Taxas de medição de plasma Proteína de membrana endocítica por Biotinilação reversível

Este protocolo fornece um método geral para medir a taxa de endocitose da maioria das proteínas da membrana plasmática utilizando reagentes permeabilizantes de membrana redutíveis. Neste procedimento, proteínas da superfície celular que contêm lisinas extracelulares ou são marcadas covalentemente a quatro graus Celsius com sulfonato-N-H-S-S-S-biotina, mostrado aqui em verde. Em seguida, as células são aquecidas a 37 graus Celsius para permitir a endocitose das proteínas de superfície. As células são então retornadas a quatro graus Celsius para interromper o tráfego de membrana e o biotina residual da superfície é removido usando um agente redutor que deixa intacta a ligação dissulfeto.

Assim, as únicas proteínas biotiniladas que permanecem são aquelas que se originaram na superfície celular, foram internalizadas e protegidas do procedimento de remoção. Por fim, as células são solubilizadas e as proteínas biotiniladas são isoladas por estreptavidina e cromatografia de afinidade. Olá, sou Luke Gabriel do laboratório de Heli Milk Ian, do Departamento de Psiquiatria da Escola de Medicina da Universidade de Massachusetts.

Hoje vamos mostrar um procedimento para medir taxas de endocitose ou internalização utilizando uma técnica reversível de eluição com biotina. Utilizamos este procedimento para medir a taxa de internalização do transportador de dopamina. Então, vamos começar.

Um dia antes do experimento, prepare as células e os substratos para uso no dia seguinte. Os tipos celulares e os meios variarão, mas se as células experimentais não forem fortemente aderentes, utilize um substrato apropriado de adesão celular, como placas de cultura de tecidos revestidas com polilisina, em cada seis. Em placas de seis poços, rotule um total de quatro poços utilizando duas placas separadas.

Para cada proteína testada, dois poços na placa controle serão utilizados para as amostras de proteína de superfície total e controle de remoção. Prepare um poço na placa experimental para cada condição de internalização a ser testada. Plaque um vezes 10 à sexta potência de células em dois mililitros de cultura celular, de modo que as células fiquem aproximadamente 80% confluentes até o dia seguinte.

Após o cultivo das células, prepare as seguintes soluções e armazene a quatro graus Celsius para uso no dia dois. O PBS dois mais é preparado a partir de solução salina tamponada com fosfato em pH 7,4 e suplementado com cloreto de magnésio 1,5 milimolar e cloreto de cálcio 0,2 milimolar. A solução de quench de tonação é preparada usando PBS dois mais suplementado com glicina 100 milimolar. O buffer NT é feito com cloreto de sódio 150 milimolar, EDTA 1 milimolar, BSA 0,2% e triss 20 milimolar em pH 8,6. O buffer Ripa é preparado usando triss 10 milimolar em pH 7,4, cloreto de sódio 150 milimolar, EDTA 1 milimolar, SDS 0,1%, Triton X-101% e coato de sódio desoxi.

Em seguida, prepare uma solução estoque de biotina SULF N-H-S-S-S dissolvendo em SULFOXIDE ou DMSO até uma concentração de 200 miligramas por mililitro. Prepare alíquotas de 500 microlitros e armazene a menos 20 graus Celsius. As alíquotas podem passar por vários ciclos de congelamento e descongelamento após este tris.

Uma solução estoque de cloreto de dois carboxietilfosfina ou TCEP é preparada na concentração de 500 milimolar dissolvida em 50 milimolar de tris e o pH é ajustado para 7,4. Como o TCEP é altamente ácido, o pH da solução precisará ser ajustado para 7,4, cobrir o TCEP com papel alumínio e armazenar a menos 20 graus Celsius. No segundo dia, prepare PBS dois mais suplementado com 0,18% de glicose e 0,2% de albumina sérica bovina livre de protease IgG ou PBS dois mais GBSA, pré-aquecido a 37 graus Celsius em banho-maria.

Deixe descongelar a solução estoque de biotina SFO N-H-S-S-S em temperatura ambiente. Prepare uma solução fresca de biotina enxofre N-H-S-S-S imediatamente antes do uso, agitando em vórtex. Agite vigorosamente para solubilizar o DMSO.

Coloque ambas as placas em um banho de gelo em uma sala fria e lave cada poço três vezes com dois mililitros de PBS gelado contendo dois mais, mantendo as placas em um ângulo ligeiro para drenagem completa do tampão. Após a última lavagem, adicione 0,75 mililitro por poço da solução fresca de sulfo-NHS-SS-biotina a cada poço. Incube por 15 minutos a quatro graus Celsius no banho de gelo com agitação vigorosa em um agitador orbital, logo antes do final da incubação.

Prepare outra solução fresca de biotina SUHO N-H-S-S-S e, após 15 minutos, substitua a solução antiga pela solução fresca. Incube por mais 15 minutos a quatro graus Celsius com agitação vigorosa em um agitador orbital. Após a segunda incubação, lave as células três vezes rapidamente com dois mililitros de solução de quenching para inativar todas as moléculas de biotina NHS não reativas. Em seguida, incube em dois mililitros de solução de quenching por 15 minutos.

Substitua pela solução de quenching fresca aos 15 minutos e incube por mais 15 minutos. Mantenha as placas a quatro graus Celsius com agitação suave em um agitador orbital durante cada incubação, enquanto a placa controle permanece na solução de quenching sobre a bancada no interior da câmara fria. Retire a placa experimental da câmara fria sobre o banho de gelo neste momento.

Se estiverem sendo testados tratamentos com medicamentos, adicione concentrações apropriadas de fármaco ao PBS pré-aquecido dois mais GBSA. Aqui, utilizamos um veículo de etanol ou acetato de forbol mirística a um MICROMOLAR ou PMA para ativar a via PKC. Lave cada poço da placa experimental três vezes com dois mililitros de PBS pré-aquecido dois mais GBSA, adicionando os tratamentos com fármacos apropriados após a última lavagem.

Adicione dois mililitros das respectivas soluções de PBS dois mais GBSA e complete as poças vazias com meio pré-aquecido para garantir uma temperatura uniforme em toda a placa. Transfira as células para uma incubadora a 37 graus Celsius por 10 minutos imediatamente antes do final da incubação. Prepare uma solução de eluição fresca utilizando solução de TCEP 50 milimolar em tampão NT e armazene em gelo.

Prepare uma quantidade suficiente de um mililitro por poço. Após a incubação de 10 minutos, transfira rapidamente a placa experimental para um banho de gelo e retorne à sala fria. Lave os poços experimentais três vezes com dois mililitros por poço de tampão NT gelado para interromper a endocitose.

Em seguida, lave o poço controle de eluição três vezes com dois mililitros de tampão NT gelado. Mantenha os poços controle totais na solução de quenching. Adicione um mililitro de solução de eluição a cada poço experimental e de controle de eluição e incube no gelo por 15 minutos.

Quatro graus Celsius com agitação suave antes do final da incubação. Novamente, prepare o mesmo volume de solução de remoção fresca como anteriormente. Após 15 minutos, substitua a solução de remoção antiga por solução fresca e incube por mais 15 minutos a quatro graus Celsius com agitação suave para lisar as células primeiramente.

Lave todos os poços que foram expostos à solução de desestabilização três vezes com dois mililitros de tampão NT. Em seguida, lave todos os poços, incluindo os controles totais, três vezes com dois mililitros de PBS frio. Acrescente, após a última lavagem, 300 microlitros de tampão RIPPA contendo inibidores de protease frescos a cada poço e lise as células agitando por 20 minutos a quatro graus Celsius.

Transfira o lisado para tubos microcentrífuga de 1,5 mililitro e remova os detritos celulares por centrifugação durante 10 minutos a 18.000 ×g e 4 °C. Utilize um ensaio de proteína compatível com suas condições de lise, por exemplo, o ensaio de proteína BCA da Pierce, para determinar a concentração de proteína do lisado em comparação com uma curva padrão de albumina sérica bovina. Em seguida, prepare os lisados para strep e cromatografia de afinidade.

Encha tubos microfuge de 1,5 mililitro com quantidades equivalentes de proteína de cada amostra. Neste experimento, estamos isolando proteínas biotiniladas a partir de lisados celulares de 50 microgramas. Adicione tampão RIPA contendo inibidores de protease até um volume final de 200 microlitros para cada amostra.

Em seguida, agite vigorosamente em vórtex os grânulos de estreptavidina e agarose antes de usar; com uma pipeta de 200 microlitros com a ponteira cortada, transfira 20 microlitros dos grânulos de estreptavidina e agarose para cada tubo. Agite os tubos em vórtex e incube durante a noite a quatro graus Celsius em um rotador para tubos no dia seguinte. Recolha os grânulos por centrifugação das amostras a 18.000 ×g durante dois minutos à temperatura ambiente, aspire o lisado tendo cuidado para não se aproximar do pellet de grânulos com a pipeta, e adicione 0,75 mililitros à temperatura ambiente.

Adicione tampão de remoção a cada tubo e vortexe na velocidade máxima para lavar as esferas. Centrifugue a 18.000 ×g por dois minutos. À temperatura ambiente, recolha as esferas e repita este ciclo de lavagem, vortex e centrifugação mais duas vezes, totalizando três lavagens após a lavagem final.

Aspire o máximo possível do tampão sem perturbar o pellet de microesferas. Em seguida, adicione de 20 a 25 microlitros de tampão redutor 2x a cada tubo. O agente redutor clivará a ligação dissulfeto de biotina N-H-S-S-S, liberando as proteínas isoladas em solução.

Como a maioria das proteínas de membrana não tolera fervura, incubar os tubos em um rotator por 30 minutos à temperatura ambiente após a redução e desnaturação para separar as proteínas. Utilizando uma eletroforese padrão em gel de SDS, transferir as proteínas para uma membrana para imunodetecção e realizar o blot com um anticorpo apropriado. Neste experimento, utilizamos o anticorpo anti-DAT de rato da Chemicon, número 3609, em uma diluição de 1:2000, capturando as bandas imunorreativas usando um sistema de documentação de géis com câmera CCD, certificando-se de que não haja pixels saturados. Neste experimento, utilizamos um sistema de imagem BioRad VersaDoc com software Quantity One para quantificar a densidade de cada banda.

Um imunobloco representativo do procedimento reversível na dopamina transportadora é mostrado aqui. O sinal mais forte corresponde à quantidade total de proteína de superfície antes da internalização, observada na via total ou T. O controle de remoção, ou S, idealmente deve ser próximo ao branco e demonstrar alta eficiência de remoção. A eficiência de remoção é calculada utilizando as medidas de densidade das bandas na fórmula a seguir.

Esta tira neste experimento foi de 99,8% eficiente. Tirass com eficiência maior ou igual a 90% são ideais e os resultados abaixo desse nível devem ser descartados. Este exemplo de uma tira de poros mostra uma banda visível na faixa da tira com uma eficiência de 34%. Aqui, as faixas de menor intensidade são as faixas de internalização da placa experimental. As células foram tratadas com solução veicular ou com um micromolar de PMA durante uma internalização de 10 minutos e as taxas de internalização do transportador de dopamina foram medidas.

A taxa de internalização é calculada utilizando medições de densidade de banda da seguinte forma: conforme visto neste gráfico, 10,4% da DAT de superfície foi internalizada ao longo de 10 minutos sob condições tratadas com veículo. Porém, o tratamento com PMA aumentou as taxas de internalização da DAT para 23,2% da DAT total de superfície. Assim, você acabou de ver como medir as taxas de internalização de proteínas da membrana plasmática utilizando uma técnica reversível de biotinilação.

É importante lembrar duas coisas: preparar recentemente o reagente de biotonação, bem como o TCP, imediatamente antes do uso. Se você notar perda significativa de células durante o protocolo, utilize um substrato de adesão celular em suas placas. É isso aí.

Obrigado por assistir e boa sorte com seu experimento.