Name: Encapsulation PuraMatrix de células de câncer (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Aprenda a encapsular células de câncer de ovário CAR5 em PuraMatrix para criar culturas 3D que simulam nódulos micrometastáticos. Este protocolo otimizado auxilia pesquisadores a estudar respostas ao tratamento in vitro.

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Notas técnicas: <ul><li> Gelificação é iniciada pela adição de sais. Portanto, é fundamental que não sais de entrar em contato com PuraMatrix até gelificação é desejado; exposição a sais de muito baixa força iônica (eg, &lt;0,05 M) fará com que gelificação irreversível. </li><li> Soluções estoque restante que está preparado pode ser usado em uma data posterior, desde que não tenham entrado em contato com sais. Você não precisa se preocupar com sonicação repetir. </li><li> Bolhas de ar podem ser removidas PuraMatrix alíquotas em tubos estéreis, seguido por centrifugação. </li><li> Tenha muito cuidado durante as mudanças de mídia como aspiração podem facilmente perturbar a cama PuraMatrix. </li></ul> Materiais: BD PuraMatrix Peptide Hydrogel RAD16-1% (Cat # 354250): A concentração de peptídeo total da mistura não diluída é de 10 mg / ml. <ul><li> Sonicador água Banheira ou Vortex </li><li> De 96 poços prato de cultura de células </li><li> Meios de Cultura de células </li><li> Estéril Filtrado H 2 O </li><li> Sacarose filtrado estéril 20% </li><li> Células (todos menos 5.000 células / poço): OVCAR-5 </li></ul> Todos os passos devem ser realizados sob condições assépticas. Procedimento: <ol><li> Sonicate o PuraMatrix 1% (RAD16) em um sonicador banho-maria durante 30 minutos para reduzir a viscosidade antes do uso. </li><li> A solução PuraMatrix 1% pode agora ser aliquotado em tubos estéreis a simplificar experiências futuras. <ol class="lalpha"><li> Evitar a formação de bolhas de ar, se elas formam simplesmente girar os tubos estéreis, contendo PuraMatrix a 1000 rpm (300 xg) por 5 minutos. </li><li> A concentração de peptídeo total da mistura não diluída é de 10 mg / ml. </li></ol></li><li> Dois conjuntos de quatro poços serão banhados em 2,5 mg / ml e 1,25 mg / ml de concentração de peptídeo total, respectivamente. </li><li> Diluir o PuraMatrix em cada bem definido com 0,2 m estéril filtrado sacarose 20% e sacarose 13,3% para concentrações totais de peptídeo de 5 mg / ml e 2,5 mg / ml, respectivamente, para alcançar uma concentração 2x de BD PuraMatrix em sacarose 10%. <ol class="lalpha"><li> Fazer sacarose 20%, diluir 10 g de sacarose, em seguida, o volume a 50 ml de água. </li><li> 13% de sacarose e 10% podem ser preparadas por diluição da solução estoque de 20%. <ol class="lroman"><li> 13% de sacarose (para cada 10 ml): 6,5 ml de sacarose 20% + 3,5 ml estéril H 2 O. </li><li> 10% Sacarose (para cada 10 ml): 5,0 ml de sacarose 20% + 5,0 ml estéril H 2 O. </li></ol></li></ol></li><li> Prepare uma mistura mestre de peptídeo PuraMatrix com base no número de poços que pretende prato. (Veja o exemplo abaixo.) Então alíquotas em tubos individuais contendo 25 ml da mistura de mestre. <ol class="lalpha"><li> O master mix deve ser preparado com o dobro da concentração final desejada de peptídeo total como ele vai ser diluído com igual volume de células durante a galvanização. <img src="/files/ftp_upload/1692/1692_fig11.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="figura 1"></li></ol></li><li> Preparar suspensões de células por trypsinizing culturas de células de células em monocamada. <ol class="lalpha"><li> 2 ml de 0,05% Tripsina EDTA pode ser usado para cada Flask T-75. </li></ol></li><li> Neutralizar a tripsina com a adição de meios de cultura celular contendo 10% de calor soro fetal bovino inativado (uso pelo menos 2 ml de mídia por ml de tripsina usada na etapa anterior.) </li><li> Centrifugar as células a 1000 rpm (~ 300 xg) por 5 minutos para criar um pellet de células. <ol><li> Ressuspender as células em 10% de sacarose estéril filtrado. </li><li> Contar as células e spin para baixo novamente a 1000 rpm (~ 300 xg) por 5 minutos para remover traços de sal encontrados na mídia. </li></ol></li><li> Ressuspender as células OVCAR-5 em sacarose 10% a 2.0 x 10 5 células / ml para que a contagem de células por poço finais serão 5.000 células em cada poço. Os seguintes passos devem ser realizados rapidamente. </li><li> Adicionar 25 mL do 2,0 x 10 5 células / ml de suspensão para o primeiro tubo contendo 25 mL individuais do mix de mestre de PuraMatrix como mostrado no esquema acima. <ol class="lalpha"><li> Rapidamente mix por pipetagem (~ 5 vezes para cima e para baixo) no tubo sem a introdução de bolhas de ar. </li><li> Em seguida, pipetar 50 ul da célula mistura suspensão / PuraMatrix no poço apropriado de um prato de 96 poços. </li><li> Iniciar a gelificação do PuraMatrix BD com cuidado pipetando 150 media de células mL de cultura (RPMI + 10% FBS) para o lado do bem <img src="/files/ftp_upload/1692/1692_fig12.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="figura 2"></li></ol></li><li> Repita os passos descritos no 8 até que todos os poços foram banhados. </li><li> Depois de 30 minutos Muito Remova cuidadosamente ~ 2 / 3 dos meios de comunicação utilizando uma pipeta 200 mL para equilibrar o pH do hidrogel. <ol class="lalpha"><li> NÃO USE A aspirador a vácuo como isso irá interromper o MATRIX </li><li> Coloque a ponta da pipeta no poço, para queele não toque na cama PuraMatrix e delicadamente remova a mídia do poço. </li><li> Cuidados devem ser tomados para não perturbar a matriz durante a cultura de células em PuraMatrix. </li></ol></li><li> Muito delicadamente adicionar 150 mL de meio de cultura de células frescas ao lado das células que contêm bem encapsulado em PuraMatrix. </li><li> Alterar a mídia de cultura de células em cada poço a cada 48 horas, com meios de cultura fresco com cuidado repetindo os passos 10 e 11. </li></ol> Resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/1692/1692_fig1tmb.jpg" alt="Figura 1" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="figura 1"> Figura 1. OVCAR-5 células foram encapsulados como descrito no protocolo acima. Imagens foram adquiridas usando uma invertida Olympus FV1000 microscópio equipado com Ti-DeepSee Spectra Physics: Sapphire a laser ajustado para 750 nm. Sessões de imagem foram realizados nos dias 1, 3, 5 e 7 pós-plating. A longa distância de trabalho de água, mergulhando objetiva de 40x (Olympus LUMPLFLN 0,8 NA) foi usado para a imagem através da PuraMatrix. Volumes tridimensionais foram coletados através da aquisição de pilhas de imagens em 1,47 mM passos axial. Duas organizações não-descanned detectores coletados a emissão autofluorescência utilizando violeta (440-490 nm) e verde (510-550 nm) filtros passa-banda. As imagens finais e filmes pilha de profundidade foram processadas utilizando ImageJ, combinando ambos os canais de detecção. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1692/1692_fig1.jpg">clique aqui</a> para ver uma versão ampliada da figura 1.

<ol><li>Gelain, F., Bottai, D., Vescovi, A., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+self-assembling+Peptide+nanofiber+scaffolds+for+adult+mouse+neural+stem+cell+3-dimensional+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Designer self-assembling Peptide nanofiber scaffolds for adult mouse neural stem cell 3-dimensional cultures.</a> PLoS One. 1, e119-e119 (2006).</li>
</ol>

encapsulation puramatrix de células de câncer

PuraMatrix Encapsulation of Cancer Cells

Crescente evidência sugere que as células cancerosas cultura em três dimensões com mais precisão recapitula a complexidade da biologia tumoral. Muitos destes modelos utilizam membrana basal reconstituída derivados de animais que contêm uma quantidade variável de fatores de crescimento e citocinas que podem influenciar o crescimento desses modelos de cultura de células. Aqui, descrevemos em detalhes a preparação eo uso de PuraMatrix, um disponível comercialmente auto gel montagem peptídeo que é desprovido de materiais de origem animal e patógenos para encapsular e propagar a linha de células de câncer de ovário, OVCAR-5. Começamos por descrever como preparar o PuraMatrix antes do uso. Em seguida, demonstrar como misturar corretamente o PuraMatrix e suspensão de células para encapsular as células do hidrogel. Após a adição de meios de cultura celular ou injeção em um ambiente fisiológico, o componente de peptídeo PuraMatrix rapidamente auto monta em um hidrogel 3D que exibe um nanômetro estrutura fibrosa escala com um tamanho médio dos poros de 500-200 nm<sup&gt; 1</sup&gt;. Além disso, demonstramos como propagar culturas cultivadas em PuraMatrix encapsulados. Quando encapsulado em PuraMatrix, OVCAR-5 células reúnem-se em três estruturas acinares dimensional que mais se assemelham a morfologia dos nódulos micrometastático observados na prática clínica de monocamada em modelos in vitro. Usando a microscopia confocal, ilustramos o surgimento de representante OVCAR-5 células encapsuladas em PuraMatrix no dia 1, 3, 5 e 7 plating post. O uso de PuraMatrix às células cancerosas cultura deve melhorar a nossa compreensão da doença e permitem avaliar a resposta ao tratamento em sistemas modelo mais preditivo clinicamente.

Este vídeo demonstra como para encapsular e células cancerosas em cultura PuraMatrix, um auto comercialmente disponíveis montagem gel peptídeo.

Encapsulation PuraMatrix de células de câncer

Evidências crescentes sugerem que o cultivo de células cancerígenas em três dimensões recapitula com maior precisão a complexidade da biologia tumoral. Muitas dessas...

Os modelos de cultivo celular em monocamada têm sido ferramentas muito úteis para o estudo de diversas doenças, incluindo o câncer. No entanto, esses modelos não conseguem recapitular o ambiente tridimensional observado in vivo. Este vídeo demonstrará o uso do Matrixx puro, um gel de peptídeos autoagregáveis disponível comercialmente, para encapsular e propagar a linhagem celular de câncer de ovário CAR cinco.A suspensão celular é misturada com o Matrixx puro e o cultivo celular. O meio é adicionado para iniciar a ativação do Matrixx puro quando encapsulado e cultivado no Matrixx puro, em que células Carv cinco se organizam em estruturas tridimensionais ASIN R que assemelham-se à morfologia de nódulos micrometastáticos. Olá, sou Adnan Abbi.Sou pesquisador no laboratório da Dra. TBA Hassan no Centro Feminino de Medicina Fotônica do Hospital Geral de Massachusetts. Hoje vamos mostrar um protocolo para encapsular e cultivar uma linhagem de células de câncer de ovário em uma matriz sintética chamada matriz pura. Utilizamos este modelo para avaliar a resposta ao tratamento do câncer de ovário em nosso laboratório.Então vamos começar. O hidrogel de peptídeo RAD 16 em matriz BD 1% pura tem uma concentração total de peptídeo de 10 miligramas por mililitro antes do uso. Reduza a viscosidade da matriz pura submetendo-a à sonicação em banho-maria por 30 minutos; após a sonicação, mantenha as condições estéreis.Aliquote a solução de matriz pura a 1% em tubos estéreis. Para simplificar experimentos futuros, evite a formação de bolhas de ar; caso se formem, basta centrifugar os tubos estéreis contendo a matriz pura a 1000 RPM durante cinco minutos. Nesta demonstração, vamos semear duas séries de quatro poços cada, a 2,5 miligramas por mililitro e 1,25 miligramas por mililitro, respectivamente, de concentração total do peptídeo. Prepare dois misturas-mestras de peptídeo em matriz pura com base no número de poços que pretende semear, que neste caso é oito.Cada mistura-mestra deve ser preparada na concentração duas vezes maior que a concentração final desejada de peptídeo total, pois será diluída com um volume igual de células durante o plaqueamento, de modo que as misturas-mestra diluam a matriz pura com sacarose estéril a 10% e sacarose a 13,3% até concentrações totais de peptídeo de cinco miligramas por mililitro e 2,5 miligramas por mililitro, respectivamente, para obter uma concentração duas vezes maior de Matrizx pura em sacarose a 10%. Em seguida, alíquotas de 25 microlitros das misturas-mestra devem ser distribuídas em oito tubos individuais. As misturas-mestra de matriz pura estão agora prontas para encapsular as células. A linhagem celular de câncer de ovário CAR cinco será encapsulada e propagada neste experimento; antes da incubação com tripsina, incubar as células com 10 mililitros de PBS estéril sem cálcio e magnésio por 15 a 20 minutos.Aspire o PBS e a tripsina de um cultivo celular em monocamada, neutralize a tripsina adicionando meio de cultura celular contendo 10% de soro bovino fetal inativado pelo calor. Utilize pelo menos dois mililitros de meio por mililitro de tripsina usado na etapa anterior. Em seguida, transfira as células para tubos de centrífuga e centrifugue as células a 1000 RPM durante cinco minutos para formar um pellet celular.Após a centrifugação, suspenda o pellet celular em sacarose estéril a 10%. Conte as células e centrifugue novamente a 1000 RPM durante cinco minutos. Para remover traços de sal presentes no meio, suspenda as células O car cinco em sacarose a 10% na concentração de duas vezes 10 à quinta células por mililitro, de modo que a contagem final de células por poço seja de 5.000 células em cada poço.As células estão agora prontas para encapsulação na Matriz Pure. Os seguintes passos para encapsular as células na matriz pura devem ser realizados rapidamente: adicione 25 microlitros da suspensão celular previamente preparada ao primeiro tubo individual contendo 25 microlitros da mistura mestra da Matriz Pure. Misture rapidamente pipetando cerca de cinco vezes para cima e para baixo no tubo, sem introduzir bolhas de ar.Em seguida, pipete a suspensão celular de 50 microlitros da mistura pura com Matrixx para o poço apropriado de uma placa de cultura celular de 96 poços. Inicie a ativação do Matrixx puro BD adicionando cuidadosamente 150 microlitros de meio de cultura celular à lateral do poço. Repita os passos de encapsulação das células para os demais poços.Lembre-se de que esses passos devem ser realizados rapidamente e todo o procedimento de encapsulação deve ser concluído em um poço antes de passar para o próximo. Após todos os oito poços terem sido semeados, incube as células por 30 minutos. Após 30 minutos, utilizando uma pipeta de 200 microlitros, posicione a ponteira no poço de modo que ela não toque o leito de matriz pura e remova suavemente o meio do poço. Cerca de dois terços do meio devem ser removidos para equilibrar o pH do hidrogel.Não utilize um aspirador a vácuo, pois isso perturbará a matriz. Em seguida, adicione muito cuidadosamente 150 microlitros de meio fresco de cultura celular ao lado do poço contendo células encapsuladas na Matrixx pura. Da mesma forma que mostrado anteriormente, remova dois terços do meio e adicione meio fresco aos poços restantes.Substitua o meio de cultura celular em cada poço a cada 48 horas por meio de cultura fresco. Células OR cinco foram encapsuladas conforme demonstrado no protocolo seguinte. Renderizações tridimensionais representativas de imagens de células OR cinco encapsuladas e cultivadas em matriz pura nos dias 1, 3, 5 e 7 são apresentadas.Então, acabamos de mostrar como encapsular em cultura a linhagem celular de câncer de ovário CAR cinco e uma matriz sintética chamada Pure Matrixx. Ao usar o Pure Matrixx, é importante perceber que este protocolo foi otimizado para a linhagem celular O Car cinco. Cada pesquisador terá que otimizar e ajustar o protocolo para sua linhagem celular específica.E lembre-se de que, ao realizar trocas de meio, é muito importante não perturbar o leito da matriz, pois ele é muito frágil; nunca aspire e sempre use uma pipeta. É isso aí. Muito obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Biologia

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