação somática nas respostas neuronais cardíacas bloqueadas no corno dorsal espinhal de ratos

Aprenda a isolar a medula espinhal de camundongos neonatos para estudos eletrofisiológicos. Este método demonstra laminectomia ventral e gravação da atividade neural em eletrodos.

Spinal Cord Eletrofisiologia

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