Sinapses pré-sináptico Silencioso Estudou com Microscopia de Luz

Algumas terminações pré-sinápticas no sistema nervoso central parecem ser não funcionais ou silenciosas. Aqui apresentamos um protocolo para identificar terminações pré-sinápticas silenciosas. Este protocolo pode ser aplicado para identificar tratamentos e manipulações que se suspeita serem capazes de silenciar ou ativar terminações.

O protocolo combina a marcação com corante vital de vesículas sinápticas durante a despolarização neuronal com a subsequente marcação de células fixadas com um anticorpo que marca todos os terminais pré-sinápticos, tanto silenciosos quanto ativos. Sinapses marcadas pelo corante e pelo anticorpo são ativas. Sinapses marcadas apenas pelo anticorpo são silenciosas.

Olá, sou Amanda Taylor do laboratório do Dr. Steve Minick, do Departamento de Psiquiatria da Escola de Medicina da Universidade de Washington. Sou Shahin, também do Laboratório Manic. Hoje gostaríamos de mostrar o seu procedimento para visualizar terminais pré-sinápticos silenciosos utilizando neurônios hipocampais cultivados.

Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar como a atividade elétrica e outras vias de sinalização única modulam a liberação de neurotransmissores. Vamos começar. Em uma capela de fluxo laminar estéril, utilize HIPA e compre ratos ou camundongos do dia pós-natal zero a três para preparar culturas celulares dissociadas.

De acordo com nosso protocolo publicado, nossas culturas são culturas gliais mistas derivadas das mesmas células de dissecação que devem ser semeadas em placas estéreis de 35 milímetros. Cada uma contendo um lamínula número zero revestida com cinco miligramas por mililitro de colágeno tipo I. Os neurônios numa densidade aproximada de 500 células por centímetro quadrado.

12 filhotes de rato normalmente produzirão 30 a 35 placas de milímetro. Deixe as culturas crescerem em incubadora por 10 a 14 dias. Para o desenvolvimento e maturação sinápticos, adicione o agente anti-mitótico a C para interromper o crescimento glial no quarto dia in vitro.

Também no quinto dia in vitro, realize uma troca parcial do meio com meio neurobasal acrescido do suplemento B27 para melhorar a sobrevivência neuronal durante este período de maturação. Introduza tratamentos que alterem o número de sinapses silenciosas pré-sinápticas. Verificamos que uma maneira conveniente de silenciar uma grande porcentagem de sinapses de glutamato é um tratamento de quatro horas com potássio 30 milimolar.

Quando as culturas estiverem maduras, os neurônios devem apresentar uma densidade relativamente baixa, com prolongamentos neuríticos bem separados e extensos. Remova as culturas do incubador e leve-as para a bancada. Substitua o meio de cultura por uma solução salina tamponada contendo 45 milimolares de cloreto de potássio e 10 micromolares do corante FM 1 43 FX.

Essa solução também deve conter NBQX e A PV para prevenir a sinalização recorrente. É importante que a solução estoque de FM 1 43 FX e os experimentos sejam mantidos no escuro para evitar o desbotamento pela luz. Portanto, cubra as placas de cultura com papel alumínio em todos os passos subsequentes de incubação.

Incube por exatamente dois minutos à temperatura ambiente. Remova a solução de corante e lave por apenas três a cinco segundos em tampão salino com 500 micromolares de adversivo.Sete. Para remover o corante não específico, o tempo nesta etapa é crítico.

A exposição prolongada ao adv adverse F seven removerá toda a marcação com FM 43 FX. Em seguida, lave as células com tampão salino sem adv adverse. Sete intervalos de cinco minutos cada em uma capela de exaustão química.

Fixe os cultivos em paraformaldeído 4% e glutaraldeído 0,2% em PBS por 10 minutos. Lave brevemente as células com PBS. As células podem agora ser removidas da câmara de fluxo laminar.

Adicione solução bloqueadora contendo 4% de soro normal de cabra e 0,04% de Triton X para reduzir o fundo e permeabilizar as células para coloração imunológica. Incube por 15 minutos. Revele as células com o anticorpo primário vlu T diluído na proporção de 1:2000 na solução bloqueadora.

Incube as culturas com o anticorpo sob agitação suave por três horas. Lave as células quatro vezes com PBS. Incube as células com Alexa.

Anticorpo secundário conjugado com 647 anti-porquinho-da-índia diluído na proporção de 1:500 na solução bloqueadora. Mantenha as culturas no anticorpo secundário com agitação suave durante 30 minutos. Lave as células mais quatro vezes com PBS.

Coloque uma pequena gota de quantidade mínima em uma lâmina de vidro limpa utilizando pinças. Pegue uma lamínula e abaixe-a suavemente sobre a gota, com as células de quantidade mínima voltadas para a lâmina. Deixe a lâmina secar durante a noite.

Prepare um objetivo de imersão em óleo de 60 x em um microscópio confocal de varredura a laser. Coloque uma lâmina na platina de modo que o lamínula esteja voltado para o objetivo. Localize um campo de neuritos que não seja excessivamente denso e que esteja afastado do corpo celular, o qual pode reter corante residual.

Aumente o zoom para um tamanho de campo de 51 por 51 mícrons. Utilizando o software de aquisição de imagens, adquira uma pilha ZS cobrindo uma profundidade de 7,8 mícrons em 27 etapas de 0,3 mícrons cada.

Primeiro, faça uma varredura com o anticorpo VLU T um para identificar todas as sinapses glutamatérgicas no campo. Em seguida, faça uma nova varredura para a fluorescência de FM 1 43 FX para analisar as imagens após a aquisição. Utilize um software de análise para converter a pilha Z em uma imagem composta de plano único com base na leitura de intensidade máxima de qualquer plano em cada limiar definido de pixels.

Para reduzir o fundo, identifique terminais VGluT1 sem referência à coloração com o corante FM 143. E marque esses pontos como regiões de interesse. Normalmente selecionamos 10 pontos por campo.

Repita o limiar e a seleção de pontos na imagem de efeitos do FM 1 43 e sobreponha as imagens para identificar sinapses silenciosas. Um critério absoluto de pixels ou um critério percentual de pixels pode ser usado para distinguir sinapses ativas positivas para FM 1 43 das inativas negativas para FM 1 43. Em nossas culturas, observamos que de 70 a 80% das sinapses glutamatérgicas definidas pela marcação de V glut um exibem marcação detectável de FM 1 43 em imagens sobrepostas da fluorescência verde do FM 1 43 e da coloração vermelha de V glut um.

Isso é evidente pela abundância de sinapses pontuais amarelas com marcadores codistribuídos. Estas são indicadas pelas setas. Aproximadamente 20 a 30% das pontuações positivas para Vglut1 vermelhas não apresentarão fluorescência verde de FM 1-43 acima da linha de base.

Esses são os terminais pré-sinápticos inativos e um exemplo é indicado pela seta. Uma terceira população de sinapses também será observada. Essas são positivas para a fluorescência verde do FM 1 43, mas desprovidas de marcação vermelha do B glut um.

Essas são sinapses GABAérgicas ativas e um exemplo é indicado pelo asterisco. Elas são excluídas da maioria das nossas análises, mas podem ser estudadas explicitamente utilizando um anticorpo contra o transportador vesicular de GABA. No lugar do anticorpo VLU T um, acabamos de mostrar como visualizar sinapses silenciosas pré-sinápticas usando FM 1-43 e imunomarcação com VLU um.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que o FM 1 43 FX é sensível tanto ao tempo na lavagem adver sub seven quanto à concentração do X 100 utilizado na solução bloqueadora. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.