Síntese e calibração de nanossondas Phosphorescent for Imaging Oxigênio em Sistemas Biológicos

Apresentamos os princípios de medições de oxigênio por quenching fosforescência e da revisão do projeto porfirina baseado nanosensores dendríticas para geração de imagens de oxigênio em sistemas biológicos.

Apresentamos o projeto de sondas fosforescentes para oxigênio à base de DERs de porfirina de platina e paládio. As sondas consistem em núcleos de porfirina metálica encapsulando dendron e construção de camada de polietilenoglicol hidrofílico periférico das sondas e suas calibrações serão ilustradas neste artigo. Olá, meu nome é Luis Sinks.

Trabalho com o professor Sergei OV aqui no Departamento de Bioquímica e Biofísica da Universidade da Pensilvânia. Eu sou Emmanuel Losis, também da Viña. Eu sou gordo também do, E eu sou Sergei V.Medições biológicas de oxigênio por fósforo e têmpera fazem uso de fósforo exógeno e sondas, que são introduzidas diretamente no meio de interesse.

As sondas de sangue ou fluido intersticial são o único componente invasivo do esquema de medição que requer atenção especial ao seu design. Hoje mostraremos um procedimento para a síntese e calibração de nanosondas dendríticas fosforescentes para medição de oxigênio e sistemas biológicos. Usamos este procedimento para sintetizar e caracterizar sondas para medições de oxigênio semi e duplas.

Então vamos começar. Antes de começarmos a construir sondas, vamos primeiro examinar a teoria básica por trás da fosforescência da sonda. A fosforescência se origina do estado de trigêmeos de longa duração.

A molécula da sonda deve ser projetada para fornecer alto rendimento quântico do estado tripleto e emitir fosforescência em vez de fluorescência. A excitação das sondas ocorre por um fóton ou, no caso de sondas especiais aprimoradas por dois fótons, pelo mecanismo de dois fótons. A excitação de um fóton geralmente fornece menos resolução espacial, mas requer instrumentação mais simples e pode ser usada em medições de ponto único com perímetros de fosfos de fibra óptica baseados em LED.

Enquanto no estado tripleto, a sonda pode experimentar encontros colisionais com moléculas de oxigênio, o que pode desativar o estado tripleto, um processo chamado extinção. Portanto, na presença de oxigênio, a vida útil da fosforescência é reduzida. Como resultado da extinção, a dependência do tempo de vida do estado tripleto da quantidade de oxigênio no ambiente é caracterizada pela equação de Stern Volmer.

Em experimentos in vivo, a sonda é entregue no sangue ou fluido intersticial de um animal, e a superfície do tecido é iluminada com luz de um comprimento de onda apropriado para trazer a sonda ao seu estado tripleto excitado. Para medir o tempo de vida fosforescente, os fótons fosforescentes emitidos são bi no tempo. Por exemplo, após o pulso de excitação, 3.609 fótons podem ser coletados nos primeiros cinco microssegundos, 1.421 fótons coletados nos próximos cinco microssegundos e assim por diante até que nenhum fóton seja coletado.

Os números nas caixas plotadas em relação ao tempo fornecem o decaimento da fosforescência, que é analisado para produzir o tempo de vida da fosforescência. Na imagem, esse procedimento é aplicado a cada pixel da imagem, resultando em mapas de vida fosforescente. As medições do tempo de vida são insensíveis às heterogeneidades da distribuição da sonda em todo o objeto, o que é comum para amostras biológicas.

Agora vamos ver como construir sondas. Inicie o procedimento de síntese adicionando um aldeído aromático a uma solução molar de 0,01 de tetra hidro iso indol. Mexa a mistura de reação por 10 minutos no escuro em temperatura ambiente.

Em seguida, adicione boro, trifluoreto datil, coma e continue mexendo por mais duas horas. Em seguida, adicione dicloreto ciano, benzoquinona ou DDQ, o que resulta na cor. Mude de vermelho claro para verde profundo e deixe a mistura durante a noite sob agitação contínua no dia seguinte, lave e seque a solução e concentre-a no vácuo.

A cristalização reg do resíduo dá o alvo como um pó verde. Os rendimentos são normalmente em torno de 50%Em seguida, trate a porfirina de base livre com acetato de paládio. Monitore a conversão por espectroscopia UV vista.

A conversão é concluída após o desaparecimento da faixa de sabão do Dion entre 468 e 472 nanômetros. A porfirina é isolada por cromatografia em coluna em sílica-gel. Para preparar a tetra benzoporfirina de paládio, oxide a tetra cicloporfirina de paládio.

Durante a reflexão, a cor muda de vermelho escuro para verde profundo, evapora o solvente, dilui o resíduo com lavagem de di clorometano, seca e concentra a fase orgânica no vácuo. Após cromatografia em sílica gel, isolar a tetra-benzoporfirina de paládio em pó azul-esverdeado. Em seguida, hidrolisar os grupos etro periféricos da paládio trab benzoporfirina.

Primeiro trate a tetra benzo porfirina Esther com base em tetra hidro purina. Em seguida, continue a hidrólise e a base aquosa, precipite a porfirina por adição de ácido clorídrico e seque-a no vácuo. Isso completa a síntese da porfirina.

Agora vamos ver como sintetizar entradas. Antes que as sondas sejam montadas, as entradas, que são os ramos da Dinamarca, precisam ser pré-sintetizadas. Usamos os mesmos DERs aerodinâmicos, que podem ser convenientemente preparados a partir de materiais de estudo baratos usando métodos livres de cromatografia.

Therons com grupos amino em seus pontos focais são então anexados aos grupos caril no phy, que acabamos de mostrar como fazer. Em seguida, os grupos éster na periferia do DME são hidrolisados de forma semelhante aos grupos carboxílicos na periferia da porfirina. Neste ponto, a partir do ácido policarboxílico Porphyrin DME, uma ou duas sondas de fótons podem ser sintetizadas para sintetizar as duas sondas de fótons.

Primeiro, anexe divergentemente alguns fragmentos de antena de dois fótons a vários grupos carboxila na periferia do demer. Agora prossiga com a modificação dos resíduos de ácido carboxílico restantes no demer. Comece adicionando um excesso de 1,25 vezes de HBTU a uma solução altamente concentrada do rimer de porfirina e mexa a mistura de reação em temperatura ambiente por 10 minutos.

Agora, adicione di isopropil etilamina e metoxi polietileno glicolamina. Mexa a mistura de reação por dois dias em temperatura ambiente e, em seguida, adicione éter etílico. Separe a forma a precipitar por centrifugação e precipite-a novamente do tetraedro algumas vezes adicionando éter datilo.

Por último, purificar a sonda por cromatografia de exclusão de tamanho em esferas de poliestireno utilizando tetraedro como solvente. Agora vamos olhar para a caracterização e calibração da sonda. Os espectros de absorção e emissão da sonda são obtidos usando soluções de sonda micromolar em condições ambientais com um espectrofotômetro padrão e fluorímetro de estado estacionário.

Em seguida, para obter o gráfico de calibração de Ulmer de popa, que nos permite relacionar a vida útil da sonda com a concentração de oxigênio, coloque uma solução da sonda em um vete cilíndrico especial. O vete é posicionado dentro de uma câmara com temperatura controlada dentro de uma gaiola impermeável à luz com portas para fibras ópticas de excitação e emissão. Feche o vete com uma rolha, que possui um eletrodo de oxigênio do tipo Clark altamente sensível inserido.

A rolha também possui duas portas de agulha para entrada e saída de Argonne. Defina a temperatura para 36 a 37 graus Celsius e deixe a solução mexendo até atingir o equilíbrio. Conecte a fibra de excitação ao vazamento de excitação de um perímetro de fosfo digital controlado por um PC.

A fonte de luz e o perímetro fosso são um LED de alta potência, cuja saída é controlada por uma placa digital para analógica de 333 kilohertz. A fibra de emissão é conectada a outra porta óptica do perímetro fos, que é acoplada a um fotodiodo de avalanche sensível ao infravermelho. A saída do diodo é amplificada e alimentada no canal de anúncio da mesma placa de controle, permitindo a sincronização entre os canais de excitação e emissão.

O software de controle escrito em casa gera pulsos de excitação de qualquer comprimento desejado, seguidos pela coleta de decaimento de fosforescência. A saída do eletrodo de oxigênio é amplificada e direcionada para outra placa digital analógica no mesmo PC. Esta é uma placa de baixa frequência, um quilohertz no máximo, que é usada para registrar a corrente do eletrodo em pontos de tempo selecionados, normalmente 10 vezes por segundo.

Uma vez que a temperatura da solução é equilibrada, tanto o perímetro phos quanto os programas de eletrodos são inicializados ao mesmo tempo. Para realizar medições a cada 10 segundos, suas saídas são registradas de forma síncrona em dois arquivos separados. Depois disso, Argonne é conectado à porta de entrada na rolha veterinária.

À medida que o argônio flui sobre a superfície da solução agitada, ele substitui gradualmente o oxigênio. Isso resulta em uma diminuição da corrente do eletrodo e um aumento na vida útil do fósforo, que é medida pelo perímetro do fósforo. Normalmente, o oxigênio é totalmente deslocado da solução.

Após cerca de duas horas após a execução da titulação, os dados do eletrodo e o tempo de vida do fósforo são importados para um programa de análise padrão, que cria um gráfico do tempo de vida inverso do fósforo versus a pressão parcial do oxigênio. Este gráfico é equipado com uma linha reta usando o método dos mínimos quadrados para dar a constante de extinção do oxigênio como sua inclinação. A vida útil fosforescente é obtida a partir do mesmo ajuste ou diretamente da medição com oxigênio zero.

A titulação pode ser repetida usando uma solução da sonda na presença de albumina, uma proteína presente no plasma sanguíneo, a fim de emular as condições encontradas no sangue de um animal in vivo. Os gráficos de Ulmer de popa obtidos devem ser idênticos se o ER estiver protegendo a sonda. Bem, e os grupos de pinos isolam a sonda do contato com a albumina.

A sugestão aqui, etapas selecionadas na síntese de oxigênio, depois tratou os problemas e sua calibração. Ao fazer a calibração. É importante certificar-se de que as condições sejam o mais próximas possível do sistema biológico de interesse.

É importante certificar-se de que a molécula da sonda não seja afetada por biomoléculas, como a albumina. Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com sua experiência.