Name: Único Recordings Sensillum na Insetos Drosophila melanogaster E Anopheles gambiae /em (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-17T14:25:00.000+00:00
Duration: 13 min 27 s
Description: Aprenda a técnica de registros de sensilo único para estudar neurônios sensoriais olfativos em Drosophila melanogaster e Anopheles gambiae. Este método eletrofisiológico permite medir respostas neuronais a estímulos odoríferos.

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1. Diluições odor <ol><li> A maioria dos odores são solúveis em óleo de parafina. No entanto, DMSO ou etanol também pode ser usado como solventes alternativos para odores particular. Preparar diluições apropriadas (por exemplo, volume de 1:10: volume; v: v) de odores pura em frascos de vidro. Diluições mais odor são estáveis ​​à temperatura ambiente, mas para compostos altamente voláteis, é melhor fazer diluições trabalhando em uma base semanal. Cada sensillum responde aos odores diferentes dentro de uma faixa de concentração diferente. Para Drosophila, uma tabela look-up útil para concentrações adequadas para uso com um sensillum dado pode ser encontrada em 6 de 7. Para o experimento de vídeo, usamos óleo de parafina como um controle de solvente e acetato de metila (10 -6 v: v em óleo de parafina) e 1-octen-3-ol (10 -7 v: v em óleo de parafina) para Drosophila e Anopheles gravações, respectivamente. </li><li> Com uma tesoura, corte o papel para cromatografia em 3 mm x 5 tiras centímetros para que eles se encaixam dentro de pipetas Pasteur. </li><li> Pipetar 30 mL do odor desejado sobre uma tira de papel filtro e insira-o na pipeta de vidro. Cut ~ 3 cm de ar tubo de linha e insira-o na extremidade aberta da pipeta, fechando-a com um conector. O conector é usado para selar a pipeta que será então anexado ao tubo de ar da linha de uma bomba de ar, quando é hora de entregar o odor durante o experimento. </li></ol> 2. Sistema de entrega de odor <ol><li> Usando uma broca pequena, corte a 10 mL de plástico sorológicos pipeta (por exemplo, no 4 mL marca) e criar dois buracos (por exemplo, no mL -1,5 e -0,5 marcas mL) que será usada para manter as pipetas contendo os odores. Inserir uma ponteira 200 mL no acoplador farpado e introduzir o acoplador na extremidade sem corte da pipeta 10 mL. A pipeta será usado como parte do sistema de entrega de odorantes. </li><li> Anexar a pipeta em um suporte magnético com um grampo de pipeta e posicioná-lo perto do microscópio. </li></ol> 3. Eletrodos nitidez <ol><li> Para aguçar eletrodos, preparar uma solução 0,5 M de hidróxido de potássio (KOH) e filtro para remover partículas finas (por exemplo, usando um filtro de M 45). Pegue uma seringa de 20 ml e faça um pequeno furo (~ 2 mm de diâmetro) utilizando uma agulha na parede perto do (~ 1 cm da ponta), em que o fio elétrico está inserido (Figura 1A). Ponta </li><li> Encha a seringa com 0,5 M KOH, e apertá-lo em um suporte sob o microscópio para que a ponta é colocada no campo de visão (Figura 1B, C). Insira o fio elétrico no pequeno orifício na parede da seringa (Figura 1B), certificando-se que o fio não está diretamente na frente da entrada da seringa. Ligue este fio para o catodo de uma fonte de alimentação DC (por exemplo, Heerbrugg Selvagem MTR32, ver métodos) ou um pólo de uma fonte de alimentação AC (por exemplo Selvagem Heerbrugg-LEP 990.018). Anexar o eixo suporte do eletrodo para o micromanipulador manual sobre o lado direito do microscópio, e anexar um cabo elétrico na base do eixo do suporte do eletrodo com um clipe de crocodilo. Conecte o cabo para o ânodo da fonte de alimentação DC ou o outro pólo da fonte de alimentação AC (Figura 1A). </li><li> Insira o fio de tungstênio (~ 5 cm de comprimento) para o suporte do eletrodo, e anexá-lo ao eixo do suporte do eletrodo sobre o manipulador. Definir a fonte de alimentação 6 V, e insira a ponta do fio dentro da seringa várias vezes para aprimorar-lo, tomando cuidado para monitorar a ponta sob o microscópio durante o processo (Figura 1C). Para obter um eletrodo ideal para a gravação, coloque 90% de seu comprimento na solução por até 1 min, e retire-o lentamente. Em seguida, insira apenas ~ 50% do eletrodo para mais fina por 30 s, e repita-o para obter a ponta do fio afiado (~ 10 vezes). A ponta do eletrodo deve ser fino o suficiente para entrar no sensillum, mas não tão fina como a dobrar quando se toca durante as gravações (passos 6 e 7). Embora observando a ponta do eletrodo sob o microscópio de dissecação enquanto ele está sendo afiada é uma boa indicação de sua espessura, apenas olhando para ele sob o microscópio de gravação em alta ampliação dará uma idéia clara se um eletrodo dado é adequado para a gravação. </li></ol> 4. Inseto prep: Drosophila antena <ol><li> Construir um aspirador de voar. Corte um pedaço de tubo de ar longa o suficiente para pendurar confortavelmente em seu pescoço (cerca de 90-120 cm). Corte a ponta de uma ponteira 200 mL e inseri-lo em uma das extremidades do tubo. Por outro lado a posição final, a ~ 1,5 cm x 1,5 cm de malha peça para que ele cria uma barreira física, mas não impede o fluxo de ar para fora do tubo. Corte a ponta de uma pipeta de 1 mL e posição do ponta mais larga em cima da abertura do tubo, bloqueando a malha no meio. Esta parte será usada para pegar e manipular moscas do vinagre adultos (Figura 2). </li><li> Dê uma lâmina de microscópio e coloque um pedaço de cera dental mais ou menos no meio do lado longo. Em cima dela positiond tampa de vidro ligeiramente inclinada para cima (~ 30), certificando-se que a cera não está diretamente abaixo da parte mais alta, o que impediria a visualização do vinagre voar sob o microscópio. Puxar um eletrodo de vidro com o puxador vertical. Sua ponta deve ser fina e flexível o suficiente para caber entre o segundo e terceiro segmento antenal, e manter a estabilidade de antena para as gravações. Posição do eletrodo de vidro em um outro pedaço de cera e coloque-o no lado da tampa de vidro, longe o suficiente para que quando a ponta é reduzida atinge o canto da tampa de vidro (Figura 3A). </li><li> Trabalhar a partir de uma garrafa ou frasco de moscas adultas do genótipo desejado, pegar uma mosca vinagre adultos usando o aspirador voar. Embora as fêmeas são normalmente utilizados por causa de seu maior tamanho, os machos também podem ser usados. Coloque uma ponteira 200 mL em cima da ponta de 1 mL para evitar a voar a partir de escapar. Soprar no tubo, de modo que a mosca é empurrado para o final da ponta da pipeta 200 mL. Guarnição da extremidade larga da ponta da pipeta com a lâmina de barbear alguns milímetros de distância do fly-se, em seguida, insira um pouco de cera para evitar a voar a partir de backing out. Sob um microscópio, corte outra vez perto da cabeça da mosca do vinagre, prestando atenção para não danificar o animal. Com uma ponteira de pequeno porte, empurrar a cera para forçar a cabeça voar para fora de modo que cerca de metade dos olhos extrusão da ponta (Figura 3B). Certifique-se que suas pernas não saem tão bem, ou eles podem se mover e interferir com as gravações. </li><li> Monte a voar em um pedaço de cera, a cabeça virada para cima, e coloque-o no slide na frente do vidro da tampa. Empurre a cabeça ligeiramente contra o canto do vidro, de modo que as antenas estender e descansar sobre o vidro. Inferior a ponta do capilar de vidro entre o segundo e terceiro segmento antenal (Figura 3B). </li><li> Diferentes partes da antena dará acesso a tipos diferentes sensilla. Dependendo necessidades específicas experimental, a antena deverá ser orientado de forma diferente para permitir o acesso a tipos diferentes sensilla. Para gravar a partir sensilla basiconic grandes como em nosso exemplo, a arista é empurrado para baixo no vidro (Figura 3B). </li></ol> 5. Inseto prep: Anopheles palpos maxilares <ol><li> Usando um aspirador elétrico (Figura 2E), recolher 40-60 3-5 dias de idade mosquitos (machos e fêmeas misturados) na gaiola de plástico pequeno (Figura 2F). Mosquitos deveria ter sido criados em condições normais, ou seja, uma incubadora de insetos ou insetário de 25-28 ° C com umidade de 70-80%. Coloque a gaiola de plástico com os animais no gelo para ~ 15 minutos até que eles são anestesiados pelo frio. Uma vez que os animais têm parado de se mover, a transferência somente 4-6 animais ao palco sob o microscópio de uma só vez, mantendo o resto dos animais no gelo durante os procedimentos. Embora as fêmeas são normalmente utilizados por causa de sua sensibilidade ao CO 2, os homens também podem ser empregadas. Selecione mosquitos feminino ou masculino, a julgar pela estrutura de sua antena (feather-like nas fêmeas, filamento semelhante em homens), e remover as suas asas e pernas com uma pinça fina para imobilizá-los. Mantê-los em um copo de plástico pequeno, com um papel molhado na parte inferior, para impedi-los de dessecação. </li><li> Coloque dois pedaços de fita dupla face (~ 1 cm de comprimento) paralelos uns aos outros (~ 1 cm de distância), no centro e no lado do vidro do carro (Figura 3C). Utilizando uma pinça fina, coloque um mosquito na fita central sob o microscópio de dissecação, e transformá-lo de lado e manter seu corpo e um olho na fita. Ajustar a posição do palpos maxilares para que ambos os palpos estender paralelo na fita (Figura 3D). Palpos maxilares corrigir o colocando cordas finas (por exemplo, cabelos humanos), tanto na base e na ponta de palpos (Figura 3D). A fita lateral é usado como um repositório de cordas finas, enquanto a fita central precisa ser substituído após cada gravação (Figura 3C). </li></ol> 6. Gravação de Drosophila melanogaster <ol><li> Coloque o slide sob o microscópio (Figura 4A) com ampliação baixa e posicionar a antena mais ou menos no meio do campo de visão (FOV) (Figura 4B). Delicadamente mais baixo dos eletrodos de modo que o eletrodo de referência está localizado perto do olho da mosca eo eletrodo de gravação é perto da antena (Figura 4C). Aumentar a ampliação e re-posição da antena no meio do FOV (Figura 4D). </li><li> Coloque o odor próximo dispositivo de entrega para a cabeça da mosca, apontando para a antena. </li><li> Com pequeno aumento (Figura 4C), insira o eletrodo de referência para o olho da mosca. Abaixe o eletrodo de registro no topo da antena sem tocar sua superfície. </li><li> Mudar para alta ampliação, controlar o eletrodo de registro com o micromanipulador e inseri-lo em um sensillum selecionados (Figura 4D). Qualquer ponto ao longo do comprimento sensillum é bom para a gravação. Uma vez dentro do sensillum, o eletrodo pode ser empurrado para mais longe na (por vezes durante todo o tempo)para obter uma melhor relação sinal-ruído. Uma vez que o eletrodo está na sensillum, a atividade espontânea das células pode ser detectado. </li></ol> 7. Gravação de Anopheles gambiae <ol><li> Coloque a lâmina de vidro sob o microscópio de baixa ampliação (10x) e posicione o palpos maxilares aproximadamente no meio do FOV ea cabeça no topo (Figura 4E). Girar o palco até que um dos palpos é em um ângulo reto com o eletrodo de registro. </li><li> Ajuste a altura dos eletrodos de modo que o eletrodo de referência está posicionada logo acima do olho do mosquito eo eletrodo de gravação está perto do palpos maxilares. </li><li> Coloque o dispositivo de entrega odor de modo que seja o mais próximo possível do palpos. </li><li> Insira o eletrodo de referência para o olho com menor ampliação (10x), e mudar para a maior ampliação (100x), insira o eletrodo de registro no sensillum peg no palpo (Figura 4F). Uma vez que o eletrodo está na sensillum, a atividade espontânea das células pode ser detectado. </li></ol> 8. Resultados representativos Dependendo do sensillum ea qualidade da gravação, pode-se distinguir diferentes números de neurônios olfativos dentro de um traço único. No sensilla grandes basiconic de Drosophila melanogaster, por exemplo, entre 2 e 4 células que diferem em amplitude pico deve aparecer durante a gravação 9, 10. Em nosso experimento de vídeo, a Drosophila ab2 sensillum mostra duas células, uma. Uma célula (Figura 5, picos de azul) e uma célula B (Figura 5, os pontos verdes) Nem celular é ativado durante a aplicação de óleo de parafina (Figura 5A), enquanto que somente a célula A responde à diluição 10 -6 de acetato de metila (Figura 5B). No palpo maxilar do Anopheles gambiae, o ranhuras peg sensillum contém três células, mas apenas dois são facilmente discriminados (Figura 5C, picos de azul e verde, respectivamente). No experimento de vídeo que mostram como as células B responde a uma diluição de 10 -7 1-octen-3-ol (Figura 5D). <img src="/files/ftp_upload/1725/1725fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Eletrodo sharpener (A) Vista geral do aparato eletrodo apontador. (B) A seringa contendo 0,5 M KOH (à esquerda) usado para afiar o eletrodo (direita). (C) Close-up da ponta do eletrodo ao lado da abertura da seringa. <img src="/files/ftp_upload/1725/1725fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Como preparar um aspirador de voar e aspirador de mosquito (A) A partir do material:... Ar tubo de plástico linha, duas ponteiras de corte, e mesh (B) O aspirador de voar uma vez que está concluída (C) Detalhe da final que é usado para capturar moscas do vinagre Detalhe (D) de a outra extremidade do aspirador voar. (E) O aspirador elétrico para coleta de mosquito consiste de um corpo principal e uma gaiola de plástico destacável. (F) A gaiola de plástico destacável para os mosquitos. <img src="/files/ftp_upload/1725/1725fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Preparando-se uma mosca do vinagre (Drosophila melanogaster) e um mosquito da malária (Anopheles gambiae) para gravação (A) Imagem de um vinagre de voar montado no slide antes de posicioná-lo sob o microscópio. (B) Close-up da cabeça voar vinagre com a antena mantido no lugar pelo capilar de vidro. (C) Imagem de um mosquito montado em o slide. (D) Close-up da cabeça de mosquito com tromba e palpos degola na fita. <img src="/files/ftp_upload/1725/1725fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Gravar a partir de uma mosca do vinagre (Drosophila melanogaster) e um mosquito da malária (Anopheles gambiae) (A) Vista sobre a configuração de eletrofisiologia. (B) Close-up da preparação voar montado no microscópio. Observe a posição respectiva do eletrodo de registro (à esquerda), o sistema de entrega de odor (meio da pipeta), eo eletrodo de gravação (direita). (C) Imagem da mosca sob a objetiva de 10x. Imagem (D) da antena voar sob 100x o objectivo;. sensilla grande basiconic (setas), intercaladas entre os não-sensoriais cabelos (pontas de seta) vista (E) 10x de um mosquito montado para gravação (F) exibir uma ampliação alta do palpo mosquito e um sensillum peg (seta). . <img src="/files/ftp_upload/1725/1725fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Exemplos de gravações de Drosophila melanogaster eAnopheles gambiae (A) A sensillum ab2 de Drosophila melanogaster abriga dois neurônios sensoriais;.. A célula A (pontos azuis) e de células B (spikes verde) (B) As células A e B durante a aplicação de 10 -6 acetato de metila (C) A peg sensillum de Anopheles gambiae abriga dois neurônios sensoriais; a célula A (pontos azuis) e de células B (spikes verde) (D) Aplicação de 10 -7 1-octen-3-ol a sensillum peg..

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</ol>

Pistas olfativas são usados ​​por organismos para identificar fontes de alimento, parceiros em potencial, e predadores. Neurônios sensoriais olfativos (ORS) são o centro primeiro relé entre estímulos externos e os centros superiores do cérebro onde a informação é processada. Em Drosophila melanogaster e Anopheles gambiae, ORS são facilmente acessíveis e sua atividade elétrica pode ser monitorada enquanto estimulado por puffs odor. A única técnica de gravação sensillum (SSR)...

<table><tbody><tr><td>Óleo de parafina</td><td>Odores</td><td>Fluka</td><td>76235</td><td></td></tr><tr><td>Odores de alta pureza (&amp;gt;98%)</td><td>Odores</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Acetato de metila&lt;br/&gt;#296996&lt;br/&gt;1-octen-3-ol&lt;br/&gt;#74950&lt;br/&gt;</td></tr><tr><td>Tiras de papel filtro</td><td>Odores</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-714-1</td><td>Papel cromatográfico</td></tr><tr><td>Conectores</td><td>Odores</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06365-40</td><td>1/16x1/8&quot;</td></tr><tr><td>Frasco de vidro</td><td>Odores</td><td>Agilent Technologies</td><td>5182-0556</td><td></td></tr><tr><td>Tubo plástico para linha de ar</td><td>Entrega de odor</td><td>Python Products</td><td>500PAL</td><td></td></tr><tr><td>1 pipeta serológica</td><td>Entrega de odor</td><td>Corning</td><td>4101</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>Tubo plástico</td><td>Entrega de odor</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06418-0</td><td>0,050&quot;x0,090&quot;OD</td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur descartáveis de vidro borossilicato</td><td>Entrega de odor</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td>5-3/4 polegadas</td></tr><tr><td>Controlador programável de estímulos</td><td>Entrega de odor</td><td>Syntech</td><td>CS-55</td><td></td></tr><tr><td>Mesa anti-vibração</td><td>Equipamento de eletrofisiologia</td><td>TMC</td><td>63533</td><td>36&amp;#8221;Lx30&amp;#8221;Px29&amp;#8221;A</td></tr><tr><td>Gaiola de Faraday</td><td>Equipamento de eletrofisiologia</td><td>TMC</td><td>MI8133303</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio invertido</td><td>Equipamento de eletrofisiologia</td><td>Nikon Instruments</td><td>E600FN ECLIPSE</td><td>Microscópio de gravação</td></tr><tr><td>Objetivas de 10x e 100x</td><td>Equipamento de eletrofisiologia</td><td>Nikon Instruments</td><td>10x Plan Fluor 100x L Plan</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio estereoscópico</td><td>Equipamento de eletrofisiologia</td><td>Nikon Instruments</td><td>EZ645</td><td>microscópio para afiação de eletrodos/preparo de insetos</td></tr><tr><td>Suportes magnéticos</td><td>Equipamento de eletrofisiologia</td><td>Newport Corp.</td><td>MODEL 150</td><td></td></tr><tr><td>IDAC</td><td>Equipamento de eletrofisiologia</td><td>Syntech</td><td>IDAC-4</td><td></td></tr><tr><td>Software de aquisição</td><td>Equipamento de eletrofisiologia</td><td>Syntech</td><td>Autospike</td><td></td></tr><tr><td>1 macromanipulador</td><td>Equipamento de eletrofisiologia</td><td>Narishige International</td><td>MN-151</td><td>Manipulador com joystick&lt;br/&gt;Usado para posicionar o eletrodo de referência</td></tr><tr><td>1 micromanipulador</td><td>Equipamento de eletrofisiologia</td><td>EXFO</td><td>PCS-6000</td><td>Usado para posicionar o eletrodo de gravação</td></tr><tr><td>Clipes de crocodilo</td><td>Equipamento de eletrofisiologia</td><td>Pomona</td><td>AL-B-12-0</td><td></td></tr><tr><td>Cabo elétrico</td><td>Equipamento de eletrofisiologia</td><td>Pomona</td><td>B-36-0</td><td>Montagem de cabo de teste</td></tr><tr><td>2 suportes de eletrodos</td><td>Equipamento de eletrofisiologia</td><td>Syntech</td><td>N/A</td><td>Suportes de eletrodos (conjunto de 2) para eletrodo de fio de tungstênio</td></tr><tr><td>Prova de CA</td><td>Equipamento de eletrofisiologia</td><td>Syntech</td><td>N/A</td><td>Prova universal de extremidade única (10xAC)</td></tr><tr><td>Eletrodos de tungstênio</td><td>Equipamento de eletrofisiologia</td><td>Microprobes</td><td>M210</td><td>hastes retas de tungstênio, 0,005x3</td></tr><tr><td>Hidróxido de potássio</td><td>Equipamento de eletrofisiologia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>Seringa</td><td>Equipamento de eletrofisiologia</td><td>BD Biosciences</td><td>301625</td><td>20 mL</td></tr><tr><td>Fornecimento de energia</td><td>Equipamento de eletrofisiologia</td><td>Wild Heerbrugg</td><td>e.g MTR32</td><td></td></tr><tr><td>Puxador vertical</td><td>Preparo de insetos</td><td>Narishige International</td><td>PB-7</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de barbear</td><td>Preparo de insetos</td><td>VWR international</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Cera dental</td><td>Preparo de insetos</td><td>Patterson</td><td>091-1503</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de microscópio</td><td>Preparo de insetos</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550A</td><td></td></tr><tr><td>Cobertura de vidro</td><td>Preparo de insetos</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541A</td><td>18X18 #1,5</td></tr><tr><td>Malha de polipropileno</td><td>Preparo de insetos</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>CMP-0500-B</td><td></td></tr><tr><td>Eletrodo de vidro</td><td>Preparo de insetos</td><td>Frederick Haer and Co.</td><td>27-32-0-075</td><td>Tubo capilar de borossilicato 1,5 mm OD x 1,12 mm ID x 75 mm</td></tr><tr><td>Fita adesiva dupla face (3M)</td><td>Preparo de insetos</td><td>3M</td><td>MMM6652P3436</td><td>Fita adesiva dupla face (3M)</td></tr><tr><td>Pinça</td><td>Preparo de insetos</td><td>Fine Science Tools</td><td>021x0053</td><td>Pinça espelhada Dumont #5</td></tr><tr><td>Copo plástico pequeno</td><td>Preparo de insetos</td><td>VWR international</td><td>89009-662</td><td>7 x 5,7 (23/4 x 21/4)</td></tr><tr><td>Aspirador elétrico</td><td>Preparo de insetos</td><td>Gempler&amp;rsquo;s</td><td>RHM200</td><td></td></tr></tbody></table>

Único recordings sensillum na insetos drosophila melanogaster e anopheles gambiae</em

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

O sentido do olfato é essencial para insetos para encontrar alimentos, companheiros, predadores, e os locais de oviposição 3. Inseto neurônios sensoriais olfativos (ORS) são colocados em pêlos sensoriais chamados sensilla, que cobrem a superfície dos órgãos olfativos. A superfície de cada sensillum é coberta com minúsculos poros, através do qual odorants passar e dissolver em um líquido chamado linfa sensillum, que banha os dendritos sensorial do ORS alojados em um sensillum dado. Os dendritos OSN expressar odorant receptor (OR) proteínas, que em insetos funcionam como canais iónicos dependentes de odor 4, 5. A interação de odores com ORs aumenta ou diminui a taxa de disparo basal da OSN. Esta atividade neuronal na forma de potenciais de ação incorpora a primeira representação da qualidade, intensidade e características temporais do odorant 6, 7. Dado o fácil acesso a estes pêlos sensoriais, é possível realizar gravações extracelular de ORS único pela introdução de um eletrodo de registro para a linfa sensillum, enquanto o eletrodo de referência é colocado na linfa dos olhos ou do corpo do inseto. Em Drosophila, sensilla casa entre uma e quatro ORS, mas cada OSN normalmente exibe uma amplitude pico característico. Técnicas de classificação de Spike torná-lo possível atribuir respostas spiking a ORS individual. Este single sensillum técnica de gravação (SSR) monitora a diferença de potencial entre a linfa sensillum eo eletrodo de referência como os pontos elétricos que são gerados pela atividade do receptor de ORS 1, 2, 8. Mudanças no número de espigas, em resposta ao odor representam a base celular do odor de codificação em insetos. Aqui, descrevemos o método de preparação usado atualmente em nosso laboratório para realizar SSR em Drosophila melanogaster e Anopheles gambiae, e mostrar os traços representante induzida pela odores de forma sensillum específicos.

Respostas eletrofisiológicas de neurônios sensoriais olfativos de odores pode ser medido em insetos usando gravações sensillum único. Neste artigo vamos demonstrar de vídeo como realizar gravações sensillum única nas antenas da mosca do vinagre (<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;) E os palpos maxilares do mosquito da malária (<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt;).

Único Recordings Sensillum na Insetos Drosophila melanogaster E Anopheles gambiae</em

O sentido do olfato é essencial para que os insetos encontrem alimentos, parceiros, predadores e locais de oviposição3. Os neurônios sensoriais olfativos (NSOs) dos insetos estão encerrados...

Este vídeo demonstra como realizar gravações de sinapses únicas em Drosophila melanogaster, e odorantes preparados de forma bastante cuidadosa são pipetados em tiras de papel e inseridos em pipetas de vidro. Insetos vivos são montados para imobilizar os órgãos olfativos. O inseto é colocado sob um microscópio e um eletrodo de referência é inserido no olho do inseto.O eletrodo de registro é então inserido em um centro olfativo. Um odor é soprado da pipeta para o centro e a atividade neuronal é registrada. Olá, sou Leslie Vasal do Laboratório Sal na Universidade Rockefeller, e sou Mariza Pellegrino, também do laboratório Vasal.E eu sou do, Hoje vamos mostrar um procedimento para registrar atividades de neurônios sensoriais olfativos da mosca do vinagre Drosophila melanogaster e do mosquito da malária Anopheles gambiae. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar como o sentido do olfato funciona em insetos e como os neurônios respondem a substâncias químicas voláteis. Então, vamos começar.Inicie este procedimento afiando os eletrodos a serem utilizados para as gravações. Usando uma broca, faça um pequeno orifício com cerca de dois milímetros de diâmetro na parede de uma seringa de 20 litros, a um centímetro da ponta. Encha a seringa com hidróxido de potássio 0,5 molar filtrado e fixe-a horizontalmente em um suporte sob um microscópio estereoscópico, com a ponta no campo de visão. Insira um fio elétrico no orifício da seringa, garantindo que ele não obstrua a ponta da seringa, e conecte-o ao ânodo de uma fonte de alimentação.No lado direito do microscópio, fixe um eixo do porta-eletrodo a um micromanipulador manual. Em seguida, utilizando um clipe de jacaré, conecte um cabo elétrico à base do eixo do porta-eletrodo. Conecte o cabo ao cátodo da fonte de alimentação.Insira um pedaço de cinco centímetros de fio de tungstênio no suporte do eletrodo e parafuse-o ao eixo. No manipulador. Ajuste a fonte de alimentação para seis vezes.Enquanto observa sob o microscópio estereoscópico, insira um eletrodo na ponta da seringa de modo que 90% do comprimento do eletrodo fique na solução. Após um minuto, retire lentamente o eletrodo e, em seguida, insira-o novamente. Desta vez, apenas 50% do eletrodo deve estar em contato com a solução.Após 30 segundos, retire novamente o eletrodo. Repita este processo 10 vezes, inserindo a agulha a cada vez de modo que 50% do eletrodo entre em contato com o hidróxido de potássio. Uma vez que o eletrodo tenha sido afiado, ele estará pronto para ser utilizado em experimentos.Inicie a preparação do sistema de entrega de odorizante cortando papel de cromatografia em tiras de três milímetros por cinco centímetros e pipetando 30 microlitros do odorizante desejado em cada tira. Em seguida, coloque a tira dentro de um bastão de vidro da sua pipeta. Fixe um pedaço de tubo de ar de aproximadamente três centímetros de comprimento à pipeta.Em seguida, utilize um conector para fechar o tubo e reserve os odorizantes preparados. Depois, com uma lâmina de barbear, corte uma pipeta serológica plástica de 10 mililitros na marca de quatro mililitros a partir do topo e descarte a extremidade pontiaguda. Em seguida, usando uma pequena furadeira, faça dois orifícios, um na marca de menos 1,5 mililitro e outro na marca de menos 0,5 mililitro.Em seguida, insira uma ponteira de pipeta de 200 microlitros em um conector cônico e empurre o conector na extremidade cortada da pipeta de 10 mililitros. Prenda a pipeta a um suporte magnético e posicione-a próxima ao microscópio. Depois, conecte a pipeta serológica a uma bomba de ar usando tubo de ar e coloque as pipetas contendo os odorizantes ao lado da pipeta serológica, prontas para uso.Em seguida, parafuse os eletrodos no suporte de eletrodos e a sonda conectada aos manipuladores no conjunto do microscópio. Coloque um pedaço de lamínula sobre cera odontológica em um ângulo de 30 graus, garantindo que a cera odontológica não cubra a parte superior do vidro. Em seguida, posicione o pedaço de cera odontológica na parte central de um microscópio.Deslize agora e coloque um pedaço adicional menor de cera sobre a lâmina, como mostrado aqui em cima. Coloque uma capilar de vidro puxada com um puxador vertical. Construa um aspirador de voo inserindo uma ponteira de pipeta de 200 microlitros cortada em uma extremidade de um pedaço de tubo de ar de 120 centímetros.Cubra a outra extremidade do tubo com um pedaço de malha de 1,5 centímetro por 1,5 centímetro e fixe-o no lugar tampando-o com uma ponta de pipeta de 1 mililitro cortada. Agora, use o aspirador de moscas para pegar uma mosca adulta de um frasco.Imobilize o inseto tampando a ponta do aspirador de moscas com uma ponteira de 200 microlitros. Em seguida, sopre no tubo para empurrar o inseto em direção à extremidade da ponteira de 200 microlitros. Usando uma lâmina de barbear, corte a extremidade larga da ponteira de pipeta a alguns milímetros de distância do inseto.Insira rapidamente cera dental para prender a mosca sob um microscópio estereoscópico. Apare a ponta da pipeta próximo à cabeça da mosca, tomando cuidado para não machucá-la com a ponta fina da pipeta. Empurre a cera até que cerca de metade dos olhos da mosca saia pela ponta.Certifique-se de que as pernas não saiam, pois podem interferir nas gravações. Monte a mosca sobre um pedaço de cera, com a cabeça voltada para cima. Em seguida, coloque a cera sobre a lâmina ao lado do cubre-objeto conforme mostrado aqui.Empurre levemente a cera para que a antena se estenda e repouse sobre o vidro. Fixe a antena posicionando o capilar de vidro no sulco entre o segundo e o terceiro segmento da antena. Uma vez que a mosca tenha sido posicionada na lâmina, transfira-a para o microscópio utilizado com os arranjos de gravação e de odorantes, usando baixa ampliação.Posicione a antena aproximadamente no centro do campo de visão. Abaixe suavemente o eletrodo de referência e posicione-o adjacente ao olho. Em seguida, abaixe o eletrodo de registro e posicione-o adjacente à antena.Aumente a ampliação e reposicione a antena no centro do campo de visão. Coloque o dispositivo de entrega de odor próximo à cabeça da mosca, apontando para a antena. Retorne à baixa ampliação utilizando um micromanipulador.Insira o eletrodo de referência no olho da mosca. Abaixe o eletrodo de registro sobre a antena sem tocar sua superfície. Em seguida, volte para alta ampliação utilizando o micromanipulador.Insira o eletrodo de registro em um axônio em qualquer ponto ao longo de seu comprimento; quando o eletrodo estiver adequadamente posicionado, poderá ser detectada atividade espontânea nas células do sens. Se necessário, o eletrodo pode ser avançado mais profundamente ou até mesmo totalmente através do sens para obter uma melhor relação sinal-ruído. Para registrar respostas a odoríferos, conecte a pipeta de Pasteur à bomba de ar utilizando tubos de ligação pneumática e aplique o odorífero — neste caso, acetato de metila — ativando a bomba de ar por cerca de um segundo a aproximadamente 220 mililitros por minuto.Usando um aspirador elétrico, colete de 40 a 63 mosquitos com cinco dias de idade em uma pequena gaiola de plástico. Coloque a gaiola sobre gelo por cerca de 15 minutos para anestesiar os mosquitos. Uma vez que os mosquitos tenham parado de se mover, transfira de quatro a seis mosquitos para a platina do microscópio de dissecação.Masculinos e femininos. Mosquitos podem ser usados para gravação. Nos machos.As antenas parecem plumosas, enquanto nas fêmeas parecem filiformes. Usando pinças finas, remova as asas e as pernas dos mosquitos para imobilizá-los. Após a remoção das asas, coloque os mosquitos em um copo de plástico umedecido para impedir que desidratem. Coloque duas tiras de fita dupla face, com um centímetro de comprimento, paralelas uma à outra e separadas por aproximadamente um centímetro, no centro e na lateral de uma lâmina de vidro. Sob o microscópio estereoscópico, use pinças para posicionar um mosquito de lado.No fita central. Um olho ficará grudado na fita. Ajuste a posição das polpas maxilares para que ambas se estendam paralelamente sobre a fita.Fixe as palas maxilares colocando fios finos, como fios de cabelo humano, na base e na ponta das palas. Uma vez que o mosquito tenha sido posicionado na lâmina, transfira-o para o equipamento de gravação. Com baixa ampliação, posicione aproximadamente as palas maxilares no centro do campo de visão e a cabeça na parte superior; gire o estágio até que uma das palas esteja em ângulo reto.Com o eletrodo de registro, ajuste a altura dos eletrodos de forma que o eletrodo de referência fique posicionado logo acima do olho do mosquito. E o eletrodo de registro fique próximo às palpas maxilares. Posicione o dispositivo de entrega de odor de modo que fique o mais próximo possível das palpas.Insira o eletrodo de referência no olho. Mude para a objetiva de 100 x e insira o eletrodo de gravação no pino localizado na palpa. Uma vez que o eletrodo esteja no sento, a atividade espontânea das células pode ser detectada.Como no registro de drosófila, respostas induzidas por odorantes são obtidas pela aplicação do odorante, neste caso, um pulso de OCT 3%, conectando a pipeta posterior contendo o odor ao bomba de ar e, em seguida, ativando a bomba de ar. Agora mostraremos alguns registros representativos de neurônios sensoriais olfativos tanto de drosófila quanto de oph. Dependendo do sol e da qualidade da gravação, é possível distinguir diferentes números de neurônios olfativos dentro de um único traçado no grande silla icônico da base de Drosophila melanogaster, por exemplo, entre duas e quatro células, cujas amplitudes de potenciais de ação distintas devem aparecer durante a gravação.Esta figura mostra gravações feitas de duas células AB lum de drosófila. As gravações da célula A são mostradas em azul, e as gravações da célula B são mostradas em verde, enquanto nenhuma célula é ativada durante a aplicação de óleo de parafina. Conforme mostrado na figura à esquerda, apenas a célula A responde ao acetato de metila no palpo maxilar de OPIS gambier; os pegs sulcados e o soum contêm três células, mas apenas duas são facilmente discriminadas. Aqui.As gravações mostradas em verde indicam a resposta da célula B ao odorante um, OCT três. Acabamos de mostrar como realizar gravações de neurônios sensoriais olfativos da mosca do vinagre drosophila melanogaster e do mosquito da malária e do gambi novato. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de ter uma preparação estável do isset e tanques finos e um eletrodo adequados para realizar com sucesso as gravações.É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Inseto sistemas olfativos fornecem oportunidades únicas para a gravação odorant induzida por respostas nas formas de electroantennograms (EAG) e gravações sensillum simples (SSR), que são somadas as respostas de todos os neurônios olfativos receptor (ORNS), localizado na antena e daqueles alojados em individuais sensilla, respectivamente.

Medidas eletrofisiológicas partir de um sistema olfativo Traça

Neste vídeo, uma mosca Drosophila viva é montada em um tubo para estudos eletrofisiológicos. Os eletrodos são posicionados na base do sensillum para registrar respostas neuronais específicas aos feromônios com os neurônios receptores olfativos da mosca.

Registros eletrofisiológicos de Drosophila Sensilla em resposta a odores voláteis

Este protocolo descreve gravação extracelular das respostas potenciais de ação disparados pelos neurônios do gosto labellar em Drosophila.

Eletrofisiológica Gravação De<em&gt; Drosophila</em&gt; Labellar Prove sensilla

O uso de dois métodos para estimar a expressão do gene nos principais apêndices gustativas de Aedes aegypti, identificamos o conjunto de genes putativamente subjacentes às respostas neuronais para compostos amargos e repulsivas, conforme determinado pelo exame eletrofisiológico.

Fisiológicas Recordings e RNA Sequenciação dos gustativas Appendages do Mosquito-febre amarela Aedes aegypti

Os percevejos dependem de neurônios receptores olfativos alojados em sua sensila olfatória antenal para detectar semioquímicos no ambiente. Utilizando a gravação de um único sensor, demonstramos um método para avaliar a resposta dos percevejos aos semioquímicos e explorar o processo de codificação envolvido.

Usando Individual Sensillum Gravação para detectar respostas Olfativo Neurônio de percevejos para Semioquímicos

As patas dianteiras e a tromba de Drosophila contêm um rico repertório de neurônios sensoriais gustativos. Aqui, apresentamos um método usando imagens de cálcio para medir as respostas fisiológicas de neurônios sensoriais na perna dianteira e na tromba de moscas vivas após a aplicação exógena de um feromônio gustativo.

Medindo respostas fisiológicas de<em&gt; Drosophila</em&gt; Neurônios sensoriais para Lipid feromonas Usando Imagem de cálcio ao vivo

Os microeletrodos afiados permitem a caracterização eletrofisiológica precisa da saída de fotorreceptores e interneurônios visuais em Drosophila viva. Aqui, mostramos como usar esse método para registrar respostas de voltagem de alta qualidade de células individuais à estimulação de luz controlada. Este método é ideal para estudar o processamento de informações neurais em olhos compostos de insetos.

Método eletrofisiológico para respostas gravação intracelular de tensão<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorreceptores e Interneurônios à luz Estímulos<em&gt; In Vivo</em

O objetivo geral deste protocolo é demonstrar como apresentar odorantes de baixa volatilidade para a gravação de sensibilidade única a partir de neurônios receptores olfativos de Drosophila que respondem a feromonas cuticulares de cadeia longa.

Gravação eletrofisiológica de<em&gt; Drosophila</em&gt; Sensilla Tricoide em resposta aos odorantes de baixa volatilidade

Este artigo descreve um protocolo detalhado e altamente eficaz para gravações de único sensillum do basiconica de sensilas sobre os palpos de peças bucais de insetos.

Único Sensillum gravações para Locust palpo sensilas Basiconica

Este protocolo descreve um método para registrar a atividade elétrica descendente do sistema nervoso central Drosophila melanogaster para permitir que o custo-eficiente e conveniente de teste de agentes farmacológicos, mutações genéticas das proteínas neurais, e/ou o papel das vias fisiológicas inexploradas.

Eletrofisiológica gravação da atividade do sistema nervoso Central de terceiro ínstar Drosophila Melanogaster

Um método raramente usado de registro eletrofisiológico, o registro de base, permite a análise de características da codificação do sabor que não podem ser examinadas pelos métodos convencionais de registro. O registro de base também permite a análise das respostas gustativas a estímulos hidrofóbicos que não podem ser estudados usando métodos eletrofisiológicos tradicionais.

Gravação de base: uma técnica para analisar as respostas dos neurônios gustativos em Drosophila

Aprenda a técnica de registros de sensilo único para estudar neurônios sensoriais olfativos em Drosophila melanogaster e Anopheles gambiae. Este método eletrofisiológico permite medir respostas neuronais a estímulos odoríferos.

Único Recordings Sensillum na Insetos Drosophila melanogaster E Anopheles gambiae

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