Name: A observação direta de Enzimas DNA Replicação Usando um DNA molécula única Alongamento Assay (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-23T17:30:00.000+00:00
Duration: 17 min 3 s
Description: Aprenda a observar a replicação do DNA em tempo real usando microscopia óptica de campo amplo e DNA lambda linearizado. Este método permite visualizar a dinâmica das fitas líder e retardada em nível de molécula única.

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O desenvolvimento do DNA que se estende do ensaio foi auxiliado por Paulo Blainey, Lee Jong-Bong, e Hamdan Samir. Este trabalho é apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde concede a Charles Richardson (GM54397), e Antoine van Oijen (GM077248).

1. Modelo de replicação do DNA DNA para a reação é um DNA λ linearizada modificado por anelamento de oligonucleotídeos para formar uma forquilha de replicação. Além disso, biotina é anexado ao final de uma vertente do DNA λ, e uma porção digoxigenina está ligado à outra extremidade do fio mesmo 1. Materiais: Bacteriófago λ DNA, Oligonucleotídeos: braço garfo biotinilado (A: 5'-biotina-AAAAAAAAAAAAAAAAGAGTACTGTACGATCTAGCATCAATCACAGGGTCAGGTTCGTTATTGTCCAACTTGCTGTCC-3 '), λ-complementares braço fork (B: 5'-GGGCGGCGACCTGGACAGCAAGTTG GACAATCTCGTTCTATCACTAATTCACTAATGCAGGGAGGATTTCAGATATGGCA-3'), primer fork (C: 5 ' -TGCCATATCTGAAATCCTCCCTGC-3 '), fim digoxigenina λ-complementares (D: 5'-AGGTCG CCGCCCAAAAAAAAAAAA-digoxigenina-3'), DNA Ligase T4, T4 polinucleotídeo quinase, bloco Heat. <ol><li> Fosforilar termina a 5 'de oligonucleotídeos B e D utilizando Quinase Polinucleotídeo T4. </li><li> Recozer oligonucleotides A, B e C para o DNA λ em uma única etapa, adicionando um excesso de 10 vezes de oligonucleotídeos A e B, e um excesso de 100 vezes de oligonucleotídeo C em tampão T4 DNA ligase. </li><li> Aquecer a mistura a 65 ° C no bloco de calor. Uma vez aquecida, por sua vez o bloco de calor e deixe resfriamento lento corretamente anneal oligonucleotides. </li><li> Adicionar DNA ligase T4 à mistura e incubar à temperatura ambiente por 2 horas. Ligase T4 DNA vai catalisar a correta união de oligonucleotides A e B e DNA λ. </li><li> Finalmente, recozer a D oligonucleotídeo para o modelo de replicação do DNA pela adição de 100 vezes o excesso de oligonucleotídeo D com respeito ao DNA l em tampão T4 DNA ligase. </li><li> Incubar a mistura a 45 ° C por 30 min no bloco, calor e arrefecer à temperatura ambiente girando lentamente bloco calor fora. </li><li> O modelo de replicação final DNA está pronto para uso. Nós armazenar o modelo em uma concentração de 1,4 nM a 4 ° C por várias semanas. </li></ol> 2. Contas Contas são funcionalizados com um fragmento Fab, com especificidade para digoxigenina. Eles podem ser então anexado ao modelo de dois DNA de replicação. Materiais: Tosil contas ativado, α-digoxigenina fragmento Fab, tampão A: 0,1 M pH 9,5 H3BO3, tampão B: 0,1 M PBS pH 7,4, 0,1% w / v BSA, Buffer C: 0,2 M Tris-HCl pH 8.5 (25 ° C), 0,1% w / v BSA, separador magnético, Rotator. <ol><li> Ressuspender a solução estoque de contas e transferência de uma alíquota pequena dentro do tubo eppendorf. Colocar o tubo em um slot do separador magnético e incubar até que a solução limpa, em seguida, retire o sobrenadante por pipetagem. </li><li> Adicionar Um buffer, que irá ativar grupos tosila para acoplamento de anticorpos. Misture delicadamente por pipetagem e remover do buffer com o separador magnético. </li><li> Adicionar fragmento Fab e contas ressuspender novamente em tampão A, misture bem e incubar 16-24 horas a 37 ° C usando rotador. Após a incubação, contas separadas usando o separador magnético e remover buffer. </li><li> Lavar contas adicionando tampão B e incubar a 4 ° C por 5 min. Remover o buffer usando separador magnético. Repetir a lavagem duas vezes. </li><li> Adicionar tampão C e incubar a 37 ° C por 4 horas para bloquear grupos tosila livre. Contas separadas usando separador magnético e remover buffer. </li><li> Lavar duas vezes em tampão B e alíquotas para o uso. Contas podem ser armazenados a 4 ° C por 1 ano ou mais sem perda substancial de qualidade (nossa solução estoque contém 1 - 2x10 9 esferas / ml). </li></ol> 3. Lamelas funcionalizados Para permitir a ligação do DNA à lamela de vidro, o vidro é o primeiro funcionalizados com um aminosilane, que é acoplado a moléculas de PEG biotinilado. Este revestimento ajuda a reduzir as interações não específicas de DNA e proteínas de replicação com a superfície 3,4. Materiais: lamínulas de vidro, potes de coloração, 3-aminopropyltriethoxysilane, Methoxy-PEG5k NHS-éster, Biotina-PEG5k-NHSester, acetona, 1M KOH, Etanol, Forno sonicador Bath, <ol><li> Limpam-se as lamínulas de vidro, colocando-os na coloração frascos e encher os frascos com etanol. Sonicado por 30 minutos, enxaguar os frascos e encher com 1 M KOH. Repita os dois lavagens. </li><li> Para a reação de funcionalização em primeiro lugar, todos os vestígios de água precisam ser removidos. Enchei as talhas de acetona e sonicate por 10 min. Vazio e encher novamente com acetona. </li><li> Prepare uma solução 2% v / v do reagente silano em acetona. Adicionar ao tinas de coloração e agitar por 2 minutos. Esta reação casais do grupo de alcóxi de aminosilane ao vidro, deixando uma amina reativos para a etapa seguinte de acoplamento. Saciar a reação com um grande excesso de água. </li><li> Seca as lamelas cozendo-los em 110 °; C no forno por 30 minutos. </li><li> Prepare um metoxi 50:1: biotina mistura PEG em 100 mM NaHCO 3 pH 8.2. Apontar para cerca de 0,2% PEG w / v biotinilado. </li><li> Pipetar 100 mL da mistura PEG em uma lamela seca silanizadas e colocar outra lamínula por cima. Incluindo um espaçador lamela de vidro vai permitir a separação das lamelas. </li><li> Incubar as lamelas na solução de PEG por 3 horas, em seguida, separe cada par de lamelas e lavar abundantemente com água. Tenha cuidado para manter as lamelas funcionalizados lateral-se como apenas o lado uma vez serão revestidas com PEG. </li><li> Seca as lamelas com o ar e armazenar sob vácuo em exsicador. As superfícies de permanecer estável por pelo menos um mês, assim que dezenas de lamelas podem ser feitas em um lote e usado quando necessário. </li></ol> 4. Preparação câmara de fluxo O experimento é realizado com uma câmara de fluxo simples construída com uma lamela funcionalizados, fita dupla face, uma lâmina de quartzo e tubo. Uma câmara de fluxo está preparado para cada experimento uma única molécula de 2,4. Materiais: fita dupla face, lâmina de barbear, lâmina de quartzo com furos para tubos de epóxi, de secagem rápida, lamela funcionalizados, estreptavidina solução (25 mL de 1 mg / mL em PBS), tubulação, tampão de bloqueio (5X: 20 mM Tris pH 7.5, 2 mM EDTA, 50 mM NaCl, 0,2 mg / mL BSA, 0,005% Tween-20), buffer de trabalho (1X: 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 2 mM EDTA, 50 mM NaCl). <ol><li> Comece por misturar e colocar 5 mL de tampão de bloqueio e 20 ml de tampão trabalhando em um dessecador para remover quaisquer bolhas de ar para etapas posteriores. </li><li> Dê uma lamela PEG-funcionalizados e espalhar 125 de PBS-diluída solução de estreptavidina sobre a superfície. Deixar isso para incubar por 20 minutos em temperatura ambiente enquanto prepara outras partes da câmara, permitindo estreptavidina para ligar a Biotins superfície. </li><li> Corte um pedaço de fita dupla face para corresponder ao tamanho da lâmina de quartzo. Marcar a posição dos furos de tubos na fita para que um esboço da câmara de fluxo podem ser tiradas na fita. </li><li> Faça um canal central de 3 mm de largura e retângulos contendo dois buracos. Nós usamos câmaras de fluxo, com dois de entrada e duas de saída em forma de Y canais. </li><li> Corte ao longo do contorno desenhado, tornando reto, cortes limpos para garantir que nenhum sobressaia adesivo para o canal. </li><li> Limpe o quartzo, cuidadosamente, com acetona ou etanol para remover adesivo da construção anterior de fluxo de células. </li><li> Encontrar o melhor alinhamento do contorno do canal, remove um dos lados da camada adesiva e coloque cuidadosamente a fita sobre a lâmina de quartzo. Tenha o cuidado de alinhar a fita corretamente, como os buracos de entrada e saída necessidade de permanecer desbloqueados. </li><li> Cortar comprimentos de tubulação para a entrada e saída da célula de fluxo. Isso ajuda a cortar a extremidade do tubo em cerca de um ângulo de 30 ° para que o tubo não vai pressionar plana contra o fundo de câmara. Colocar os tubos em algum tipo de apoio (suportes de tubos, por exemplo) para suspendê-las para fixação fácil a célula de fluxo nas próximas etapas. </li><li> Lavar a lamela estreptavidina revestida abundantemente com água e seque com ar comprimido. Lembre-se que apenas um lado é funcionalizada. Remover o outro lado do suporte de fita e colocar a lâmina de quartzo para a lamela. </li><li> Pressione levemente na lamela a empurrar para fora todo o ar aprisionado no adesivo. Isso ajudará a evitar as bolhas de ar entrando no canal de fluxo. </li><li> Vedação dos lados da câmara com epóxi. Insira o tubo de corte nos orifícios do quartzo e foca no lugar com epóxi. Isso precisa secar por alguns minutos. </li><li> Depois de seco, comece a bloquear a superfície, puxando alguns dos desgaseificados tampão de bloqueio através de um dos tubos. A agulha calibre 21 se encaixa perfeitamente dentro do tubo de 0,76 milímetros. Lavar algumas vezes para remover bolhas de ar, e permitir que a câmara para incubar por pelo menos meia hora. </li></ol> 5. Única molécula Experiment Replicação Uma vez que o modelo de DNA e contas funcionalizados foram preparadas, ea câmara de fluxo está pronto, uma experiência única molécula pode ser realizada. Materiais: câmara de fluxo preparados, tampão de bloqueio (5X: 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 2 mM EDTA, 50 mM NaCl, 1 mg / mL BSA, 0,025% Tween-20) buffer, de trabalho (1X: 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 2 mM EDTA, 50 mM NaCl), buffers de replicação T7 com ou sem 10 mM MgCl 2 (1X: 40 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM K-glutamato, 2 mM EDTA, 100 mg / ml BSA, 10 mM TDT, 600 mM dNTPs), proteínas de replicação, microscópio óptico invertido com objetiva de 10X, câmera CCD, um ímã permanente de terras-raras, bomba de seringa, airspring, iluminador de fibra, computador com software de aquisição de imagem. <ol><li> Após a célula de fluxo foi bloqueado, ele está pronto para começar o experimento. </li><li> Pegue a célula de fluxo e colocá-lo no palco microscópio. Segure a câmara no lugar com clipes de estágioe certifique-se que o canal de fluxo é posicionado em alinhamento com a câmara CCD. </li><li> Conecte o fluxo de saída de tubos de célula para a airspring usando um tubo conector maior diâmetro ou uma agulha. O airspring é usado para estabilizar as irregularidades de fluxo. Um tubo de plástico de 50 ml é preenchida com 45ml de água. A tampa do tubo é selada com epóxi. Três buracos são perfurados na tampa, e três pedaços de tubos são inseridos no tubo. Usando epoxy, os tubos são, então, selados para a tampa, impedindo o ar de entrar ou escapar. O airspring está conectado à bomba de seringa, e os tubos de saída da célula de fluxo. </li><li> Coloque os tubos de entrada da célula de fluxo em tampão de bloqueio e puxe a seringa para remover qualquer ar no tubo. Um filme suave do tubo de saída vai ajudar a limpar as bolhas de ar aprisionado na célula de fluxo. </li><li> Uma vez que todas as bolhas de ar foram removidos, a um quarteirão dos tubos de entrada com uma agulha, e um dos tubos de saída, dobrando-em 1800 e proteger o tubo com fita adesiva. </li><li> Diluir o modelo de DNA de ações para 22:00 em 1 ml de tampão de bloqueio desgaseificados. Fluxo para a câmara de fluxo moderado para permitir a cobertura boa superfície de DNA (0,01-0,05 ml / min por 20 minutos funciona bem). Isto pode ser variado com base em quantas moléculas de DNA estão na superfície para cada lote de lamelas ou quantos forem desejados para o experimento. </li><li> Diluir a solução estoque talão a 2 4x10-6 contas / ml em 1 ml de tampão de bloqueio desgaseificados. Fluxo para a câmara de 0,01-0,05 ml / min por 15 minutos. </li><li> Uma vez que contas são adicionados, por sua vez o fluxo e deixe câmara para alcançar o equilíbrio. Em seguida, fechar tubos tanto de saída. Quaisquer alterações aos tubos sem a câmara fechada vai causar flutuações de pressão que irá exercer uma força sobre as contas e corte as moléculas de DNA amarrados. </li><li> Bloquear o tubo de entrada que foi usado para carregar contas com uma agulha, e começar a lavar a célula de fluxo usando a entrada em segundo lugar com solução 1X desgaseificados de tampão de bloqueio em tampão de trabalho. Lavar exaustivamente a uma taxa de 0,01-0,05 ml / min. Agitar manualmente o palco tocando para remover quaisquer contas inespecificamente preso à superfície ( <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1689/Tapping.avi">Tapping</a> ). </li><li> Uma vez que contas livres são suficientemente afastados, por sua vez o fluxo e deixe câmara para alcançar o equilíbrio. Fechar o tubo de saída aberta e mudar o reservatório de entrada para solução de proteína, lentamente abertura da tomada para evitar mudanças de pressão rápida </li><li> Você pode verificar se contas são amarrados ao DNA pela mudança de direção do fluxo ( <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1689/DNA.avi">DNA</a> ). </li><li> Agora, a reação enzimática pode ser realizada. Experimentos para a vertente levando-síntese de fazer a solução de 20nm de gp4 helicase e solução de 20nm GP5 polimerase (purificada como um complexo com o seu thioredoxin fator de processabilidade) em tampão desgaseificados replicação T7, que não contém MgCl 2. </li><li> Fluxo da solução de proteína na câmara a taxa de fluxo moderado para permitir a ligação eficiente de DNA. Usamos 0,037 ml / min durante 8 minutos, e depois 0,012 ml / min durante 7 minutos. </li><li> Lave a câmara com tampão desgaseificados replicação T7 sem MgCl 2 para remover proteínas livres. A taxa de 0,037 ml / min por 3-10 minutos funciona bem. </li><li> Após a lavagem, o fluxo de buffer de replicação T7 com MgCl 2 e começar a aquisição de dados. Use um fluxo de 0,012 ml / min, correspondendo a 3 força de arrasto sobre as amarras pN DNA em condições descritos neste protocolo. </li><li> Coloque um ímã permanente de terras-raras acima da célula de fluxo antes de imagem para evitar interações inespecíficas entre contas e de superfície. </li><li> Ver campo com uma objetiva de 10X e câmera CCD. Foco usando um cordão amarrado. </li><li> Posição de um iluminador de fibra em um ângulo de incidência entre 10 graus e paralelo ao estágio do microscópio perto do microscópio. Em campo escuro iluminação é usada para aumentar o contraste da imagem talão. </li><li> Aquisição de dados de 20 30 min em um frame rate lenta (tipicamente 2-4 Hz). </li></ol> 6. Resultados representante Em um experimento bem sucedido você deve ser capaz de observar mais de 100 contas simultaneamente ( <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1689/Leading_strand_synthesis.avi">síntese vertente Leading</a> ). O experimento deve render numerosos vestígios exibindo a síntese de DNA levando vertente. Análise de dados: A fim de medir as taxas e processivities de DNA descontrair e polimerização, as posições precisas de contas deve ser determinado. Você pode alcançá-lo pela montagem dessas posições com funções de 2-dimensional de Gauss. Trajetórias podem ser extraídas através do rastreamento posição grânulo em cada quadro usando software de rastreamento (DiaTrack por exemplo). Agora você está pronto para visualizar trajetórias traçando posição talão como uma função do tempo usando qualquer gráfico paraftware (Origin, por exemplo). Para obter dados de taxa, o ajuste das parcelas com uma regressão linear e calcular o declive. Para processabilidade, determinar o comprimento total do DNA do início ao fim de um evento de encurtamento (Figura 3). Ambos estes números terão de ser convertido em pares de bases. Para converter o movimento de contas para pares de bases, primeiro você precisa para medir o comprimento de uma molécula de DNA λ esticada na taxa de fluxo de reação. Uma vez que o comprimento do DNA λ é conhecido (48.502 bp), você pode calibrar o número de pares de base / pixel de força experimental. Para maior precisão, subtrair a partir de vestígios de interesse um traço fundamental de um corda do grânulo que não é enzimaticamente alterada. Combine todas as medições individuais e taxa de enredo e distribuições processabilidade. Ajustar os dados utilizando as funções de Gauss e single-exponencial, respectivamente (Figura 3). <img src="/files/ftp_upload/1689/1689fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Molécula única configuração experimental. (A) Duplex λ DNA (48,5 kb) está ligado à superfície da célula de fluxo através da extremidade 5 'de uma fita usando uma interação biotina-estreptavidina, ea extremidade 3' da fita mesmo é anexado a um cordão com um digoxigenina interação anti-digoxigenina. A forquilha de replicação está ferrado, formada na extremidade oposta o talão para permitir o carregamento da polimerase. (B) Bead-DNA conjuntos são distendidos com fluxo laminar de buffer e fotografada usando de campo amplo microscopia óptica. Ao rastrear as posições das contas ao longo do tempo, mantendo uma força constante de alongamento, os comprimentos das construções de DNA pode ser monitorado. (C) perfil de Extensão da ssDNA (círculo preenchido) e dsDNA (círculo aberto) sob forças baixo. A linha tracejada mostra duração cristalográfica da plena ds-DNA λ, 16,3 mM. A grande diferença de comprimento entre ssDNA e dsDNA em forças em torno de 3 pN permite uma observação direta de conversões entre ss-dsDNA e por acompanhar as alterações no comprimento do DNA. A visualização simultânea de um grande número de DNA-coupled contas permite o estudo de muitos replisomes individuais em um experimento. <img src="/files/ftp_upload/1689/1689fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2 proteínas Bacteriófago T7 replicação:. DNA polimerase (complexo de GP5 e thioredoxin) e DNA helicase (gp4) sintetizar fita de DNA líder na presença de desoxirribonucleótidos e magnésio. Este processo é acompanhado pelo encurtamento da cadeia de DNA em atraso devido à enrolando. Conversão de dsDNA em ssDNA muda de posição do talão. Medir posição do talão permite a determinação precisa da velocidade e processabilidade de replicação do DNA. <img src="/files/ftp_upload/1689/1689fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Exemplo de dados típicos de uma única molécula-líder fio-experimento de síntese. Processabilidade da replicação do DNA é igual a um comprimento total do DNA do início ao fim de um evento de encurtamento. A taxa de replicação do DNA é obtido pela montagem do enredo com uma regressão linear e calcular o declive. A taxa mostra inset e distribuições processabilidade que foram obtidos pela combinação de dados de uma série de medições. Os dados foram equipados com funções de Gauss e single-exponencial, respectivamente.

<ol><li>Lee, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+primase+acts+as+a+molecular+brake+in+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">DNA primase acts as a molecular brake in DNA replication.</a> Nature. 439, 621-624 (2006).</li>
<li>Tanner, N. A., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+observation+of+prokaryotic+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule observation of prokaryotic DNA replication.</a> Methods Mol Biol. 521, 397-410 (2009).</li>
<li>Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ethylene+oxide%29+Grafted+to+Silicon+Surfaces%3A+Grafting+Density+and+Protein+Adsorption%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Poly(ethylene oxide) Grafted to Silicon Surfaces: Grafting Density and Protein Adsorption.</a> Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).</li>
<li>Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+single-molecule+DNA+replication+with+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+DNA+replication+loops+reveal+temporal+control+of+lagging-strand+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis.</a> Nature. 457, 336-339 (2009).</li>
<li>van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+kinetics+of+lambda+exonuclease+reveal+base+dependence+and+dynamic+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-molecule kinetics of lambda exonuclease reveal base dependence and dynamic disorder.</a> Science. 301, 1235-1238 (2003).</li>
</ol>

É importante assegurar que a força de arrasto exercida sobre contas pelo fluxo laminar não influencia atividades enzimáticas das proteínas de replicação. Por exemplo, uma força de 3 pN que corresponde a uma vazão de 0,012 ml / min não afetam a replicação do filamento de DNA de liderança. Isto, contudo, afetar as atividades enzimáticas que ocorrem durante a síntese de DNA coordenada, e, portanto, tem que ser reduzida para 1,5 pN. A força de arrasto pode ser facilmente controlado, alterando a taxa de fluxo ou uma largura ...

<table><tbody><tr><td>ADN do bacteriófago &amp;#955;</td><td>New England Biolabs</td><td>N3011L</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleotídeos de ADN</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ligase de ADN T4</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>Cinase de polinucleotídeos T4</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>Fab &amp;alpha;-digoxigenina</td><td>Roche Group</td><td>11214667001</td><td></td></tr><tr><td>Contas ativadas com tosila</td><td>Invitrogen</td><td>142-03</td><td></td></tr><tr><td>Separador magnético</td><td>Invitrogen</td><td>Dynal MPC</td><td></td></tr><tr><td>3-aminopropil-trietoxissilano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td>Outros aminossilanos podem ser usados ou misturados com silanos não reativos a aminas para obter superfícies mais esparsas</td></tr><tr><td>PEG succinimidil propionato</td><td>Nektar</td><td></td><td>PEGs semelhantes podem ser adquiridos de Nanocs, CreativePEGWorks, etc.</td></tr><tr><td>Biotina-PEG-NHS</td><td>Nektar</td><td></td><td>PEGs semelhantes podem ser adquiridos de Nanocs, CreativePEGWorks, etc.</td></tr><tr><td>Fita dupla face</td><td>Grace Bio-Lab Inc.</td><td>SA-S-1L</td><td>Espessura de 100 &amp;#x03BC;m</td></tr><tr><td>Lâmina de quartzo</td><td>Technical Glass</td><td>20 mm (L) × 50 mm (C) × 1 mm (A)</td><td>Dimensões para ajustar sobre lamínulas. Fazer furos com brocas de ponta de diamante (DiamondBurs.net)</td></tr><tr><td>Tubo de polietileno</td><td>BD Biosciences</td><td>427416</td><td>Diâmetro interno de 0,76 mm, diâmetro externo de 1,22 mm&lt;br/&gt;Pode-se usar tubos de outros tamanhos.</td></tr><tr><td>Streptavidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4762</td><td>Preparar solução de 1 mg/mL, alíquotas de 25 &amp;#x03BC;L em PBS pH 7,3</td></tr><tr><td>Mistura de solução de desoxirribonucleotídeos trifosfato</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio óptico invertido com objetiva 10X</td><td>Olympus Corporation</td><td>Olympus IX-51</td><td></td></tr><tr><td>Ímã permanente de terras raras</td><td>National Imports</td><td>www.rare-earth-magnets.com</td><td></td></tr><tr><td>Câmera CCD</td><td>QImaging</td><td>Rolera-XR Fast 139</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de seringa</td><td>Harvard Apparatus</td><td>11 Plus</td><td>Operar em modo de reenchimento para facilitar a troca de soluções</td></tr><tr><td>Iluminador de fibra</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>OSL1</td><td></td></tr></tbody></table>

a observação direta de enzimas dna replicação usando um dna molécula única alongamento assay

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

Nós descrevemos um método para observar a replicação em tempo real de moléculas de DNA individual mediada por proteínas do sistema de replicação bacteriófago. Linearizada λ DNA é modificada para ter um biotina na extremidade de um fio, e uma porção digoxigenina na outra extremidade do fio mesmo. O fim biotinilado é anexado a uma lamela de vidro funcionalizadas eo fim digoxigeninated para uma pequena pérola. A montagem destas amarras DNA-pérola sobre a superfície de uma célula de fluxo permite um fluxo laminar para ser aplicado a exercer uma força de arrasto na esfera. Como resultado, o DNA é esticada próximo e paralelo à superfície da lamínula, a uma força que é determinado pela taxa de fluxo (Figura 1). O comprimento do DNA é medida através do monitoramento da posição do talão. Diferenças de comprimento entre o DNA de um único e double-stranded são utilizados para obter informações em tempo real sobre a atividade das proteínas de replicação na bifurcação. Medir a posição do talão permite a determinação precisa das taxas e processivities de DNA descontrair e polimerização (Figura 2).

Nós descrevemos um método para observar a replicação em tempo real de moléculas de DNA individual mediada por proteínas do sistema de replicação bacteriófago.

A observação direta de Enzimas DNA Replicação Usando um DNA molécula única Alongamento Assay

Descrevemos um método para a observação em tempo real da replicação de moléculas individuais de DNA mediada por proteínas do sistema de replicação do bacteriófago. ...

Este vídeo demonstra um protocolo para visualizar a replicação do DNA por microscopia óptica de campo amplo utilizando DNA linearizado e quimicamente modificado do fago lambda. O DNA é fixado em uma lamínula de vidro funcionalizada. A extremidade livre do DNA é marcada com um microesfera e o DNA é esticado por meio de fluxo laminar.Quando a replicação é iniciada, a fita líder começa a se alongar e a fita atrasada encurta devido ao enrolamento. A grande diferença de comprimento entre o DNA de dupla e de simples fita em forças baixas permite a observação direta das conversões do DNA durante a replicação. O comprimento da construção de DNA é monitorado por meio do rastreamento da posição da esfera, o que permite a determinação precisa da taxa e do processo de replicação do DNA.Olá, sou Ari Ulrich dos Laboratórios de Anto um Vanian e Charles Richardson do Departamento de Bioquímica Biológica e Farmacologia Molecular da Escola de Medicina de Harvard. Hoje vamos mostrar um procedimento para imagem da replicação do DNA em nível molecular único. Utilizamos este procedimento em nossos laboratórios para estudar atividades enzimáticas que ocorrem durante a síntese de DNA.Então vamos começar. No início deste procedimento, o DNA linearizado do bacteriófago Lambda é modificado por oligonucleotídeos complementares para formar uma forquilha de replicação, um braço complementar da forquilha lambda, um braço biotinilado da forquilha e um iniciador da forquilha. O braço biotinilado da forquilha contém uma biotina ligada à sua extremidade 5', o que permite a ancoragem do molde de DNA à superfície da célula de fluxo.O DNA lambda é posteriormente modificado por meio da hibridização com outro oligonucleotídeo que contém um grupo diggen, servindo como marcação imunoafim de alta afinidade para a ligação de uma esfera. Para gerar a forquilha de replicação, obtenha o DNA lambda, além de diversos oligonucleotídeos cujas sequências podem ser encontradas no protocolo escrito que acompanha este vídeo. Esses oligonucleotídeos incluem um braço da forquilha biotinilado, um braço da forquilha complementar ao lambda, um iniciador da forquilha e um diggen complementar ao lambda; fosforile o fim 5' do braço da forquilha complementar ao lambda e do fim complementar ao digo genin lambda utilizando a polinucleotídeo quinase T4.Em seguida, misture o braço complementar da forquilha de lambda fosforilado, o braço da forquilha biotinilado, o iniciador da forquilha e o DNA de lambda na proporção molar de 10 para 10 para 100 para um. No tampão da Ligase de DNA T4, aqueça a mistura a 65 graus Celsius por cinco minutos e resfrie lentamente até a temperatura ambiente desligando o bloco de aquecimento para permitir o adequado emparelhamento dos oligonucleotídeos e da ligase de DNA T4 à mistura, e incube por duas horas. À temperatura ambiente, a Ligase de DNA T4 catalisará o selamento das fissuras entre os oligonucleotídeos e o lambda.O DNA finalmente é ligado ao digoxígeno complementar lambda e à extremidade do molde de replicação de DNA mediante a adição do digoxígeno complementar lambda fosforilado e da extremidade em tampão de Ligase T4, incubando a mistura por 30 minutos a 45 graus Celsius e, novamente, resfriando lentamente até a temperatura ambiente desligando o bloco de aquecimento. Ligue o digoxígeno complementar lambda fosforilado e a extremidade ao molde de replicação de DNA mediante a adição de ligase T4 de DNA à mistura e incube por duas horas à temperatura ambiente. O molde final de replicação de DNA está agora pronto para uso. Para fixar as microesferas magnéticas ativadas com tioester ao molde de replicação de DNA, elas devem ser funcionalizadas com um fragmento FAB específico para digoxígenina.Para iniciar este processo, ressuspenda a solução estoque de microesferas e transfira 400 microlitros para um tubo einor. Coloque o tubo em um separador magnético e incube até que a solução fique límpida. Em seguida, remova o sobrenadante por pipetagem. Para ativar os grupos toal para o acoplamento de anticorpos, adicione um mililitro de boid buffer e misture suavemente por pipetagem.Novamente, remova o sobrenatante com a ajuda de um separador magnético. Em seguida, adicione 240 microlitros do fragmento FAB e ressuspenda as microesferas em 400 microlitros de tampão borato. Misture bem e deixe em incubação em um rotador por 16 a 24 horas a 37 graus Celsius.Após a incubação, separe as microesferas utilizando o separador magnético e remova o sobrenadante. Lave as microesferas com um mililitro de tampão de lavagem e incube por cinco minutos a quatro graus Celsius, removendo em seguida o tampão com o separador magnético. Esta lavagem é repetida duas vezes.Para bloquear os grupos tosil livres, adicione um mililitro de BSA contendo tampão tris e incube por quatro horas a 37 graus Celsius. Após a incubação, remova o tampão das esferas utilizando um separador magnético, lave duas vezes com tampão e alíquotas. Para uso, o DNA a ser replicado é ligado a lamínulas de vidro funcionalizadas com Amil lane.O grupo oxila da trilha de Amil se liga ao vidro, deixando uma amina disponível para ligação a moléculas de peg biotiniladas. Este revestimento ajuda a reduzir a ligação não específica à superfície. Para limpar completamente as lamínulas de vidro, coloque-as em frascos de coloração e encha os frascos com etanol, submetendo-os à sonicador.Durante 30 minutos, enxágue os frascos e preencha com sonicação de hidróxido de potássio 1 M durante 30 minutos e repita ambas as lavagens. Para a primeira reação de funcionalização, todos os vestígios de água precisam ser removidos. Preencha os frascos de coloração com acetona e sonique por 10 minutos.Esvazie os frascos e encha novamente com acetona. Prossiga adicionando o reagente sine aos frascos e agite por dois minutos. Em seguida, interrompa a reação com um grande excesso de água.Em seguida, seque as lamínulas aquecendo-as a 110 graus Celsius no forno por 30 minutos. Depois, prepare a mistura de PEG a aproximadamente 0,2% peso por volume. O PEG biotinilado, juntamente com um espaçador de lamínula de vidro, permitirá a separação das lamínulas; pipete 100 microlitros sobre uma lamínula seca silanizada.Coloque um segundo lamínula por cima. Incube os lamínulas na solução de PEG por três horas. Em seguida, separe cada par de lamínulas e lave abundantemente com água.Tenha cuidado para manter os lados funcionais das lamínulas virados para cima, pois apenas um lado será revestido com PEG. Por fim, seque as lamínulas com ar comprimido e armazene-as sob vácuo em um dessecador; as superfícies permanecem estáveis por pelo menos um mês. Assim, dezenas de lamínulas podem ser produzidas em um único lote e utilizadas conforme necessário.Agora que as lamínulas estão prontas, pode-se montar a câmara de fluxo para o experimento de molécula única. O experimento de molécula única é realizado usando uma câmara de fluxo simples, construída com uma lamínula funcionalizada, fita dupla face, uma lâmina de quartzo e tubos. Uma câmara de fluxo é preparada para cada experimento de molécula única.Inicie misturando cinco mililitros de tampão bloqueador e 20 mililitros de tampão de trabalho e coloque a mistura em um dessecador para remover quaisquer bolhas de ar em etapas posteriores. Em seguida, espalhe 100 microlitros de uma solução de trabalho de strp din em PBS sobre a superfície da lamínula funcionalizada com PEG e incube por 20 minutos à temperatura ambiente para permitir que o strp din se ligue à biotina superficial. Enquanto isso, corte um pedaço de fita dupla face para ajustar ao tamanho da lâmina de quartzo e marque a posição dos orifícios dos tubos na fita.Delimite a câmara de fluxo desenhando um canal central com três milímetros de largura e retângulos contendo ambos os orifícios. As câmaras de fluxo podem ser projetadas com dois canais de entrada e dois de saída em formato de Y. Agora, corte a fita marcada ao longo do contorno desenhado, fazendo cortes retos e limpos para garantir que nenhum adesivo se projete para dentro do canal.Limpe completamente a lâmina de quartzo utilizando acetona para remover o adesivo da construção da câmara de fluxo usada em experimentos anteriores. Encontre o melhor alinhamento do contorno do canal. Remova um lado do revestimento adesivo e coloque cuidadosamente a fita sobre a lâmina.Tenha cuidado para alinhar corretamente a fita, pois os orifícios de entrada e saída precisam permanecer desobstruídos. Em seguida, prepare os comprimentos cortados de tubo com diâmetro interno de 0,76 milímetro para a entrada e saída da célula de fluxo. Corte a extremidade do tubo em um ângulo de aproximadamente 30 graus para que o tubo não fique pressionado contra o fundo da câmara.Suspenda o tubo em suportes para tubos de ensaio para facilitar a fixação na câmara de fluxo nas próximas etapas. Neste momento, a incubação da lamínula já deverá ter sido concluída. Enxágue bem a lamínula com água e seque-a utilizando ar comprimido.Tenha cuidado para não virar a lamínula, pois apenas um dos lados está funcionalizado com peg. Complete a montagem da câmara de fluxo removendo o outro lado do suporte da fita e colocando a lâmina de quartzo sobre a lamínula. Pressione levemente a lamínula para expelir qualquer ar aprisionado no adesivo. Isso ajudará a evitar que bolhas de ar entrem no canal de fluxo.Selar os lados da câmara com epóxi. Inserir o tubo cortado nos orifícios do quartzo e selar com o epóxi. Deixar secar por alguns minutos.Uma vez seco, use uma agulha de 21 gauge para puxar um pouco do tampão bloqueador de DGAs através de um dos tubos, a fim de bloquear a superfície da câmara. Lave algumas vezes para remover bolhas de ar e deixe a câmara incubando por pelo menos 30 minutos antes de prosseguir com o experimento de replicação de molécula única. Após os beads funcionalizados com o molde de DNA e a câmara de fluxo terem sido preparados, pode-se realizar um experimento de molécula única.Para começar, coloque a câmara de fluxo na platina do microscópio. Segure a câmara no lugar com grampos da platina e certifique-se de que o canal de fluxo esteja alinhado com a câmera CCD. Conecte a mola de ar previamente montada à bomba de seringa e aos tubos de saída da câmara de fluxo.Usando tubos conectores de diâmetro maior, coloque os tubos de entrada da célula de fluxo no tampão de bloqueio e puxe suavemente a seringa para remover quaisquer bolhas de ar dos tubos; sacuda levemente os tubos de saída para eliminar bolhas de ar aprisionadas na célula de fluxo. Após a remoção de todas as bolhas de ar, tampe um dos tubos de entrada com uma agulha e feche um dos tubos de saída dobrando-o em 180 graus e fixando-o com fita adesiva. Antes de adicionar o DNA à célula, dilua o molde de DNA estoque até 10 picomolar em um mililitro de tampão de bloqueio DGAs um x. Passe o molde pela câmara em uma taxa de fluxo moderada para permitir uma boa cobertura da superfície pelo DNA.Dilua a solução estoque de microesferas para entre duas e quatro vezes 10 à sexta microesferas por mililitro. Em um mililitro de DGAs, adicione um x de tampão bloqueador. Em seguida, vortexe a mistura e sonique por 20 segundos.Fluxione a solução de microesferas diluída na câmara. Após a adição das microesferas, interrompa o fluxo e deixe a câmara atingir o equilíbrio. Em seguida, feche ambos os tubos de saída.Quaisquer alterações nos tubos sem que a câmara esteja fechada causarão flutuações de pressão que exercerão uma força intensa sobre as microesferas e romperão as moléculas de DNA ancoradas. Tampe o tubo de entrada usado para carregar as microesferas com uma agulha utilizando o segundo tubo de entrada. Inicie a lavagem da célula de fluxo com DGAs em uma solução de tampão bloqueador, lavando extensivamente.Agite o estágio batendo levemente para remover quaisquer microesferas que estejam aderidas não especificamente à superfície para verificação. As microesferas estão ligadas ao DNA. Tente mudar a direção do fluxo.Uma vez que as microesferas livres forem suficientemente removidas, desligue o fluxo e permita que a câmara atinja o equilíbrio. Prepare uma nova mistura de reação contendo as proteínas de replicação conforme indicado no protocolo descrito no texto. Feche o tubo de saída aberto e troque o reservatório de entrada para a mistura de reação recém-preparada.Abra lentamente a saída para evitar mudanças rápidas de pressão e prosseguir com a reação enzimática. Primeiro, faça fluir a solução proteica para a câmara a uma taxa de fluxo moderada para permitir uma ligação eficiente ao DNA. Desligue o fluxo e permita que a câmara atinja o equilíbrio.Feche os tubos de saída e substitua o tubo contendo a mistura de reação. Com o tubo contendo o tampão de lavagem de DGAs, lave a câmara para remover as proteínas livres após a lavagem. Novamente, desligue o fluxo e permita que a câmara atinja o equilíbrio.Feche os tubos de saída e substitua o tubo contendo o tampão de lavagem. Com o tubo contendo o tampão de replicação T7, o tampão de replicação T7 contém cloreto de magnésio que desencadeia o início da reação de replicação. Utilize uma taxa de fluxo de 0,012 mililitros por minuto, correspondente a uma força de arrasto de três pico Newin nos cabos de DNA, usando as condições descritas neste protocolo.Coloque um ímã permanente de terras raras acima da célula de fluxo antes da imagem para evitar interações não específicas entre as microesferas e a superfície. Posicione um iluminador de fibra em um ângulo de incidência entre 10 graus e paralelo à platina do microscópio próximo ao campo de visão do microscópio com uma objetiva de 10 x e câmera CCD. A iluminação em campo escuro é utilizada para aumentar o contraste no foco da imagem das microesferas usando uma microesfera ligada.Inicie a aquisição de dados por 20 a 30 minutos com uma taxa de quadros lenta. Em um experimento bem-sucedido, é possível observar simultaneamente 100 microesferas. O experimento deve gerar inúmeras curvas que exibam a síntese da fita líder de DNA.Para medir as taxas e a processividade do desenrolamento do DNA e da polimerização, é necessário determinar as posições precisas das esferas. Ajuste essas posições com funções gaussianas bidimensionais. Visualize a trajetória rastreando a posição da esfera em cada quadro utilizando software de rastreamento.Em seguida, plote a posição das esferas em função do tempo utilizando qualquer software gráfico para obter dados de taxa. Ajuste os gráficos com uma regressão linear e calcule a inclinação para o movimento processivo. Determine o comprimento total do DNA do início ao fim de um evento de encurtamento.Combine todas as medições individuais e trace as distribuições de taxa e produtividade, ajustando os dados utilizando funções gaussianas e exponenciais simples, respectivamente. Acabamos de mostrar como medir taxas e processividade da replicação do DNA em nível de molécula única. Ao realizar este procedimento, é importante garantir que a força e a cisalhamento causados pelo fluxo laminar não afetem as atividades enzimáticas das proteínas de replicação.Então é isso. Obrigado por assistir e divirta-se em seus experimentos.

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