A observação direta de Enzimas DNA Replicação Usando um DNA molécula única Alongamento Assay

Este vídeo demonstra um protocolo para visualizar a replicação do DNA por microscopia óptica de campo amplo lambda linearizada e quimicamente modificada. O DNA está anexado a uma lamínula de vidro funcionalizada. A extremidade livre do DNA é marcada com grânulos e o DNA é esticado por fluxo laminar.

Quando a replicação é iniciada, a fita principal começa a se alongar e a fita atrasada encurta devido ao enrolamento. A grande diferença de comprimento entre o DNA de fita dupla e de fita simples em baixas forças permite uma observação direta das conversões de DNA durante a replicação. O comprimento da construção do DNA é monitorado rastreando a posição do grânulo, o que permite a determinação precisa da taxa e do processo de replicação do DNA.

Olá, sou Ari Ulrich, dos Laboratórios de Anto one Vanian e Charles Richardson, do Departamento de Química Biológica e Farmacologia Molecular da Harvard Medical School. Hoje vamos mostrar um procedimento para obter imagens da replicação do DNA em nível molecular único. Usamos esse procedimento em nossos laboratórios para estudar atividades enzimáticas que ocorrem durante a síntese de DNA.

Então vamos começar No início deste procedimento. O DNA lambda do fago de bactérias linearizadas é modificado por um oligonucleotídeos ajoelhado para formar um garfo de replicação, um braço de garfo complementar lambda, braço de garfo biotinilado e um primer de garfo. O antebraço do garfo biotinilado contém uma biotina t ligada às suas cinco extremidades principais, o que permite amarrar o molde de DNA à superfície da célula de fluxo.

O DNA lambda é posteriormente modificado por recozimento, outro oligonucleotídeo que contém um diggen e uma porção que serve como uma marca imunológica de alta afinidade para a fixação de um grânulo. Para gerar o garfo de replicação, obtenha DNA lambda, além de vários oligonucleotídeos cujas sequências podem ser encontradas no protocolo escrito que acompanha este vídeo. Esses oligonucleotídeos incluem um braço de garfo biotinilado, um braço de garfo complementar lambda, um primer de garfo e um diggen complementar lambda e fosforilar as cinco extremidades principais do braço de garfo complementar lambda e a extremidade de digo genin complementar lambda usando T quatro polinucleotídeo quinase.

Em seguida, misture o braço do garfo complementar lambda fosforilado, o braço do garfo biotinilado, o primer do garfo e o DNA lambda na proporção molar de 10 a 10 a 100 para um. No tampão T quatro DNA Ligase, aqueça a mistura a 65 graus Celsius por cinco minutos e resfrie lentamente até a temperatura ambiente, desligando o bloco de calor para permitir o recozimento adequado dos oligonucleotídeos e T quatro DNA ligase à mistura e incube por duas horas. À temperatura ambiente, a DNA ligase T quatro catalisará a vedação dos cortes entre os oligonucleotídeos e o lambda.

O DNA finalmente anil o diggen complementar lambda e termina ao molde da replicação do ADN adicionando o diggen complementar do lambda fosforilado e termina no tampão de T quatro Ligase incube a mistura por 30 minutos em 45 graus Célsio e outra vez, refrigere lentamente à temperatura ambiente desligando o bloco de calor ligue o oxigênio complementar fosforilado da escavação do Lambda e termine ao molde da replicação do ADN adicionando o T quatro ADN ligase à mistura e Incube por duas horas em temperatura ambiente. O modelo final de replicação de DNA agora está pronto para uso. Para anexar as esferas magnéticas ativadas por borla ao molde de replicação do DNA, elas devem ser funcionalizadas com um fragmento FAB específico para digo genin.

Para iniciar este processo, ressuspenda a solução estoque de grânulos e transfira 400 microlitros para um tubo einor. Coloque o tubo em um separador magnético e incube até que a solução clareie. Em seguida, remova o sobrenadante pipetando Para ativar os grupos toal para acoplamento de anticorpos, adicione um mililitro de tampão boid e misture suavemente pipetando.

Novamente, remova o sobrenadante com o auxílio de um separador magnético. Em seguida, adicione 240 microlitros de fragmento FAB e ressuspenda os grânulos em 400 microlitros de tampão borato. Misture bem e deixe incubar em um rotador por 16 a 24 horas a 37 graus Celsius.

Após a incubação, separe os grânulos usando o separador magnético e remova o sobrenadante. Lave as esferas com um mililitro de tampão de lavagem e incube por cinco minutos a quatro graus Celsius, remova o tampão usando o separador magnético. Esta lavagem é repetida duas vezes.

Para bloquear os grupos tosil livres, adicione um mililitro de BSA contendo tampão tris e incube por quatro horas a 37 graus Celsius. Após a incubação, remova o tampão dos grânulos usando um separador magnético lave duas vezes com tampão e alíquota. Para uso, o DNA a ser replicado é anexado a lamínulas de vidro funcionalizadas com Amil lane.

O grupo oxi da pista Amil se liga ao vidro, deixando uma amina disponível para ligação a moléculas de pinos biotiniladas. Este revestimento ajuda a reduzir a ligação não específica à superfície. Para limpar completamente as lamínulas de vidro, coloque-as em frascos de coloração e encha os frascos com etanol sonicate.

Por 30 minutos, enxágue os frascos e encha com um sonicado molar de hidróxido de potássio por 30 minutos e repita as duas lavagens. Para a primeira reação de funcionalização, todos os vestígios de água precisam ser removidos. Encha os frascos de coloração com acetona e sonicate por 10 minutos.

Esvazie os frascos e encha novamente com acetona. Prossiga para adicionar o reagente senoidal aos frascos e agite por dois minutos. Em seguida, tempere com um grande excesso de água.

Em seguida, seque as lamínulas assando-as a 110 graus Celsius no forno por 30 minutos. Em seguida, prepare a mistura de pinos em cerca de 0,2% de peso por volume. O pino biotinilado, incluindo um espaçador de lamínula de vidro, permitirá a separação das lamínulas, pipeta 100 microlitros em uma lamínula seca siloizada.

Coloque uma segunda lamínula por cima. Incubar as lamínulas na solução de PEG durante três horas. Em seguida, separe cada par de lamínulas e lave extensivamente com água.

Tenha cuidado para manter as lamínulas com o lado funcionalizado para cima, pois apenas um lado será revestido com pino. Por fim, seque as lamínulas com ar comprimido e guarde-as sob vácuo Em um dessecado, as superfícies permanecem estáveis por pelo menos um mês. Assim, dezenas de lamínulas podem ser feitas em lote e usadas conforme necessário.

Agora que as lamínulas estão prontas, pode-se montar a câmara de fluxo para o experimento de molécula única. O experimento de molécula única é realizado usando uma câmara de fluxo simples construída com uma lamínula funcionalizada, fita dupla face, uma lâmina de um litro e tubo. Uma câmara de fluxo é preparada para cada experimento de molécula única.

Comece misturando cinco mililitros de tampão de bloqueio e 20 mililitros de tampão de trabalho e colocando a mistura em um dessecador para remover quaisquer bolhas de ar para etapas posteriores. Em seguida, espalhe 100 microlitros de uma solução de trabalho de strp din em PBS sobre a superfície do pino funcionalizado Cover slip incube por 20 minutos em temperatura ambiente para permitir que strp din se ligue à biotina da superfície. Enquanto isso, corte um pedaço de fita dupla-face para combinar com o tamanho da lâmina de quartzo, marque a posição dos orifícios dos tubos na fita.

Contorne a câmara de fluxo desenhando um canal central de três milímetros de largura e retângulos contendo os dois orifícios. As câmaras de fluxo podem ser projetadas com dois canais em forma de Y de entrada e dois de saída. Agora corte a fita marcada ao longo do contorno desenhado, fazendo cortes retos e limpos para garantir que nenhum adesivo se projete no canal.

Limpe bem a lâmina de quartzo usando acetona para remover o adesivo da construção da célula de fluxo usada em experimentos anteriores. Encontre o melhor alinhamento do contorno do canal. Remova um lado do adesivo e coloque cuidadosamente a fita na corrediça da quadra.

Tenha cuidado para alinhar a fita corretamente, pois os orifícios de entrada e saída precisam permanecer desbloqueados. Em seguida, prepare os comprimentos de corte da tubulação de 0,76 milímetros de diâmetro interno para a entrada e saída da célula de fluxo. Corte a extremidade do tubo em um ângulo de cerca de 30 graus para que o tubo não pressione contra o fundo da câmara.

Suspenda a tubulação em racks de tubos de ensaio para facilitar a fixação à célula de fluxo nas próximas etapas. Até agora, a incubação da lamínula deve estar concluída. Enxágue a tampa, deslize bem com água e seque-a com ar comprimido.

Tenha cuidado para não virar a lamínula, pois apenas um lado é funcionalizado com pino. Conclua a montagem da câmara de fluxo removendo o outro lado do suporte da fita e colocando a lâmina de quartzo na lamínula Pressione levemente a lamínula para empurrar para fora o ar preso no adesivo. Isso ajudará a evitar que bolhas de ar entrem no canal de fluxo.

Sele as laterais da câmara com epóxi. Insira o tubo cortado nos orifícios do quartzo e sele no lugar com o epóxi. Deixe secar por alguns minutos.

Depois de seco, use uma agulha de calibre 21 para puxar alguns dos amortecedores de bloqueio de DGAs através de um dos tubos para bloquear a superfície da câmara. Lave algumas vezes para remover as bolhas de ar e deixe a câmara incubar por pelo menos 30 minutos antes de passar para o experimento de replicação de molécula única. Uma vez que os grânulos funcionalizados do molde de DNA e a câmara de fluxo tenham sido preparados, um único experimento de molécula pode ser realizado.

Para começar, coloque a célula de fluxo no microscópio stage. Segure a câmara no lugar com stage clipes e certifique-se de que o canal de fluxo esteja posicionado alinhado com a câmera CCD. Conecte a mola pneumática previamente construída à bomba de seringa e aos tubos de saída da célula de fluxo.

Usando tubos conectores de diâmetro maior, coloque os tubos de entrada da célula de fluxo no tampão de bloqueio e puxe a seringa para remover quaisquer bolhas de ar dos tubos, agite suavemente os tubos de saída para limpar quaisquer bolhas de ar presas na célula de fluxo. Depois que todas as bolhas de ar forem removidas, tampe um dos tubos de entrada com uma agulha e sele um dos tubos de saída dobrando-o 180 graus e prendendo com fita adesiva Antes de adicionar DNA à célula, dilua o molde de DNA padrão para 10 picomolar em um mililitro de DGAs um x tampão de bloqueio. Flua o molde para a câmara a uma taxa de fluxo moderada para permitir uma boa cobertura superficial do DNA.

Diluir a solução de contas de caldo para entre duas e quatro vezes 10 das sextas contas por mililitro. Em um mililitro de DGAs, um x tampão de bloqueio. Em seguida, vortex a mistura e sonicate por 20 segundos.

Flua a solução diluída de esferas para a câmara. Depois que as contas forem adicionadas, desligue o fluxo e permita que a câmara atinja o equilíbrio. Em seguida, feche os dois tubos de saída.

Quaisquer alterações nos tubos sem a câmara fechada causarão flutuações de pressão que exercerão uma forte força sobre as esferas e cortarão as moléculas de DNA amarradas. Tampe o tubo de entrada que foi usado para carregar os grânulos com uma agulha usando o segundo tubo de entrada. Comece a lavar a célula de fluxo com DGAs uma solução x de bloqueio de lavagem extensiva.

Agite o palco batendo para remover quaisquer contas que não estejam especificamente presas à superfície para verificá-lo. As contas estão amarradas ao DNA. Tente mudar a direção do fluxo.

Uma vez que os grânulos livres sejam suficientemente removidos, desligue o fluxo e permita que a câmara atinja o equilíbrio. Preparar uma mistura de reacção fresca contendo proteínas de replicação, conforme indicado no protocolo de texto. Feche o tubo de saída aberto e mude o reservatório de entrada para a mistura de reação recém-preparada.

Abrindo lentamente a saída para evitar mudanças rápidas de pressão para prosseguir com a reação enzimática. Primeiro, flua a solução de proteína para a câmara a uma taxa de fluxo moderada para permitir uma ligação eficiente ao DNA. Desligue o fluxo e permita que a câmara atinja o equilíbrio.

Feche os tubos de saída e substitua o tubo que contém a mistura de reação. Com o tubo consistindo de tampão de lavagem DGAs, lave a câmara para remover as proteínas livres após a lavagem. Novamente, desligue o fluxo e permita que a câmara atinja o equilíbrio.

Feche os tubos de saída e substitua o tubo que contém o tampão de lavagem. Com o tubo contendo o tampão de replicação T sete, o tampão de replicação T sete contém cloreto de magnésio que desencadeia o início da reação de replicação. Use uma taxa de fluxo de 0,012 mililitros por minuto que corresponda a três pico de força de arrasto de Newin nas amarras de DNA usando as condições descritas neste protocolo.

Coloque um ímã permanente de terras raras acima da célula de fluxo antes da imagem para evitar interações não específicas entre as esferas e a superfície. Posicione um iluminador de fibra em um ângulo de incidência entre 10 graus e paralelo ao microscópio stage próximo ao microscópio view campo com uma objetiva de 10 x e câmera CCD. A iluminação de campo escuro é usada para aumentar o contraste no foco de imagem do cordão usando um cordão amarrado.

Comece a aquisição de dados por 20 a 30 minutos em uma taxa de quadros lenta. Em um experimento bem-sucedido, 100 contas podem ser observadas simultaneamente. O experimento deve produzir vários traços exibindo a síntese de DNA da fita principal.

Para medir as taxas e o processo de desenrolamento e polimerização do DNA, as posições precisas dos grânulos devem ser determinadas para conseguir isso. Ajuste essas posições com funções gaussianas bidimensionais. Visualize a trajetória rastreando a posição do cordão em cada quadro usando o software de rastreamento.

Em seguida, plote a posição do cordão em função do tempo usando qualquer software gráfico para obter dados de taxa. Ajuste os gráficos com uma regressão linear e calcule a inclinação para processivo. Determine o comprimento total do DNA do início ao fim de um evento de encurtamento.

Combine todas as medições únicas e plote as distribuições de taxa e produtividade ajustem os dados usando funções gaussianas e exponenciais únicas, respectivamente. Acabamos de mostrar como medir as taxas e o processo de replicação do DNA em um único nível de molécula. Ao fazer este procedimento, é importante certificar-se de que a força e certas apostas do fluxo da lâmina não afetem as atividades enzimáticas das proteínas de replicação.

Então é isso. Obrigado por assistir e divirta-se em seus experimentos.