Preparação óssea Undecalcified de Histologia, Histomorfometria e Análise Fluorocromo
8 de janeiro de 2010
Histologia óssea Undecalcified fornece informações importantes para uma variedade de aplicações clínicas e de pesquisa. É tecnicamente desafiador, especialmente com amostras de grande porte. Este vídeo ilustra o processo de produção de seções de boa qualidade e demonstra as dificuldades técnicas e métodos com os quais a superá-los.
E a histologia de osso descalcificado demonstra a microarquitetura óssea, mostrando tanto os componentes mineralizados quanto celulares do osso, fornecendo informações essenciais sobre a renovação óssea ou formação e reabsorção óssea. Isso possui grande importância em diversas aplicações clínicas e de pesquisa. Oferece imagens detalhadas e permite técnicas como avaliação fluorada e histooptometria.
Realizar histologia de ossos não calcificados é tecnicamente desafiador, especialmente com espécimes de grande tamanho. Este vídeo demonstrará as dificuldades técnicas e os métodos para superá-las na obtenção de cortes de ossos não calcificados. Ele não abordará a avaliação histomorfométrica desses cortes.
Para isso, remetemos você à seguinte publicação importante. Este vídeo abordará o preparo do espécime e o processamento de fixação, inclusão e seccionamento, tanto por corte quanto por desgaste, preparação de lâminas e coloração após a coleta do tecido. O espécime.
Neste caso, a coluna cervical de ovelha é colocada em um recipiente opaco e hermético contendo fórmula e solução tampão fosfato a 10%. Deve-se minimizar a exposição à luz, caso a análise de fluorocromo seja realizada. Como os fluorocromos são sensíveis à luz, o espécime é então levado ao laboratório e cortado no tamanho adequado, o que melhora a fixação e garante que se encaixe em um bloco.
Embora seja necessário conhecer, neste momento, a orientação do tecido na lâmina para que o bloco possa ser preparado no plano correto. A segurança é muito importante e os instrumentos devem ser utilizados de modo que as mãos sejam mantidas longe da lâmina. Sua área de interesse é agora cortada no tamanho adequado.
O corte final é então realizado com uma serra de fita menor, o que resulta em menor perda de tecido. Uma vez que um bloco tenha sido cortado no tamanho desejado, ele é colocado em um recipiente selado e opaco contendo fórmula fresca para completar a fixação. O volume do recipiente deve ser aproximadamente 10 vezes o tamanho do espécime.
Para obter uma fixação adequada, o espécime deve permanecer na fórmula e solução por entre uma e duas semanas, dependendo do seu tamanho, após o que é transferido para etanol 70%. O processamento é então realizado de forma lenta, pois o grande tamanho dos blocos e a baixa permeabilidade do osso dificultam a difusão lenta dos solventes. A desidratação é então realizada utilizando concentrações crescentes de etanol e, em seguida, a limpeza em butanol. O espécime é mantido protegido da luz e sob agitação constante.
Recomendamos aproximadamente uma semana em cada solução. Assim, o processamento leva cerca de quatro a seis semanas. Esse processo não deve ser acelerado, pois comprometerá a qualidade final das seções.
Existem várias opções de inclusão disponíveis para osso calcificado. A escolha da resina ou metacrilato depende do que será testado. Por exemplo, a imunohistoquímica não é possível com todas as resinas.
As resinas epóxi requerem luz UV para cura, o que interferiria na análise de fluorocromos. Recomendamos consultar as especificações do fabricante antes de fazer uma escolha cuidadosa. Utilizamos a TEVI 7, 100, pois permite cortes e seções lixadas de boa qualidade para microscopia de luz e análise de fluorocromos, além de ser economicamente viável.
A consideração importante com a inclusão é que a densidade do osso e a densidade do meio de inclusão devem ser bem semelhantes. Isso é muito importante ao cortar posteriormente os blocos, particularmente para seccionamento em microtermos; a mistura é preparada de acordo com as instruções do fabricante e agitada vigorosamente. Pode valer a pena incluir amostras sem revestimento para otimizar o protocolo.
Diferentemente do parafina, este é um passo irreversível. Os blocos são colocados com a superfície de corte voltada para baixo dentro do molde. O molde será maior que o bloco para fornecer suporte e resistência.
A infiltração de metacrilato deve ser realizada lentamente para permitir a infiltração máxima do metacrilato no osso. Novamente, a exposição à luz deve ser minimizada. Após uma semana em solução de infiltração, a solução de infiltração é trocada e a solução de endurecimento é adicionada.
Em seguida, é confeccionada uma placa de apoio. Utilizamos tevit 30 40 para isso. O molde é então removido e o bloco está agora pronto.
O corte por moagem produz seções maiores, com espessura entre 20 e 50 mícrons. É útil para análise de fluorescência, pois seções mais espessas geram fluorescência mais intensa. Para produzir a seção por moagem, é necessário um micrótomo, preferencialmente com lâmina de diamante. Utilizamos uma lâmina de diamante curva de 0,6 milímetro.
Um lubrificante é essencial. Preferimos um lubrificante à base de petróleo, embora lubrificantes à base de silicone também funcionem bem. Em seguida, o bloco é colocado na morsa.
É fixado ao suporte macro e o bloco é avançado em direção à lâmina. A primeira seção expõe a face de corte e orienta o corte. Deve ser descartada.
A moagem é um processo lento e não deve ser acelerada. Deve-se garantir lubrificação adequada durante a moagem da seção. Em seguida, ela é colocada sobre uma lâmina.
Pode ser limpo e polido conforme necessário. A seção tem tendência a enrolar, portanto recomendamos colocar uma parte de um saco plástico sobre ela e mantê-la plana, com outra lâmina fixada no lugar.
Em seguida, é colocado em uma estufa entre 60 e 80 graus Celsius por uma hora. Isso amolece um metacrilato e ajuda a seção a aderir ao lâmina de forma plana. Aqui vemos uma imagem fluorescente composta de três fluorocromos diferentes injetados em intervalos mensais.
Isso permite a identificação do local de mineralização em um momento distinto. As doses e o preparo desses corantes podem ser encontrados no texto. O termo micro fornece seções finas, o que é ideal para microscopia de luz.
Trata-se de um processo tecnicamente desafiador. Sugerimos o uso de um micrótomo de cunha pela maior resistência que oferece para cortar esses blocos duros. Diversos tipos de lâminas podem ser utilizados, incluindo lâminas de carboneto de tungstênio.
No entanto, recomendamos uma lâmina de aço inoxidável, pois pode ser reafiada facilmente e com frequência conforme necessário. A lâmina deve ser orientada de modo a formar um ângulo de 45 graus com um bloco. A densidade da metacrilato é suscetível a diversos fatores, incluindo a umidade ambiente na sala.
O bloco deve, portanto, ser armazenado em uma superfície dessecada. O amolecimento pode ser obtido aplicando-se um papel úmido sobre o bloco, se necessário; pode ser necessário cortar várias seções até alcançar as condições ideais de corte para obter uma seção de qualidade. Novamente, o saco plástico tipo sanduíche e a lâmina adicional são fixados para aplainar a seção antes de ser colocada na incubadora.
A coloração é semelhante à histologia padrão com inclusão em parafina, exceto que a inclusão em cera obviamente não é necessária. As colorações comuns usadas para osso incluem VSA com contracoloração de safranina, safranina, verde-claro ol e másson tricrômica. O protocolo para essas colorações é mencionado no texto.
Os reagentes são selecionados e filtrados antes do uso. Dourado. A coloração é frequentemente utilizada para optometria histológica. Recomendamos otimizar as colorações primeiro em lâminas de teste.
Após cada etapa, a lâmina pode ser examinada ao microscópio para garantir as colorações corretas. Isso permite determinar os tempos adequados para cada corante. Uma vez padronizado o corante, todas as lâminas do experimento são coradas simultaneamente em um suporte, utilizando o mesmo protocolo, para evitar que a variabilidade na coloração afete sua geometria térmica.
As lâminas serão então cobertas de maneira padrão. Desejamos boa sorte em seu experimento.
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Visão Geral
A histologia de osso não descalcificado é essencial para compreender a microarquitetura óssea, incluindo componentes mineralizados e celulares. Este vídeo ilustra os desafios técnicos e os métodos para produzir cortes de qualidade a partir de espécimes grandes.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Histologia óssea
- Aplicações clínicas
- Metodologias de pesquisa
Contexto
- A renovação e formação óssea são vitais para a saúde.
- Seções não descalcificadas fornecem imagens detalhadas da estrutura óssea.
- Técnicas como a avaliação com flúor melhoram a análise.
- Desafios surgem com espécimes grandes no preparo histológico.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar o processo de obtenção de cortes ósseos em descalcificação de qualidade.
- Destacar as dificuldades técnicas no preparo histológico.
- Fornecer soluções para superar esses desafios.
Métodos Utilizados
- Preparação de espécimes de osso não descalcificado.
- Técnicas para corte de espécimes grandes.
- Métodos de avaliação visual.
- Demonstração de técnicas histológicas.
Resultados Principais
- Produção bem-sucedida de cortes ósseos de alta qualidade.
- Identificação dos desafios técnicos comuns.
- Métodos eficazes para superar dificuldades de preparação.
- Compreensão aprimorada da microarquitetura óssea.
Conclusões
- A histologia de osso não descalcificado é essencial para aplicações clínicas e de pesquisa.
- Desafios técnicos podem ser efetivamente gerenciados com métodos adequados.
- Seções de qualidade fornecem informações valiosas sobre a saúde óssea.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A histologia de osso não descalcificado permite a visualização direta dos componentes ósseos mineralizados e celulares, fornecendo dados essenciais sobre renovação, formação e reabsorção óssea. Esta abordagem auxilia na validação de alvos em modelos de doenças esqueléticas ao preservar a arquitetura nativa do tecido para análise quantitativa. O método aumenta a confiança preditiva em estudos pré-clínicos ao permitir a avaliação longitudinal da dinâmica de mineralização por meio de marcação com fluorocromos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas ao preservar tanto os compartimentos ósseos mineralizados quanto celulares para análise mecanicista.
- Valor Operacional: Apoia a redução de riscos biológicos por meio da observação direta dos processos de formação e reabsorção óssea em espécimes relevantes para a doença.
- Valor Traducional: Facilita a confiança no alvo ao permitir a correlação entre pontos finais histológicos e resultados funcionais em modelos pré-clínicos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Fornece saídas quantitativas de histomorfometria e análise de fluorocromos para avaliação padronizada das taxas de mineralização óssea.
- Valor Operacional: Permite a reprodutibilidade do ensaio por meio de protocolos padronizados de corte, coloração e aquisição de imagens aplicáveis a fluxos de trabalho com grande número de espécimes.
- Valor Traducional: Apoia a prontidão para triagem ao gerar dados quantitativos de mineralização com resolução temporal, adequados para avaliação de compostos em farmacologia esquelética.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Oferece continuidade em sistemas relevantes para doenças, permitindo o acompanhamento longitudinal da renovação óssea desde a descoberta até as etapas de validação pré-clínica.
- Valor Operacional: Aborda decisões de avanço ajustadas ao risco ao fornecer dados quantitativos e validados por histomorfometria sobre o fenótipo ósseo.
- Valor Traducional: Melhora a desvinculação preditiva por meio da correlação direta entre padrões de marcação com fluorocromos e eventos temporais de mineralização em estudos de intervenção terapêutica.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se ao contínuo de descoberta, desde a validação inicial do alvo até a identificação de compostos líderes e os testes de eficácia pré-clínica, especialmente para terapêuticas direcionadas ao osso e farmacologia de segurança esquelética.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao permitir a visualização direta da atividade de osteoblastos e osteoclastos em tecido não descalcificado.
- Triagem: Garante prontidão para ensaios por meio de protocolos padronizados de lixamento e corte que geram fluorescência quantificável e resultados histomorfométricos.
- Análises: Fornece medidas quantitativas de variáveis dependentes, incluindo taxa de aposição mineral, taxa de formação óssea e cronogramas de mineralização derivados de fluorocromos, para comparação entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta a descoberta à continuidade pré-clínica ao permitir a avaliação longitudinal da dinâmica de remodelação óssea, essencial para a validação de modelos de doenças esqueléticas.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma histológica reutilizável para programas de farmacologia esquelética por meio de fluxos de trabalho padronizados de inclusão em resina, corte e coloração, aplicáveis a múltiplos modelos ósseos e modalidades terapêuticas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva por meio da avaliação direta e quantitativa da formação e reabsorção óssea, sem artefatos de descalcificação.
- Valor Operacional: Padronização e reprodutibilidade por meio de protocolos validados de inclusão, corte e coloração para espécimes grandes e densos.
- Valor Estratégico: Melhoria nas decisões de avançar ou interromper o desenvolvimento de terapêuticas esqueléticas, reduzindo a ambiguidade mecanicista nos desfechos de remodelação óssea.
- Impacto no Portfólio: Priorização ajustada ao risco de candidatos direcionados ao osso, com base em sinais de eficácia e segurança pré-clínicos validados por histomorfometria.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em histologia óssea, técnicas de inclusão em resina e protocolos de manipulação de fluorocromos.
- Necessita de instrumentação especializada, incluindo micrótomos de corte longitudinal, macrótomos com lâminas de diamante e ambientes de processamento protegidos da luz para garantir a estabilidade dos fluorocromos.
- Exige padronização entre equipes nos tempos de fixação, desidratação e infiltração, para assegurar a qualidade dos cortes em espécimes grandes e de baixa permeabilidade.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes densidades ósseas e tamanhos de espécimes, exigindo meios de inclusão compatíveis com a densidade e tempos prolongados de processamento.
- Inclui limitações práticas, como etapas de inclusão irreversíveis, sensibilidade à luz dos fluorocromos e artefatos de enrolamento dos cortes, que exigem achatamento mecânico durante a montagem.
