Sinapses pré-sináptico Silencioso Estudou com Microscopia de Luz

Alguns terminais pré-sinápticos no sistema nervoso central parecem não funcionais ou silenciosos. Aqui apresentamos um protocolo para identificação de terminais pré-sinápticos silenciosos. Este protocolo pode ser aplicado para identificar tratamentos e manipulações suspeitos de silenciar ou despertar terminais.

O protocolo combina a marcação de corantes vitais de vesículas sinápticas durante a despolarização neuronal com a marcação subsequente de células fixas com um anticorpo que rotula todos os terminais pré-sinápticos, silenciosos e ativos. Synapsis. Co marcado com corante e anticorpo são ativos. As sinapses marcadas apenas por anticorpos são silenciosas.

Olá, sou Amanda Taylor, do laboratório do Dr. Steve Minick no Departamento de Psiquiatria da Escola de Medicina da Universidade de Washington. Eu sou Shahin também do Manic Lab. Hoje gostaríamos de mostrar seu procedimento para visualizar terminais pré-sinápticos silenciosos usando neurônios do hipocampo cultivados.

Usamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar como a atividade elétrica e as outras vias de noling simples para modular a liberação de neurotransmissores. Então vamos começar. Em uma capa de fluxo laminar estéril, use HIPA não pode comprar do dia zero pós-natal a três ratos ou camundongos para preparar culturas de células dissociadas.

De acordo com nosso protocolo publicado, nossas culturas são gliais mistas As culturas derivadas das mesmas células de dissecção devem ser semeadas em placas estéreis de 35 milímetros. Cada um contendo uma lamínula número zero que foi revestida com cinco miligramas por mililitro de placa de colágeno. Os neurônios com uma densidade aproximada de 500 células por centímetro quadrado.

12 filhotes de ratos normalmente produzem 30 pratos de 35 milímetros. Permita que as culturas cresçam em uma incubadora de culturas por 10 a 14 dias. Para o desenvolvimento sináptico e maturação, adicione o antimitótico a C para interromper o crescimento glial no dia in vitro quatro.

Também no quinto dia in vitro, realizar uma troca de meio meio com meio neurobasal mais suplemento B 27 para aumentar a sobrevivência neuronal durante este período de maturação. Introduzir tratamentos que alterem o número de sinapses pré-sinápticas silenciosas. Descobrimos que uma maneira conveniente de silenciar uma grande porcentagem de sinapses de glutamato é um tratamento de quatro horas com 30 milimolares de potássio.

Quando as culturas estão maduras, os neurônios devem ter uma densidade relativamente baixa com processos neuróticos bem separados e extensos. Retire as culturas da incubadora e leve-as para a bancada. Substituir o meio de cultura por uma solução salina tamponada contendo 45 milimolares de cloreto de potássio e 10 micromolares de FM 1 43 FX.

Esta solução também deve conter NBQX e A PV para evitar sinalização recorrente. É importante que a solução de estoque FM 1 43 FX e os experimentos sejam mantidos no escuro para evitar o fotobranqueamento. Portanto, cubra os pratos de cultura com papel alumínio para todas as etapas de incubação subsequentes.

Incubar por exatamente dois minutos em temperatura ambiente. Remova a solução de corante e lave por apenas três a cinco segundos em pilhas de solução salina tamponada com adversivo 500 micromolar. Sete. Para remover o tempo de corante não específico nesta etapa é fundamental.

Como exposição prolongada a adv adverso F sete removerá toda a rotulagem FM 43 FX. Em seguida, lave as células e montes de solução salina tamponada sem adverso adv. Sete por cinco intervalos de dois minutos em uma capela de exaustão química.

Fixe as culturas em 4% de paraldeído e 0,2% de glutaraldeído em PBS por 10 minutos. Lave as células brevemente com PBS. As células agora podem ser movidas para fora da hotte.

Adicione a solução de bloqueio contendo 4% de soro de cabra normal e 0,04% de tritton X para reduzir o fundo e permanenter as células para coloração imunológica. Incube por 15 minutos. Manchar as células com um anticorpo vlu T diluído para um a 2000 em solução de bloqueio.

Incubar as culturas em anticorpos com balanço suave durante três horas. Lave as células quatro vezes com PBS. Incube as células com Alexa.

6 47 anticorpo conjugado anti-cobaia diluído a um a 500 em solução de bloqueio. Manter as culturas no anticorpo secundário com um balanço suave durante 30 minutos. Lave as células mais quatro vezes com PBS.

Coloque uma pequena gota da quantidade do piso em uma lâmina de vidro limpa usando uma pinça. Pegue uma lamínula e abaixe-a suavemente sobre a queda das células de piso voltadas para o slide. Deixe a lâmina secar durante a noite.

Prepare uma objetiva de óleo 60 x em um microscópio confocal de varredura a laser. Coloque um slide no palco de forma que a lamínula fique voltada para o objetivo. Encontre um campo de neuritos que não seja excessivamente denso e que esteja longe do soma que pode reter corante residual.

Amplie para um tamanho de campo de 51 por 51 mícrons. Usando software de aquisição de imagem. Adquira uma pilha ZS cobrindo uma profundidade de 7,8 mícrons em 27 etapas de 0,3 mícrons para cada etapa.

Escaneie primeiro o anticorpo VLU T um para identificar todas as sinapses glutamatérgicas no campo. Em seguida, verifique novamente a fluorescência FM 1 43 FX para analisar as imagens após a aquisição. Use o software de análise para converter a aderência Z em uma imagem composta de plano único com base na leitura de intensidade máxima de qualquer plano em cada limite definido de pixels.

Para reduzir o fundo, identifique os terminais VG glu T one sem referência à mancha de efeitos FM 1 43. E marque esses pontos como regiões de interesse. Normalmente selecionamos 10 PUNTA por campo.

Repita o limiar e a seleção de pontos na imagem de efeitos FM 1 43 e sobreponha as imagens para identificar sinapses silenciosas. Um critério de pixel absoluto ou um critério de pixel percentual pode ser usado para distinguir as sinapses FM 1 43 positivas ativas das FM 1 43 negativas inativas. Em nossas culturas, descobrimos que 70 a 80% das sinapses de glutamato definidas pela coloração V glut um exibem coloração FM 1 43 detectável em imagens sobrepostas de fluorescência verde FM 1 43 e coloração vermelha V glut um.

Isso é evidente como uma abundância de sinapses de puncta amarelas com marcadores colocalizados. Estes são indicados pelas setas. Aproximadamente 20 a 30% do excesso de V vermelho um ponto positivo não terá fluorescência verde FM 1 43 acima da linha de base.

Estes são os terminais pré-sinápticos inativos e um exemplo é indicado pela ponta da seta. Uma terceira população de sinapses também será observada. Estes são positivos para fluorescência verde FM 1 43, mas desprovidos de coloração vermelha B glut um.

Estas são sinapses GABAérgicas ativas e um exemplo é indicado pelo asterisco. Estes são excluídos da maioria de nossas análises, mas podem ser explicitamente estudados usando um anticorpo transportador vesicular GABA. No lugar do anticorpo VLU T one, acabamos de mostrar como visualizar sinapses pré-sinápticas silenciosas usando a coloração imunológica FM 1 43 e VLU one.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que o FM 1 43 FX é sensível tanto ao tempo na lavagem sub sete do adver quanto à concentração do tratamento X 100 incluído na solução de bloqueio. Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.