Name: Um protocolo para a Produção de KLRG1 tetrâmero (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-12T16:01:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Aprenda a produzir tetrâmeros de KLRG1 para análise de ligantes em imunologia usando expressão bacteriana com IPTG e cromatografia de exclusão molecular. Este método permite estudar interações receptor-ligante.

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Agradecemos ao Dr. Naidenko para ajudar a otimizar as condições refolding. Este trabalho foi financiado pelo NIH pesquisa conceder AI58181 para Laurent Brossay. Cindy Banh é suportado pelo NIH NRSA F31 AI080230. Stephanie Terrizzi e Cindy Banh contribuem igualmente para este trabalho.

Preparação de Corpos de Inclusão <ol><li> Inocular 4 x 500 ml frascos de TB, cada uma contendo 50 mg / ml de cloranfenicol carbenicilina e com uma cultura de bactérias durante a noite expressando a construir KLRG1 plasmídeo. Quando o OD atinge 0,6 Å a 600 nm, induzir com a adição de 0,4 M IPTG e incubar a cultura para um adicional de 4 horas agitação a 37 ° C. </li><li> Ressuspender as células colhidas em pH = 8,0 ressuspensão (50 mM Tris-HCl, 25% (W / V) de sacarose, 1 mM EDTA, 10 mM DTT). Nota: pellets podem ser congeladas nesta fase. </li><li> Piscina não mais que 60 ml de resuspensions bacteriana em um copo de polipropileno. Se necessário, ajustar para 60 ml com tampão TE pH 8,0 e agitar a mistura com metade da velocidade. </li><li> A mistura mexendo add-drop sábio: lisozima (final = 1 mg / ml), MgCl2 (final = 5 mM), 2 mg DNAse I em glicerol a 50% continham 75 mM NaCl, Triton X100 (final = 1%), a TDT ( final = 10 mM). </li><li> Sonicate a solução em gelo por 1,5 min e centrifugar a lisados ​​em 5.000 RPM por 10 min a 4 ° C. <ol class="lalpha"><li> Decantar o sobrenadante. </li><li> Adicionar 15 ml de lavagem pH = 8,0 (50 mM Tris-HCl, 0,5% Triton X-100, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT). </li><li> No gelo, sonicate solução para 1,5 min até que a pelota é completamente ressuspenso. </li><li> Centrifugar as amostras a 5.000 RPM por 10 min a 4 ° C. </li><li> Repita a lavagem 5 vezes. </li></ol></li><li> Repita 5b com tampão de lavagem sem Triton X-100 centrífugas, e ressuspender em 4 ml de tampão TE. </li><li> Pegue o peso úmido inclusão lama corpos e armazenar em tampão TE para uma concentração de 30 a 100 mg / ml. </li></ol> Redobrando de KLRG1 <ol><li> Fazer 1 L de refolding pH = 8,0 (0,4 M-arginina HCl, 0,1 M Tris pH 8-8,3, 2 mM EDTA, 0,2 mM PMSF, 3 EDTA livre de comprimidos inibidores da protease, 5 GSH mM e 0,5 mM GSSG) frio e a 4 ° C, agitando. </li><li> Preparar os corpos de inclusão para injeção a mistura dobrar: É ideal para fazer 5 10 injeções cada um com 0,25 mM de concentração 0,5, para que a concentração final da proteína será 2 3 mM. <ol class="lalpha"><li> Derreta o volume de 50 mg de polpa corpos de inclusão em 7 M GnHCl com 10 mM β-mercaptoetanol. </li><li> Mantenha a inclusão corpos / mistura GnHCl a 37 ° C por 30 - 40 min e vórtice cada 5 minutos para garantir a fusão completa (chorume ficará claro quando completamente derretido). </li><li> Centrifugar a velocidade máxima por 30 minutos em microcentrífuga a 4 ° C e transferir o sobrenadante para um tubo de centrífuga de 15 ml. Não transferir qualquer um dos pelota pequena enegrecida. </li></ol></li><li> Ajustar o volume com tampão de injeção (3 M GnHCl, 10 NaAcetate mM, pH 4.2,10 mM EDTA). </li><li> Injectar 1 ml de corpos de inclusão diluído a cada hora. Ao injetar, mexa em alta velocidade, adicionar 1 ml de diluída gota a gota, corpos de inclusão com 2 segundos entre cada gota. Quando a injeção é feita, agitar a baixa velocidade. </li><li> Continue mexendo noite para o dia em baixa velocidade, a 4 ° C. </li></ol> Concentração de reações redobrando <ol><li> Seguindo o protocolo Millipore s, concentrar a L 1 de pré-filtrada reação (0,22 mM filtrada) refolding usando um Amicon Stirred Celular e YM10 membrana de ultrafiltração NMWL 10K (Millipore) para ~ 10 ml. </li><li> Concentre-se a ≤ 2 ml usando um Centriplus YM-10 10K MWCO (Millipore). </li></ol> Purificação da KLRG1 tetrâmero <ol><li> Configurar o AKTAFPLC a 4 ° C de acordo com manuais GE Healthcare. </li><li> Purificar a forma de monômero de KLRG1 por cromatografia de exclusão utilizando um tamanho Sephacryl S-200 de alta resolução 16/60 coluna (GE Healthcare) em 20 mM HEPES e 150 mM NaCl. (Veja Figura 1). </li><li> Concentrado para 1 ml usando Centriplus YM-10 10K MWCO (Millipore). </li><li> Use enzima Bira acordo com o protocolo de avidez s para biotinylate do monômero KLRG1. </li><li> A biotina livre é eliminado por cromatografia por exclusão de tamanho como em 2. </li><li> KLRG1 molécula é tetramerized misturando KLRG1 monômero com 4 vezes molar excesso PE estreptavidina conjugada (BD Biosciences). </li></ol> Resultados representante <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1702/1702fig1.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1702/1702fig1tmb.jpg" alt="Figura 1" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"></a> Figura 1. Representante resultados positivos da cromatografia de exclusão AKTA FPLC tamanho do refolded KLRG1. O gráfico mostra a separação do monômero (83,52 ml), dímero (56,36 ml), e multimer forma (36,26 ml) da KLRG1 redobrada. O pico em 94,25 ml representa a troca de buffer.

<ol><li>Tessmer, M. S., Fugere, C., Stevenaert, F., Naidenko, O. V., Chong, H. J., Leclercq, G., Brossay, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KLRG1+binds+cadherins+and+preferentially+associates+with+SHIP-1%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">KLRG1 binds cadherins and preferentially associates with SHIP-1.</a> Int Immunol. 19, 391-400 (2007).</li>
<li>Grundemann, C., Bauer, M., Schweier, O., von Oppen, N., Lassing, U., Saudan, P., Becker, K. F., Karp, K., Hanke, T., Bachmann, M. F., Pircher, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+identification+of+E-cadherin+as+a+ligand+for+the+murine+killer+cell+lectin-like+receptor+G1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: identification of E-cadherin as a ligand for the murine killer cell lectin-like receptor G1.</a> J Immunol. 176, 1311-1315 (2006).</li>
<li>Ito, M., Maruyama, T., Saito, N., Koganei, S., Yamamoto, K., Matsumoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killer+cell+lectin-like+receptor+G1+binds+three+members+of+the+classical+cadherin+family+to+inhibit+NK+cell+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Killer cell lectin-like receptor G1 binds three members of the classical cadherin family to inhibit NK cell cytotoxicity.</a> J Exp Med. 203, 289-295 (2006).</li>
<li>Li, Y., Hofmann, M., Wang, Q., Teng, L., Chlewicki, L. K., Pircher, H., Mariuzza, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+natural+killer+cell+receptor+KLRG1+bound+to+E-cadherin+reveals+basis+for+MHC-independent+missing+self+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Structure of natural killer cell receptor KLRG1 bound to E-cadherin reveals basis for MHC-independent missing self recognition.</a> Immunity. 31, 35-46 (2009).</li>
<li>Nakamura, S., Kuroki, K., Ohki, I., Sasaki, K., Kajikawa, M., Maruyama, T., Ito, M., Kameda, Y., Ikura, M., Yamamoto, K., Matsumoto, N., Maenaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((K.+Molecular+basis+for+E-cadherin+recognition+by+killer+cell+lectin-like+receptor+G1+%28KLRG1%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">K. Molecular basis for E-cadherin recognition by killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1).</a> J Biol Chem. , Forthcoming Forthcoming.</li>
</ol>

Neste protocolo, é mostrado como purificar, biotinylate e KLRG1 tetramerize. KLRG1 tetrâmero pode ser usado para rotular KLRG1 ligantes por citometria de fluxo. Embora as condições refolding terá de ser testado empiricamente para cada proteína, outras lectinas tipo C pode ser tetramerized usando um protocolo similar. Uso de proteínas tetramerized como sondas, ligantes para receptores órfão tipo C lectina poderia ser identificado.

<table><tbody><tr><td>Enzima e Tampão BirA</td><td>Kit de Biotinilação</td><td>Avidity</td><td>BIRA500</td><td></td></tr><tr><td>Comprimidos Completos de Inibidor de Protease, sem EDTA</td><td>Reagente</td><td>Roche Group</td><td>11 836 170 001</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>Célula Agitada Amicon</td><td>Equipamento</td><td>EMD Millipore</td><td>Modelo #8400</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>Membrana de ultrafiltração YM10 NMWL 10K</td><td>Material para Filtração</td><td>EMD Millipore</td><td>13642</td><td></td></tr><tr><td>Concentrador de 15 ml YM10</td><td>Material para Filtração</td><td>EMD Millipore</td><td>4411</td><td></td></tr><tr><td>AKTAFPLC</td><td>Equipamento</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1900-26</td><td></td></tr><tr><td>Coluna de alta resolução Sephacryl S-200 16/60</td><td>Equipamento</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1166-01</td><td></td></tr><tr><td>Strepavidina PE</td><td>Reagente</td><td>BD Biosciences</td><td>554061</td><td>ou equivalente</td></tr></tbody></table>

um protocolo para a produção de klrg1 tetrâmero

A Protocol for the Production of KLRG1 Tetramer

Assassino celular G1 receptor lectina-like (KLRG1) é um tipo de receptor da glicoproteína transmembrana II inibitória pertencentes à superfamília tipo C lectina-like. KLRG1 existe tanto como um monômero e como um homodímero dissulfeto ligadas. Este receptor bem conservada é encontrada na maioria das células maduras e recentemente activado NK, bem como em um subconjunto de células T efetoras / memória. Usando KLRG1 tetrâmero, bem como outros métodos, E, N, e R-caderinas foram identificados como KLRG1 ligantes. Estes Ca 2 + dependentes de célula-célula de moléculas de adesão compreende um domínio extracelular contendo cinco repetições caderina responsável por interações célula-célula, um domínio transmembrana e um domínio citoplasmático que está ligada ao citoesqueleto de actina. Geração do tetrâmero KLRG1 foi essencial para a identificação do KLRG1 ligantes. KLRG1 tetrâmero é também uma ferramenta única para elucidar a caderina papéis e jogar KLRG1 na regulação da resposta imune e integridade do tecido.

Este protocolo descreve a produção de KLRG1 tetrâmero, que é uma ferramenta poderosa para a análise de KLRG1 ligantes.

Um protocolo para a Produção de KLRG1 tetrâmero

O receptor do tipo lectina de células killer G1 (KLRG1) é um receptor inibitório glicoproteína transmembranar de tipo II pertencente à superfamília das lectinas do tipo C. ...

Olá, sou Stephanie Resi do laboratório de Lauren Parce, do Departamento de Microbiologia Molecular e Imunologia da Universidade Brown. Hoje vamos mostrar um procedimento para a geração de tetrâmeros K LRG um. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar interações coerentes de K LRG um.Vamos começar. Primeiro, inocular quatro frascos de 500 mililitros de tampão TB contendo antibióticos apropriados com bactérias expressando o plasmídeo KLrg1 e cultivar a 37 graus Celsius com agitação até que a DO atinja 0,6, medidos em angstroms a 600 nanômetros; induzir a expressão por meio do promotor T7 com a adição de IPTG 0,4 molar e incubarem a cultura por mais quatro horas com agitação a 37 graus Celsius. Após a incubação de quatro horas, transferir as bactérias para tubos de centrífuga e centrifugar as culturas por 20 minutos a 3000 RPM e 4 graus Celsius.Se necessário, os pellets podem ser congelados a menos 80 graus Celsius neste ponto para uso em um momento posterior. Ressuspender as células colhidas em 30 mililitros de tampão de ressuspensão Resus. Em seguida, reunir as ressuspensões bacterianas até um volume de 60 mililitros em um béquer de polipropileno.Se necessário, complete o volume total até 60 mililitros com tampão TE extra pH 8 e agite a mistura em velocidade média em um agitador de placa aquecida, enquanto a suspensão de Resus em pool está sendo agitada nas seguintes soluções. Adicione gota a gota à mistura: lisozima, cloreto de magnésio, D NS um, TRITON X-100 e, finalmente, DTT.Transfira a solução para tubos de ultracentrifugação usando um desmembrador com conversor ultrassônico em 30% de amplitude. Sonique a solução em gelo por 1,5 minuto e centrifugue o lisado a 5.000 RPM por 10 minutos a quatro graus Celsius, decante o sobrenadante e adicione 15 mililitros de tampão de lavagem. Repita a sonicação como anteriormente até que o precipitado seja completamente ressuspenso e repita a centrifugação, repita as etapas de lavagem e precipitação cinco vezes.Por fim, ressuspenda o pellet usando tampão de lavagem que não contenha Triton X-100. Centrifugue mais uma vez e ressuspenda em quatro mililitros de tampão TE. Estes são seus corpos de inclusão.Quantifique seus corpos de inclusão pelo peso úmido. A suspensão de corpos de inclusão pode ser mantida a quatro graus Celsius nos estoques de tampão com concentrações de 30 a 100 miligramas por mililitro. Com os corpos de inclusão prontos, você agora pode se preparar para o refolding.Inicie o procedimento de refoldamento preparando um frasco novo de um litro de tamp&atilde;o de refoldamento e agite em velocidade baixa a quatro graus Celsius para resfriar. Em seguida, prepare sete inje&ccedil;&otilde;es de corpos de inclus&atilde;o para inje&ccedil;&atilde;o no tamp&atilde;o de refoldamento. Primeiro, descongele o estoque de suspens&atilde;o de corpos de inclus&atilde;o em um tubo de microcentr&iacute;fuga contendo um volume final de 1,4 mililitros em cloreto de guanidina sete molar mais 10 milimolar de beta-mercaptoetanol em banho-maria a 37 graus Celsius por 30 a 40 minutos.Agite em vórtex a cada cinco minutos. Você saberá que a fusão está completa quando a suspensão ficar transparente.Centrifugue a mistura fundida em velocidade máxima por 30 minutos em uma microcentrífuga a quatro graus Celsius. Em seguida, com cuidado para não coletar nenhum do pequeno pellet esverdeado. Transfira o sobrenadante para um tubo cônico de 15 mililitros.Ajuste o volume para sete mililitros com tampão de injeção para realizar a injeção. Primeiro, aumente a velocidade de agitação da mistura de dobramento para alto. Em seguida, adicione um mililitro de corpúsculos de inclusão diluídos.Goteje gota a gota, com dois segundos entre cada gota, apenas. Adicione um mililitro de corpúsculos de inclusão diluídos de cada vez, com uma hora de intervalo entre as injeções. Retorne a velocidade de agitação para baixa o.Continue agitando em velocidade baixa a quatro graus Celsius durante a noite. As proteínas estarão então prontas para concentração e purificação. Para iniciar a concentração dos tetrâmeros de KLRG1 renaturados.Primeiro, pré-filtre a reação utilizando um filtro de 0,22 micrômetro. Em seguida, concentre a reação de um litro para cerca de 10 mililitros usando uma célula agitada Millipore Amicon e uma membrana de ultrafiltração com limite nominal de peso molecular de 10 kilodaltons, conforme instruções do fabricante e de S. Depois, utilizando uma membrana de ultrafiltração Millipore com corte de peso molecular de 10 kilodaltons, concentre ainda mais até um volume menor ou igual a dois mililitros.Configure o sistema de cromatografia de acordo com as instruções do fabricante. Utilizamos o sistema de cromatografia líquida de proteínas rápida ACTA da GE Healthcare a quatro graus Celsius, empregando uma coluna de alta resolução. Purifique a forma monomérica de K lrg, em tampão hepes 20 milimolar e cloreto de sódio 150 milimolar, por cromatografia de exclusão por tamanho.O volume injetado deve ser inferior a 2% do volume total do gel da coluna. Novamente, utilizando uma membrana de ultrafiltração Millipore com corte de peso molecular de 10 quilodaltons, concentre até um volume final de um mililitro do monômero KLG conforme instruções do fabricante. Elimine a biotina livre purificando como anteriormente, utilizando cromatografia de exclusão por tamanho para obter o tetrâmero.Misture os monômeros KL LRG um com um excesso molar quádruplo de tetraâmeros de estreptavidina conjugados a FITC, que agora estão disponíveis para marcação de ligantes de receptores. Este gráfico mostra um resultado positivo de separação das proteínas KL LRG um renaturadas utilizando cromatografia de exclusão por tamanho, da esquerda para a direita. Os picos ilustram as formas multímera, dimérica e monomérica do KL LRG um.O pico mais à direita representa a troca de tampão. Embora as condições de refoldagem precisem ser testadas empiricamente para cada proteína, outros receptores tipo lectina C deveriam ser capazes de formar tetrâmeros usando um protocolo semelhante, permitindo assim a possível identificação de outros ligantes. Acabamos de mostrar como gerar o tetrâmero de KLRG1 ao realizar este procedimento.É importante lembrar de verificar os níveis de indução e aderir rigorosamente às condições de refoldagem. Assim sendo, é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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