Name: Imagens ao vivo da motilidade celular e citoesqueleto de actina de neurônios individuais e células da crista neural em embriões Zebrafish (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-03T16:25:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Aprenda a imagem de neurônios individuais e células da crista neural em embriões de zebrafish usando microscopia confocal de fluorescência. Este método permite visualizar dinâmicas de actina e comportamento celular em tempo real.

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Este trabalho foi financiado pelo NIH R01 NS042228 para MCH O FV1000 Olympus confocal foi adquirido com uma instrumentação compartilhada NIH conceder S10RR023717 ao Departamento de Zoologia UW (PI Bement Bill). Erica Andersen, Namrata Asuri e Mateus Barro contribuíram igualmente para este papel.

1. Montagem de slides injeção e slides de imagens Slides injecção: <ol><li> Prepare Sylgard elastômero de silicone de acordo com instruções do fabricante. </li><li> Use o Sylgard de vínculo de vidro para microscópio padrão três slides juntos pelo empilhamento de um slide em cima do cruzamento de outras duas lâminas, que são dispostas lado a lado nas bordas longas. O slide superior cria um ângulo recto, ou "muro" entre o topo eo fundo slides. </li><li> Deixe Sylgard set durante a noite. Estes slides são reutilizáveis. </li></ol> Slides de imagens: <ol><li> Nós usamos retângulos de aço inoxidável cortado para o mesmo tamanho de um slide padrão de vidro de microscópio (75mm x 25mm x 1mm) para a câmara se encaixa no suporte de slides no palco microscópio. Um buraco de 1,5 cm é cortada no centro do retângulo. </li><li> Apor a 22 mm 2 lamela para o retângulo de metal com Sylgard. Use apenas o suficiente para Sylgard completamente selar a lamela. A imagem em um microscópio invertido, embriões será montado neste lamínulas e fotografada do fundo. </li><li> Deixe Sylgard set durante a noite. Estes slides são reutilizáveis ​​e limpas com etanol a 70% entre os usos. </li></ol> 2. Preparação de construções de DNA Para expressar um transgene em um tecido específico maneira, o gene de interesse é clonado por trás de um promotor de células específicas. Nós usamos um elemento cis-reguladora do gene neurogenin1 zebrafish (-3.1ngn1) 2 ou o gene SOX10 (-4.9sox10) 3 a unidade expressão em neurônios sensoriais ou células da crista neural, respectivamente. Para visualizar a dinâmica da membrana celular e, expressamos citoplasmática ou membrana localizada fluoróforos. A distribuição de imagens F-actina, expressamos DNA que codifica o domínio de homologia calponin de utrophin fundido a mCherry (UtrCH-mCherry). O UtrCH-mCherry sonda biossensor permite a visualização de F-actina, sem interferir com a dinâmica da actina 1. Nós gerar esses DNA construções usando o Gateway Invitrogen recombinação estratégia baseada em quatro clonagem e vetores fornecidas no Tol2kit zebrafish 5. <ol><li> Gerar vetor de expressão (s) utilizando Multisite-Gateway Tecnologia e vetores da Tol2kit zebrafish 5. Plasmídeos contém a espinha dorsal da Tol2 pT2KXIGDin. </li><li> Purificar DNA plasmídeo com QIAfilter Plasmid Midi Prep kit (QIAGEN Inc.) e eluir em água estéril. DNA não precisa ser linearizada para a injecção. </li></ol> 3. Injeção de DNA construções <ol><li> Diluir o DNA para uma concentração final de 10-50 DNA mcg / ml em 0,2% de vermelho de fenol (para a visualização durante a injeção) em água. </li><li> Encher e calibrar agulha: Back-fill puxou uma agulha capilar com cerca de 1 mL de solução de DNA e inseri-lo no porta-agulha do aparelho de injeção (usamos um Picospritzer). Usando uma pinça fina, quebra a ponta fora a agulha de modo que uma abertura é de aproximadamente 10 mm de diâmetro. Medir o diâmetro da gota de óleo mineral com um micrômetro ocular. Ajustar a configuração duração pressão para obter uma gota de aproximadamente 1 volume nl. </li><li> Coletar uma célula embriões em estágio embrionário em meio E3 (NaCl 5mM, 0.17mm KCl, CaCl 2 0,33 mm, 0,33 mm MgSO 4 * 7H 2 O, pH 7,0). </li><li> Transferência de cerca de 30-60 embriões para o slide de injeção ea posição dos embriões no canto ângulo reto formado entre o topo eo fundo slides. Remover a maioria da E3 de modo que os embriões são mantidos para o slide pela tensão superficial. </li><li> Use um alfinete dobrado dissecando embriões para rodar assim que o celular é contra a parede do slide injeção. </li><li> Use um micromanipulador para guiar a agulha através do córion do embrião, através da gema e na única célula do embrião. 0,5-1 injetar DNA nl solução para dentro da célula. </li><li> Transferir os embriões em placas de Petri na E3 e incubar a 28,5 ° C. Se necessário, o desenvolvimento pode ser retardado por incubação de embriões em temperatura mais baixa. </li></ol> 4. Embriões de montagem para imagens <ol><li> Remover o córions dos embriões com uma pinça fina cerca de uma hora antes de embriões atingem a idade desejada para a imagem latente (cerca de 14-17 horas pós-fertilização para os nossos propósitos). </li><li> Selecionar embriões com células marcadas utilizando um microscópio de dissecação equipados com fluorescência. Usamos um objetivo 4X (aumento de 40 vezes) em um escopo AZ100 Nikon devido à sua combinação de distância de trabalho longa e alta ampliação. </li><li> Coloque um embrião em um tubo de microcentrífuga com cerca de 50 E3 l contendo 0,2% tricaina anestésico (concentração 10X). </li><li> Adicionar 500 mL 1% agarose de baixo ponto de fusão na E3 com 10 mM HEPES (mantida a 42 ° C), diluindo o tricaina para uma concentração final de 0,02%. </li><li> Transferir imediatamente o embrião em uma queda de agarose àlamela do slide de imagens usando uma pipeta de vidro grande furo. </li><li> Antes da agarose endurece, a posição do embrião para a região com células marcadas é voltada para baixo contra a lamela inferior (baixo dorsal para as células da crista neural e dorsolateral para baixo para os neurônios sensoriais espinhais). </li><li> Montagem de câmara de imagem: Revestir um lado de um anel de plástico (2 cm de diâmetro externo, 3 mm de altura) com graxa de silicone a vácuo e apor ao slide de imagens de metal. Brasão do outro lado do ringue com graxa. </li><li> Encher a câmara com E3 contendo 10 mM HEPES e tricaina 0,02%. Seal no topo da câmara com a aposição de 22 mm 2 lamela para a superfície superior do anel untada. </li></ol> 5. 4D imagem de comportamentos célula em Olympus IX81 FV1000 confocal com microscópio Os detalhes da aquisição de imagem vai depender das especificidades de seu sistema de microscópio. Aqui nós descrevemos o processo de aquisição de lapso de tempo para o FV1000 Olympus microscópio confocal. Ver JOVE protocolo anterior para aquisição de lapso de tempo com o sistema confocal Zeiss LSM 510 6. <ol><li> Coloque a câmara de imagens no suporte de slides sobre o estágio do microscópio e se concentrar no embrião através de um ou 10X 20X objetivo sob luz transmitida. </li><li> Mudar para um objetivo 60X (NA de 1.2 ou superior) e se concentrar em células marcadas com epifluorescência. Nós usar um óleo de imersão (UPLSAPO 60xO NA 1,35) ou água de imersão (UPLSAPO 60xW NA 1,20) lente. </li><li> No software FV (Ver 1.7c), clique em XY repetir para começar a varredura a laser. </li><li> Ajustar as configurações de aquisição e controle de aquisição de imagem (laser de saída, velocidade de digitalização, HV, ganho, e os níveis de offset) para otimizar o sinal, mantendo a potência do laser, no mínimo (25% ou menos) para evitar danos nos tecidos e reduzir a fotodegradação. </li><li> Para adquirir um Z-series, definir os limites superior e inferior da pilha z-, juntamente com o tamanho do passo. Verifique se o ícone de profundidade está engajada para que o ícone de varredura XY XY e Z tem destaque. Iniciar aquisição, clicando no ícone de varredura XYZ. </li><li> Para adquirir uma série de lapso de tempo, defina o intervalo de tempo e número de pontos no tempo sob o título TimeScan na janela Configurações de Aquisição. Clique no ícone de tempo na janela de Controle de Aquisição de Imagens para que o ícone de varredura XY tem XY (Z) e T destaque. Iniciar aquisição, clicando no XY (Z) de varredura ícone T. </li><li> Alternativamente, o TimeController pode ser usado para configurar um lapso de tempo. Esta programação é útil ao gerar grandes conjuntos de dados, já que não exceda a alocação de memória. Em dispositivo, abrir a janela TimeController. Criar uma imagem nova tarefa. A janela de parâmetros de imagem será aberta. Clique no botão Status FV para atualizar as configurações de aquisição. Certifique-se de Salvar e Excluir são verificadas sob o título Terminate. Definir o nome do arquivo de saída e clique em OK para salvar as configurações e fechar a janela. Use a função Loop para definir o intervalo de tempo desejado eo número de pontos do tempo. Clique e Pronto Iniciar para começar a aquisição. O Pause e shift-Z funções pode ser usado para redirecionar enquanto imagem. </li></ol> 6. Resultados representante Os números e os filmes retratam exemplos de neurônios sensoriais e células da crista neural rotulados com membrana-alvo fluoróforos ou a sonda biosensor actina. <img src="/files/ftp_upload/1726/1726fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1 imagens Confocal (z-projeções) de um (ngn1: GFP-caax) Tg. Embrião transgênico injetados com 25 pg ngn1: mCherry-caax DNA. Os rótulos mCherry-CAAX um neurônio vermelho (A) em um fundo com todos os neurônios Rohon Beard-sensorial marcadas de verde (B). C da imagem) Merged de ambos os canais verde e vermelho. Barra de escala = 50 mm. <img src="/files/ftp_upload/1726/1726fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2 Confocal z-projeções de neurônios em embriões injetados com ~ 20 pg ngn1:.. MCherry-UtrCH DNA A) neurônio Rohon Beard-sensorial em 16,5 embrião hpf. F-actina sinal é forte em cones de crescimento (setas) e saliências ao longo dos axônios recém-formado. B) Neuron em 20 hpf embrião mostrando sinal de F-actina forte em cones de crescimento de axônio periférico ramificada (setas) e sinal fraco no centro mais maduro axônios (setas). Barra de escala = 50 mm.

<ol><li>Burkel, B. M., von Dassow, G., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+fluorescent+probes+for+actin+filaments+based+on+the+actin-binding+domain+of+utrophin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+motility+and+the+cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin.</a> Cell motility and the cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).</li>
<li>Blader, P., Plessy, C., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+regulatory+elements+with+spatially+and+temporally+distinct+activities+control+neurogenin1+expression+in+primary+neurons+of+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Multiple regulatory elements with spatially and temporally distinct activities control neurogenin1 expression in primary neurons of the zebrafish embryo.</a> Mech Dev. 120, 211-218 (2003).</li>
<li>Wada, N., Javidan, Y., Nelson, S., Carney, T. J., Kelsh, R. N., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+is+required+for+cranial+neural+crest+morphogenesis+and+chondrogenesis+at+the+midline+in+the+zebrafish+skull%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull.</a> Development. 132, 3977-3988 (2005).</li>
<li>Cheo, D. L., Titus, S. A., Byrd, D. R., Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concerted+assembly+and+cloning+of+multiple+DNA+segments+using+in+vitro+site-specific+recombination%3A+functional+analysis+of+multi-segment+expression+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Concerted assembly and cloning of multiple DNA segments using in vitro site-specific recombination: functional analysis of multi-segment expression clones.</a> Genome Res. 14, 2111-2120 (2004).</li>
<li>Kwan, K. M., Fujimoto, E., Grabher, C., Mangum, B. D., Hardy, M. E., Campbell, D. S., Parant, J. M., Yost, H. J., Kanki, J. P., Chien, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tol2kit%3A+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Dev Dyn. 236, 3088-3099 (2007).</li>
<li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. 24, (2009).</li>
<li>Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho-kinase+and+myosin+II+affect+dynamic+neural+crest+cell+behaviors+during+epithelial+to+mesenchymal+transition+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo.</a> Dev Biol. 324, 236-244 (2008).</li>
</ol>

A concentração ótima de DNA injetado irá variar dependendo do tamanho e da força do promotor construir e deve ser determinada empiricamente. Injeção de DNA em excesso pode levar a embriões doentia com a morte celular extensa, enquanto que muito pouco irá resultar em uma proporção muito pequena de embriões injetados expressando o transgene. O nível de expressão de DNA se correlaciona com a força do sinal fluoróforo, que varia de célula para célula. Embora a triagem de embriões sob epifluorescência, excluir aqueles com ní...

<table><tbody><tr><td>Tricaina (metanosulfonato de etila 3-aminobenzoato)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040-250G</td><td></td></tr><tr><td>Kit de elastômero de silicone Sylgard</td><td>Dow Corning</td><td>184</td><td></td></tr><tr><td>Kit QIAfilter Plasmid Midi</td><td>Qiagen</td><td>12243</td><td></td></tr><tr><td>Agarose de ponto de fusão baixo</td><td>Invitrogen</td><td>15517-014</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer</td><td>Parker Hannifin Corporation</td><td>051-0302-900</td><td></td></tr></tbody></table>

imagens ao vivo da motilidade celular e citoesqueleto de actina de neurônios individuais e células da crista neural em embriões zebrafish

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

O peixe-zebra é um modelo ideal para comportamentos imagens de células durante o desenvolvimento in vivo. Embriões fertilizados peixe-zebra são externamente e, portanto, facilmente acessível em todas as fases de desenvolvimento. Além disso, sua claridade óptica permite imagens de alta resolução de celular e dinâmica molecular no ambiente natural do embrião intacto. Estamos usando uma abordagem imagens ao vivo para analisar comportamentos durante a migração de células da crista neural celular e no crescimento e orientação dos axônios dos neurônios. Imagens ao vivo é particularmente útil para a compreensão dos mecanismos que regulam os processos de motilidade celular. Para visualizar detalhes da motilidade celular, como a atividade protrusiva e dinâmica molecular, é vantajoso para rotular células individuais. Em peixes-zebra, a injeção de DNA plasmídeo produz um padrão de expressão transitória mosaico e oferece benefícios distintos sobre os métodos de rotulagem outras células. Por exemplo, linhagens transgênicas muitas vezes rótulo populações de células inteiras e, portanto, pode obscurecer a visualização das saliências finas (ou mudanças na distribuição molecular) em uma única célula. Além disso, a injeção de DNA na fase unicelular é menos invasivo e mais preciso do que injeções de corante em fases posteriores. Aqui nós descrevemos um método para a rotulagem de neurônios individuais em desenvolvimento ou células da crista neural e imagem o seu comportamento in vivo. Nós injetar DNA plasmídeo em uma célula de embriões palco, o que resulta em expressão do transgene mosaico. Os vetores contêm células específicas promotores que a expressão da unidade de um gene de interesse em um subconjunto de neurônios sensoriais ou células da crista neural. Nós fornecemos exemplos de células marcadas com GFP membrana alvo ou com uma sonda biosensor que permite a visualização de F-actina em células vivas 1. Erica Andersen, Namrata Asuri e Mateus Barro contribuíram igualmente para este trabalho.

Este protocolo descreve imagens de neurônios individuais ou de células da crista neural em embriões vivos zebrafish. Este método é usado para examinar comportamentos e localização celular actina microscopia de fluorescência usando lapso de tempo confocal.

Imagens ao vivo da motilidade celular e citoesqueleto de actina de neurônios individuais e células da crista neural em embriões Zebrafish

O peixe-zebra é um modelo ideal para a imagem de comportamentos celulares durante o desenvolvimento in vivo. Os embriões de peixe-zebra são fertilizados externamente e, portanto, facilmente...

Para imaginar o comportamento de células individuais in vivo, o DNA plasmídico contendo um promotor específico de célula que direciona a expressão de uma flora quatro ou biossensor é injetado em embriões de peixe-zebra. Alterações dinâmicas no efeito e na distribuição são visualizadas in vivo utilizando um biossensor baseado no domínio de ligação do efeito F e da utrofina. Embriões recém-fertilizados são alinhados ao longo da lâmina de injeção e posicionados no canto formado entre as lâminas superior e inferior.O DNA que codifica fluoróforos ou biossensores é injetado na célula. No dia seguinte, os embriões são montados em agarose.No lâmina de imagem, os embriões são posicionados com as células marcadas voltadas para baixo e a câmara é selada com uma lamínula. Olá, sou Erica Anderson do Laboratório de Mary Hallin e dos departamentos de Zoologia e Anatomia da Universidade de Wisconsin Madison. Sou Nam Tauri, também do Laboratório Hallin.E eu sou Matt Clay do Laboratório Hallin. Hoje vamos mostrar um procedimento para a imagem em tempo real de células individualmente marcadas em embriões de peixe-zebra. Utilizamos este procedimento no laboratório para estudar a motilidade celular e a dinâmica da actina durante o crescimento de axônios e a migração de células da crista neural.Então vamos começar. Para montar as lâminas de injeção, primeiro prepare o elastômero de silicone cyl guard de acordo com as instruções do fabricante. Misture 10 partes da base do elastômero com uma parte do agente de cura.Use a proteção cilíndrica para unir três lâminas de microscópio de vidro padrão. Posicione duas lâminas lado a lado pelas bordas longas. Aplique ARD na terceira lâmina e coloque-a por cima das outras duas lâminas.Use apenas a quantidade necessária de cigarro para selar as lâminas, sem excesso escorrendo entre elas. Qualquer excesso pode ser removido no dia seguinte com uma lâmina de barbear. Deixe o protetor SIL curar durante a noite para as lâminas de imagem.Utilizamos retângulos de aço inoxidável cortados com o mesmo tamanho de uma lâmina de microscópio de vidro padrão, com um orifício de 1,5 centímetro cortado no centro. Uma lamínula quadrada de 22 milímetros é fixada ao retângulo de aço com Sylgard. Tanto as lâminas de injeção quanto as lâminas de imagem são reutilizáveis e podem ser limpas entre usos com etanol 70%, seguido por uma lavagem com água antes da injeção de embriões.Dilua o DNA para uma concentração final de 10 a 50 microgramas por mililitro. DNA em 0,2% de vermelho de fenol em água. O vermelho de fenol permite a visualização durante a injeção.Em seguida, encha e calibre a agulha. Encha retrogradamente a agulha capilar de apol com aproximadamente microlitros de solução de DNA. Aguarde a agulha encher e, então, insira-a no suporte da agulha do aparelho de injeção utilizando pinças finas.Quebre a ponta da agulha de modo que a abertura da ponta tenha aproximadamente 10 micrômetros de diâmetro. Meça o diâmetro da gota em óleo mineral com um micrômetro ocular. Para calcular o volume de injeção, ajuste a configuração de duração do pico spritzer.Assim, o diâmetro da gota é de 0,12 micrômetros ou aproximadamente um nanolitro em volume. Uma duração de 10 a 30 milissegundos é típica. Colete embriões em estágio de uma célula em meio E3 para embriões e transfira aproximadamente 30 a 60 embriões para a lâmina de injeção.Posicione os embriões ao longo da borda da lâmina superior e remova a maior parte do E três para que os embriões fiquem presos à lâmina pela tensão superficial com um alfinete de dissecação curvado. Gire os embriões para que a célula fique voltada contra a parede da lâmina de injeção. Utilize um micromanipulador para guiar a agulha através do córion do embrião, pelo vitelo e até a célula única do embrião.Injete de 0,5 a um nanolitro da solução de DNA na célula. Transfira os embriões injetados para placas de Petri em E3 e coloque-os em uma incubadora a 28,5 graus Celsius. Se necessário, o desenvolvimento pode ser retardado incubando os embriões em temperatura mais baixa no dia seguinte à injeção.Prepare os embriões para a aquisição de imagens cerca de uma hora antes de eles atingirem a idade desejada para o exame. Remova as CORs dos embriões com pinça fina. Normalmente iniciamos a aquisição de imagens em embriões com aproximadamente 14 a 17 horas pós-fertilização.Em seguida, selecione embriões com células marcadas utilizando um microscópio estereoscópico equipado com fluorescência; usamos uma objetiva Forex em um microscópio Nikon a Z 100 devido à combinação de longa distância de trabalho e alta magnificação. Coloque um embrião em um tubo microcêntrifuga com aproximadamente 50 microlitros de V três. Adicione estoque de trica e ágar a 1% com ponto de fusão baixo fundido para obter uma concentração final de 0,02% de trica, utilizando uma pipeta de vidro de grande porte.Transfira imediatamente o embrião em uma gota de agro para a lamínula da lâmina de microscopia antes que o aros endureça; posicione o embrião de modo que a região com células marcadas fique voltada para baixo, em contato com a lamínula inferior. Em seguida, monte a câmara de imagem. Revesta um lado de um anel plástico com graxa de silicone para vácuo e fixe-o ao suporte metálico de imagem.Cubra com graxa o outro lado do anel. Preencha a câmara com E três contendo 10 milimolares de heaps e 0,02% de Trica. Selle a parte superior da câmara fixando um lamínula de 22 milímetros quadrados à superfície superior engraxada do anel. O embrião está agora pronto para a imagem em quatro D, como será mostrado na próxima seção.Os detalhes da aquisição de imagens dependerão das especificidades do seu sistema de microscópio. Aqui demonstramos o processo de aquisição com lapso de tempo para o microscópio confocal Olympus FB 1000. Consulte o protocolo JO anterior para aquisição com lapso de tempo com o sistema confocal Zeiss LSM five 10.Coloque a câmara de imagem no porta-lâminas sobre a platina do microscópio e foque o embrião utilizando uma objetiva de 10x ou 20x. Em luz transmitida, mude para uma objetiva de 60x com abertura numérica de 1,2 ou superior, e foque em uma célula marcada com fluorescência em epifluorescência no software FV. Clique em repetição xy para iniciar a varredura a laser.Ajuste as configurações de aquisição e os controles de aquisição de imagem para otimizar a imagem e adquirir uma série Z. Defina os limites superior e inferior do Zack, juntamente com o tamanho do passo. Ative o ícone de profundidade na janela de controle de aquisição de imagem e inicie a aquisição clicando no ícone XY, série Z para adquirir uma série com lapso de tempo.Defina o intervalo de tempo e o número de pontos temporais na varredura temporal. No cabeçalho da janela de configurações de aquisição, clique no ícone de tempo na janela de controle de aquisição de imagens e inicie a aquisição clicando no ícone da suíte XYZT. Apresentamos aqui filmes e imagens representativos de células individualmente marcadas.Quando neurônios individuais são marcados, seus axônios não ficam encobertos por outras células marcadas e, portanto, as extensões OD nos axônios e cones de crescimento são claramente visíveis. Este vídeo mostra um neurônio sensorial marcado com a proteína fluorescente RFP direcionada à membrana. Ele emite dois axônios em direções opostas que crescem para fora do campo de visão.Um terceiro axônio se estende ortogonalmente do corpo celular e forma ramificações. De maneira semelhante, a marcação de células individuais da crista neural permite a visualização de finos processos celulares associados à motilidade celular. Aqui, duas células da crista neural são marcadas com GFP direcionado à membrana.Eles exibem uma atividade protrusiva extensa durante a migração em direção anterior. Muitas vezes é útil marcar células individuais dentro de uma linhagem transgênica para visualizar as interações entre células vizinhas dentro de uma população. Esta imagem mostra um embrião com expressão estável de GFP em todos os neurônios sensoriais que foi injetado com DNA codificando o marcador RFP para rotular um neurônio em vermelho ao fundo de neurônios verdes, pela injeção de DNA codificante.O sensor biológico de actina mostra um efeito mais intenso no sinal nos cones de crescimento e protrusões dinâmicas ao longo dos axônios recém-formados em comparação com o corpo celular. Em um estágio posterior, o sinal permanece forte nos cones de crescimento, enquanto os axônios maduros apresentam sinal significativamente mais fraco. Acabamos de mostrar como realizar a imagem em tempo real de neurônios e células da crista neural individualmente marcados em embriões de peixe-zebra.Ao realizar este procedimento, é importante escolher embriões nos quais o DNA não seja expresso em níveis suficientemente altos para causar toxicidade ou morte celular. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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JoVE Journal

Biology

Biologia

Neste vídeo, demonstramos um método pelo qual para analisar o cérebro em desenvolvimento em embriões vertebrados zebrafish viver em resolução única célula por microscopia confocal. Isso inclui o método pelo qual injetamos o embrião do zebrafish de uma única célula e, posteriormente, montar e imagem do cérebro em desenvolvimento.

Vivem de imagem do cérebro Zebrafish embrionárias por microscopia confocal

Chave para a compreensão dos processos morfogenéticos que forma o embrião precoce é a capacidade de células de imagem em alta resolução. Descrevemos aqui uma técnica para a rotulagem células isoladas ou pequenos aglomerados de células em embriões de peixe-zebra inteira com membrana-alvo Proteína Fluorescente Verde.

Rotulagem e Células de imagem no rombencéfalo Zebrafish

O vídeo atual demonstra um método que tira proveito da combinação de eletroporação e microscopia confocal para realizar imagens ao vivo em células individuais progenitoras neurais no cérebro anterior zebrafish em desenvolvimento.

Lapso de tempo de imagens ao vivo de relação clonal células progenitoras neurais no desenvolvimento Zebrafish Encéfalo anterior

Células que morrem são extrudados a partir de tecidos epiteliais pela contração concertada de células vizinhas, sem interromper a função de barreira. A clareza óptica de zebrafish desenvolvimento fornece um excelente sistema de visualização de extrusão na vida epitélios. Aqui nós descrevemos métodos para induzir e extrusão imagem na epiderme zebrafish larval em resolução celular.

Imagens ao vivo de extrusão celular da epiderme de Zebrafish desenvolvimento

Fonte: Williams, A. L., et al. Imagem de lapso de tempo multifóton para visualizar o desenvolvimento em tempo real: visualização de células migratórias da crista neural em embriões de peixe-zebra. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo mostra um protocolo de imagem de lapso de tempo multifóton para visualizar a migração de células da crista neural em um embrião de peixe-zebra em tempo real com alta resolução.

Visualizando a migração de células da crista neural em um embrião de peixe-zebra usando imagens de lapso de tempo multifóton

A imagem do comportamento dinâmico de organelas e outras estruturas subcelulares in vivo pode lançar luz sobre sua função em condições fisiológicas e de doença. Aqui, apresentamos métodos para marcar geneticamente duas organelas, centrossomas e mitocôndrias, e imagens de sua dinâmica em embriões vivos de peixe-zebra usando microscopia de campo amplo e confocal.

Imagiologia estruturas celulares no embrião vivo Zebrafish

Os protocolos descritos aqui permitem o estudo das propriedades elétricas de células excitáveis nas condições fisiológicas mais não invasivas, empregando embriões de peixe-zebra em um sistema in vivo, juntamente com um indicador de voltagem geneticamente codificado (GEVI) baseado em transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) seletivamente expresso no tipo de célula de interesse.

Potencial de membrana de neurônio motor biossensível em embriões vivos de peixe-zebra

Uma combinação das técnicas de microscopia com longo comprimento de onda multi fóton fluorescência de excitação de laser ópticas foi implementada para capturar imagens de alta resolução, tridimensional, em tempo real de migração da crista neural em Tg (sox10:EGFP) e Tg (foxd3:GFP) zebrafish embriões.

Fóton multi tempo lapso imagem para visualizar o desenvolvimento em tempo real: visualização de migrar as células da crista Neural em embriões de peixe-zebra

Demonstramos um método que aproveita a microscopia confocal de varredura rápida para realizar imagens ao vivo de células da microglia no tectum óptico do peixe-zebra em desenvolvimento, permitindo a análise da dinâmica dessas células in vivo.

Imagem ao vivo e caracterização da dinâmica da microglia no embrião de peixe-zebra

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para examinar a atividade neural em regiões cerebrais de peixes-zebra transgênicos que expressam indicadores de cálcio GCaMP usando microscopia confocal.

In vivo Imagem de fluorescência confocal da atividade neural induzida por estimulação sensorial em peixes-zebra larvais parcialmente contidos

A junção neuromuscular larval do peixe-zebra é um modelo atraente para o estudo da fisiologia sináptica. É passível de muitas técnicas experimentais, incluindo eletrofisiologia e imagens ópticas. Aqui, descrevemos um protocolo para transmissão sináptica de imagem usando uma sonda baseada em pHluorina sob um microscópio de epifluorescência vertical.

Imagens ao vivo da reciclagem de vesículas sinápticas na junção neuromuscular de larvas dissecadas de peixe-zebra

Aprenda a imagem de neurônios individuais e células da crista neural em embriões de zebrafish usando microscopia confocal de fluorescência. Este método permite visualizar dinâmicas de actina e comportamento celular em tempo real.

Imagens ao vivo da motilidade celular e citoesqueleto de actina de neurônios individuais e células da crista neural em embriões Zebrafish (Vídeo) | JoVE Journal

Imagens ao vivo da motilidade celular e citoesqueleto de actina de neurônios individuais e células da crista neural em embriões Zebrafish

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