Name: Síntese e calibração de nanossondas Phosphorescent for Imaging Oxigênio em Sistemas Biológicos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-03T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Aprenda a sintetizar e calibrar nanossondas fosforescentes baseadas em porfirinas de platina e paládio para imagem de oxigênio em sistemas biológicos. Este método permite medições precisas de oxigênio em tempo real.

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Apoio da EB007279 subvenções e HL081273 dos EUA NIH é reconhecido agradecimento.

1. Descrição geral do protocolo de medição de oxigênio (Esta seção não tem nenhuma ação, mas é crucial para compreender o resto do papel. Pode ser filmado, por exemplo, como uma seqüência de slides um Ponto de alguns Power, acompanhada pela voz.) 1.1) A sonda é entregue para o meio de interesse, por exemplo, injetado no sangue ou líquido intersticial de um animal. 1.2) O objeto (superfície do tecido) é iluminado com a luz de comprimento de onda adequado a fim de promover a investigação sobre seu estado triplet animado. Tipicamente excitação ocorre através do mecanismo de um fóton. No entanto, no caso do especial de dois fótons avançada sondas, excitação pode ser feito através do mecanismo de dois fótons, que permite usar as sondas em aplicações de alta resolução da microscopia. Um fóton-excitação geralmente fornece uma resolução espacial menor, mais simples, mas requer instrumentação e pode ser usado em um único ponto medições com LED baseado em fibra óptica phosphorometers. 1,3 fosforescência) emitidos pela sonda se origina do estado triplete de vida longa. A molécula sonda deve ser especialmente concebido para dar rendimento quântico elevado do estado triplete e emitem fosforescência, em vez de fluorescência. Enquanto que no estado triplete, a sonda pode experimentar encontros colisão com as moléculas de oxigênio, que pode desactivar o estado triplete - ". Quenching" de um processo chamado Na ausência de oxigênio, a vida do estado triplete, e, portanto, a decadência fosforescência, é τ 0. Na presença de oxigênio, a vida de fosforescência (τ) é reduzido como resultado da extinção. Existe uma relação direta entre o tempo de vida do estado triplete e da quantidade de oxigênio no ambiente. Esta é a bem conhecida relação de Stern-Volmer, que liga a vida (τ) da fosforescência à concentração de oxigênio [O 2] (ou pressão parcial de oxigênio pO 2): <img src="/files/ftp_upload/1731/1731equation.jpg" alt="Equação" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="equação"> Em sistemas biológicos, o oxigênio é de longe o mais eficaz quencher de fosforescência, o que torna o método de têmpera fosforescência muito seletivos ao oxigênio. 1.4) A fim de medir o tempo de vida t, os fótons emitidos fosforescente são binned no tempo. Por exemplo, após o pulso de excitação, 200 fótons podem ser coletadas nos primeiros 15 microssegundos, 150 fótons coletados nos próximos 15 microssegundos, e assim por diante, até que não os fótons são coletados. Os números nas caixas plotados contra o tempo dar o decaimento de fosforescência, que é analisado para produzir o tempo de vida τ. Na imagem, este procedimento é aplicado em cada pixel da imagem, resultando em mapas vida fosforescência. Medições de vidas são insensíveis ao heterogeneidades de distribuição sonda ao longo do objeto, que é comum para amostras biológicas. Assim, vidas relatório apenas em oxigênio. Vidas τ são convertidos em concentrações de oxigênio utilizando a relação de Stern-Volmer. 2. Construção de sondas fosforescente Sondas fosforescente para medições de oxigênio em sistemas biológicos consistem de cromóforos fosforescente (núcleos), encapsulados em gaiolas construídas de dendrímeros - altamente regular polímeros hiper [3]. Dendrímeros proteger os núcleos a partir de interações com o meio ambiente e controle da taxa de difusão de oxigênio para os núcleos, tornando possível para otimizar a sensibilidade ea faixa dinâmica das sondas (constante k q na relação Stern-Volmer). Términos do dendrímeros são modificados com polietileno glicol quimicamente inerte hidrofílico (PEG) grupos, fazendo com que as sondas altamente solúvel em água e impedindo a sua interação com macromoléculas biológicas. Núcleos fosforescente das sondas estão Pt ou Pd complexos de porfirinas e porfirinas π-extended. π-Extended porfirinas são porfirinas em que anéis de pirrol são fundidos com fragmentos aromáticos externo. Extensão-π permite o ajuste das propriedades sondas espectroscópicas para satisfazer as exigências de uma aplicação de imagem em particular (por exemplo, a tomografia de microscopia vs). Como exemplo, descrevemos a síntese de tetaaryltetrabenzoporphyrins Pd (PdAr 4 TBP) [4]. PdAr 4 TBP têm bandas de absorção poderosa na parte extrema-vermelha do espectro de fosforescência e forte, adequado para medições de oxigênio biológico. A síntese de quatro PdAr TBP consiste das seguintes etapas: 2.1 Preparação) de tetraaryltetracyclohexenoporphyrins (Ar4TCHP) por Lindsey condensação [5] de tetrahydroisoindole com benzaldeídos substituídos. Para uma solução M de 0,01 tetrahydroisoindole (1 eq) em CH &lt;sub&gt; 2 CL 2 do aldeído aromático (1 eq) foi adicionado sob argônio. A mistura de reação foi agitada por 10 min no escuro a RT BF 3 XlT 2 O (0,2 eq) foi adicionado, ea mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por mais 2 h. DDQ (1 eq) foi adicionado, ea mistura foi deixada durante a noite, sob agitação contínua. A solução foi lavada com 10% aq Na 2 SO 3, 10% aq Na 2 CO 3, 5% HCl aq e finalmente com salmoura. A fase orgânica foi seca sobre Na 2 SO 4, então concentrada no vácuo. O resíduo foi recristalizado de CH 2 Cl 2 - terc-butil éter mistura para dar Ar 4 TCHP como pó verde. Rendimentos são cerca de 50%. 2,2) Inserção de Pd para obter PdAr 4 TCHPs. Livre-base porfirinas (1 eq) foram tratados com PdCl 2 ou Pd (OAc) 2 (1,2 eq) em CH 3 CN refluxo na presença de excesso de Et 3 N (20 eq). A conversão foi monitorada por espectroscopia UV-vis (CH 2 Cl 2 de solvente-ácido acético) e considerado completo após a banda Soret de ditado em 468-472 nm desapareceu. A mistura foi autorizado a arrefecer, diluída com CH 2 Cl 2 e filtrada através de uma fina camada de Celite para remover Pd (0). O solvente foi evaporado, eo resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel usando CH 2 Cl 2 como solvente. Fração vermelho escuro foi coletado, o solvente foi evaporado para dar alvo PdAr 4 TCHPs no rendimento de quase quantitativa. 2.3) PdAr 4 TBP foram preparados por oxidação de PdAr 4 TCHPs com o excesso de duas vezes maior de DDQ (16 eq) em THF refluído. Durante refluxo, a cor passou de vermelho-escuro para verde-escuro. O solvente foi evaporado, o resíduo foi diluído com CH 2 Cl 2, lavada com 10% aq Na 2 SO 3, água e salmoura. A fase orgânica foi seca sobre Na 2 SO 4 e concentrada no vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em gel de sílica (eluente CH 2 Cl 2). A fração de verde-escuro primeiro foi coletado, concentrado no vácuo para dar 85-90% de pó como o azul-verde do PdAr4TBP. 2.4) grupos éster periférica de Pd-tetrakis (3,5-dibutoxycarbonylphenyl)-tetrabenzoporphyrin (PdAr4TBP) foram hidrolisadas utilizando 10 vezes o excesso de KOH em 1% (v / v) de água / THF no rt. O solvente foi decantado do precipitado de sais de potássio formado de derivados do ácido carboxílico de PdAr4TBP é. Os sólidos foram dissolvidos em água, agitada por mais 2 h, acidificadas com conc. HCl para pH ~ 4-5. O precipitado obtido foi isolado por centrifugação, lavado com água e secas em vácuo. Proteger dendrons. Cada ramo individual do dendrímero é chamado dendron. Dendrons proteção são construídas de aril-glicina blocos (AG) de construção. Dendrons AG pode ser facilmente sintetizado a partir de matérias-primas baratas e isolados em alta pureza e rendimento por cromatografia em fase livre de métodos. Síntese de geração 2 (G2) AG dendron consiste das seguintes etapas: Síntese 2,4) dos blocos de construção, Boc-protegidos 3,5-dicarboxyphenyl glycineamide e 3,5-dibutoxycarbonylphenyl glycineamide, utilizando do método haloacyl Fischer haleto. 2.5) Acoplamento dos blocos de construção usando CDMT / química acoplamento NMM peptídeo. 2.6) desprotegerem o grupo focal amino agitando a solução do dendron G2 em TFA por 2 h à temperatura 2.7) Para a montagem do dendrons maior geração, acoplamento / desproteção etapas são repetidas. Dendrímero montagem é conseguida pelo acoplamento do dendrons deprotected para PdAr4TBP (ou porfirina outros) usando a química acoplamento HBTU / DIPEA. 2.8) Em primeiro lugar, os grupos Boc-protetores são removidos do dendron. Por exemplo, Boc-protegidos dendron G3 (0,58 g) foi dissolvida em TFA (15 ml), ea mistura foi deixada para reagir à temperatura ambiente por 2h. O ácido foi removido por evaporação rotativa, produzindo a dendron como o TFA-sal. O resíduo foi dissolvido em NMP seco (10 ml) e algumas gotas de DIPEA foram adicionados, para extinguir os vestígios da TFA. 2.9) Antes de iniciar a reação de acoplamento, é fundamental para dissolver completamente o porfirina. Por exemplo, Pt tetracarboxyphenylporphyrin (0,061 g) foi dissolvida em NMP seco (65 ml), sob aquecimento a 140 ° C por 10 min, sob fluxo de nitrogênio. 2.10) A solução foi resfriada à temperatura ambiente, HBTU (0,211 g) foi adicionado, ea mistura foi agitada por 5 min. 2.11) DIPEA (0,35 ml) foi adicionado à mistura em uma parcela, imediatamente seguido por adição do solutina de TFA-sal da dendron em NMP (ver 2.8), ea mistura foi deixada sob agitação durante a noite. 2.12) A mistura foi vertida em aq 3%. NaCl (350 ml), sendo o precipitado resultante foi coletado por centrifugação e lavado com água, MeOH, e 2 Et O por suspensão repetitivos / centrifugação para produzir o alvo porfirina-dendrímero. 2.13) Para hidrolisar os grupos de éster de periféricos, o dendrímero foi tratado com NME 4 OH (~ 5 mM) em DMSO / MeOH mais de 20-60 min período, seguido de a remoção completa do solvente. Este procedimento nos permitiu gerar dendrímeros com número suficiente de grupos carboxilato dar solubilidade em água. Para completar a hidrólise, o dendrímero foi tratada com NaOH 0,1 N aquosa (overnight). Como resultado, pura porfirina-dendrímero ácidos carboxílicos podem ser isolados em rendimentos de 80-95%. Modificação da periferia dendrímero. Neste ponto, a partir da mesma porfirina-dendrímero, seja uma ou duas sondas de fótons podem ser sintetizados. No primeiro caso, todos os grupos carboxila periféricos são modificados com unidades PEG - uma metodologia conhecida como PEGylation. Neste último caso, vários grupos carboxila são primeiramente acoplado com cromóforos de dois fótons de antena (cumarina-343) modificados com etilenodiamina (EDA) linkers, seguido por PEGylation do carboxyls restantes [6]. Dendrímeros foram PEGylated usando monomethoxyoligoethyleneglycolamine (m-PEG-NH 2, Av. Prof. MW 1000) usando HBTU / DIPEA química acoplamento. 2.14) A uma solução do dendron em NMP (ou DMF) (1-10 mM) 1,25 vezes o excesso de HBTU foi adicionado, ea mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 10 min. Excesso de 6,25 vezes maior de DIPEA foi adicionado, seguido pela adição imediata de 1,25 vezes o excesso de m-PEG-NH2. A mistura de reação foi agitada por 2 dias a rt. Éter etílico foi adicionado à mistura de reação, o precipitado formado foi separado por centrifugação e re-precipitado de THF pela adição de éter etílico. 2,15) Final de purificação foi alcançado com o tamanho-exclusão por cromatografia a coleta da fase de primeira frente. PEGylated porfirina-dendrímero foi dissolvido em uma pequena quantidade de THF (~ 15 ml) e carregado no topo de uma coluna cromatográfica preenchida com poliestireno SEC fase (Biorad, Biobeads S-X1). A coluna foi eluída com THF puro, ea banda de cor escura se movendo com a frente foi coletado. 2.16) THF foi removido em um evaporador rotativo, eo material remanescente foi seco em vácuo. 3. Caracterização sonda Caracterização fotofísicas inclui medições de espectros a sonda de absorção e emissão, fosforescência vidas τ 0 e Stern-Volmer oxigênio quenching constantes k q em condições fisiológicas. 3.1) O espectro de absorção e emissão são obtidos sob condições de ambiente usando a instrumentação padrão (espectrofotômetro e fluorímetro estável). ~ 1 mM soluções da sonda é usada. 3.2) Em seguida, a curva de calibração Stern-Volmer é obtido. Esta é a medida mais importante, porque nos permite relacionar a vida útil da sonda para a concentração de oxigênio. 3.3) A solução da sonda em tampão PBS (pH 7,2) é colocado em uma cubeta cilíndrica especial, que é posicionado dentro da câmara de temperatura controlada, localizado dentro de uma gaiola de luz impermeável com portas para excitação e emissão de fibras ópticas. As fibras são colocados em contato próximo com a cubeta dentro da câmara na geometria de ângulo reto. 3.4) A cuvete é fechado com uma tampa, no qual um eletrodo de oxigênio altamente sensíveis do tipo Clark (CK-eletrodo de oxigênio) é inserido. A rolha também contém duas portas agulha para entrada e saída de argônio. O eletrodo é imerso na solução, enquanto que as agulhas apenas prever o fluxo de fluxo de gás acima da superfície da solução. Na primeira, o argônio não está conectado à entrada. 3.5) A temperatura é definida para o valor desejado (tipicamente 36-37 ° C) ea solução é deixada sob agitação de equilíbrio. 3.6) A fibra de excitação é conectado à porta de excitação de um phosphorometer digital, operada por um PC. A fonte de luz na phosphorometer é um LED de alta potência, cuja produção é controlada por um 333 kHz D / A bordo. A fibra de emissão é ligado a outra porta óptica do phosphorometer, que é acoplado a um APD altamente sensível ao infravermelho (fotodiodo avalanche). A saída do diodo é amplificado e alimentado no canal A / D da placa de controle mesmo, o que permite a sincronização entre a excitação e os canais de emissão. 3.7) O controle de software albaixos geração de pulsos de excitação de qualquer comprimento desejado (por exemplo, 5 ou 10 ms), seguido da coleta de decaimento de fosforescência durante qualquer período arbitrário escolhido (tipicamente 2-3 ms). Tempo necessário para uma medição única vida é tipicamente 0,5-1 s, no entanto, as medições podem ser obtidas tão rapidamente quanto 10-20 por segundo. 3.8) A saída do eletrodo de oxigênio é amplificada e direcionada para outro A / D bordo no mesmo PC. Esta é uma placa de baixa freqüência (1 kHz máx), que é usado para gravar o eletrodo de corrente em períodos de tempo selecionado. O programa para gravar os dados do eletrodo é executado simultaneamente com o software phosphorometer. 3.9) Uma vez que a temperatura da solução é equilibrada, tanto phosphorometer o eletrodo e os programas são inicializados ao mesmo tempo para realizar as medições a cada 10 s. Suas saídas são registradas de forma síncrona em dois arquivos separados. Depois disso, o argônio é conectado à porta de entrada sobre a rolha cuvete. 3.10) Como argônio flui sobre a superfície da solução agitada, gradualmente substitui o oxigênio. Isso resulta em uma diminuição da corrente de eletrodo e um aumento no tempo de vida de fosforescência, que é medido pelo phosphorometer. Normalmente, o oxigênio é deslocado formar a solução totalmente após cerca de 2 h, durante o qual os dados são totalmente desconectado automaticamente em arquivos. 3.11) Após o final da corrida de titulação, os dados do eletrodo e as vidas fosforescência são importados para um programa de análise padrão (Origem Miocrocal por exemplo). A corrente do eletrodo depende linearmente da concentração de oxigênio, e para o eletrodo usado é praticamente zero em oxigênio zero. À pressão atmosférica, pO 2 é conhecido (cerca de 150 mm Hg). Assim, os dados do eletrodo podem ser diretamente convertidos para a escala de oxigênio, eo enredo da vida de fosforescência inversa x pO 2 pode ser construído. Este lote está equipado com uma linha reta pelo método dos mínimos quadrados para dar a têmpera kq de oxigênio constante como sua inclinação. Tempo de vida de fosforescência t0 é obtido a partir do encaixe mesmo (como o inverso do intercepto) ou diretamente a partir da medição em zero oxigênio. 3.12) Se necessário, a titulação é repetido utilizando uma solução da sonda na presença de albumina - uma proteína presente no plasma sanguíneo em altas concentrações, - a fim de imitar as condições reunidas no sistema real experimental (sangue de um animal in vivo). A obtenção de Stern-Volmer parcelas devem ser idênticas, se o dendrímero está protegendo o sensor de medição e grupos PEG isolar a sonda a partir dos contatos com a albumina. Caso contrário, a sonda e as proteínas no sangue irá interagir, e que levará a uma trama Stern-Volmer alteradas, causando ambigüidade nas medições de oxigênio. Constantes de calibração assim obtidos são usados ​​em experimentos com imagens em que as concentrações de oxigênio são um desconhecido a priori.

<ol><li>Vanderkooi, J. M., Maniara, G., Green, T. J., Wilson, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+method+for+measurement+of+dioxygen+concentration+based+on+quenching+of+phosphorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">An optical method for measurement of dioxygen concentration based on quenching of phosphorescence.</a> J. Biol. Chem. 262, 5476-5482 (1987).</li>
<li>Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+phosphorescence%3A+A+novel+method+for+measuring+the+distribution+of+oxygen+in+perfused+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging of phosphorescence: A novel method for measuring the distribution of oxygen in perfused tissue.</a> Science. 241, 1649-1651 (1988).</li>
<li>Lebedev, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+phosphorescent+probes+for+oxygen+Imaging+in+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Acs+Applied+Materials+and+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Dendritic phosphorescent probes for oxygen Imaging in biological systems.</a> Acs Applied Materials and Interfaces. 1, 1292-1304 (2009).</li>
<li>Finikova, O. S., Cheprakov, A. V., Beletskaya, I. P., Carroll, P. J., Vinogradov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+versatile+synthesis+of+substituted+tetrabenzoporphyrins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Organic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Novel versatile synthesis of substituted tetrabenzoporphyrins.</a> Journal of Organic Chemistry. 69, 522-535 (2004).</li>
<li>Lindsey, J. S., Schreiman, I. C., Hsu, H. C., Kearney, P. C., Marguerettaz, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rothemund+and+Adler-Longo+Reactions+revisited%3A+Synthesis+of+tetraphenylporphyrins+under+equilibrium+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Organic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rothemund and Adler-Longo Reactions revisited: Synthesis of tetraphenylporphyrins under equilibrium conditions.</a> Journal of Organic Chemistry. 52, 827-836 (1987).</li>
<li>Lebedev, A. Y., Troxler, T., Vinogradov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+metalloporphyrin-based+dendritic+nanoprobes+for+two-photon+microscopy+of+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Porphyrins+and+Phthalocyanines%22%5BJournal%5D)">Design of metalloporphyrin-based dendritic nanoprobes for two-photon microscopy of oxygen.</a> J. Porphyrins and Phthalocyanines. 12, 1261-1269 (2008).</li>
</ol>

<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"&gt;<tr<td<strong&gt; Abreviatura</strong<strong</strong</td&gt;<td<strong&gt; Nome completo</strong<strong</strong</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; NMP</td&gt;<td&gt; N-methylpyrrolidinone</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; TFA</td&gt;<td&gt; Ácido trifluoroacético</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; DIPEA</td&gt;<td&gt; Diisopropylethylamine</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; HBTU</td&gt;<td&gt; 2 - (1H-benzotriazol-1-il) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorofosfato</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; DMSO</td&gt;<td&gt; Dimetilsulfóxido</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; CDMT</td&gt;<td&gt; CDMT = 1-cloro-3 ,5-dimethoxytriazine</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; NMM</td&gt;<td&gt; NMM = N-methylmorfoline</td&gt;</tr&gt;</table

síntese e calibração de nanossondas phosphorescent for imaging oxigênio em sistemas biológicos

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Medição de oxigênio por quenching fosforescência [1, 2] consiste das seguintes etapas: 1) a sonda seja entregue para o meio de interesse (por exemplo, sangue ou líquido intersticial), 2) o objeto é iluminado com luz de comprimento de onda adequado a fim de excitar a sonda em seu estado triplet, 3) a fosforescência emitido é coletado, e respectiva evolução no tempo é analisado para produzir o tempo de vida de fosforescência, que é convertido para a concentração de oxigênio (ou pressão parcial, pO<sub&gt; 2</sub&gt;). A sonda não deve interagir com o ambiente biológico e em alguns casos a ser 4) excretado do meio após a conclusão da medição. Cada uma dessas etapas impõe exigências de projeto molecular das sondas fosforescentes, que constituem o único componente invasivo do protocolo de medição. Aqui nós revemos o projeto de dendríticas nanosensores fosforescente para medições de oxigênio em sistemas biológicos. As sondas consistem em Pt ou Pd porfirina baseado polyarylglycine (AG) dendrímeros, modificado perifericamente com polietileno glicol (PEG de) resíduos. Para a excitação de dois fótons eficaz, términos do dendrímeros podem ser modificados com dois fótons cromóforos antena, que captam a energia de excitação e canalizá-los para os núcleos triplet das sondas via intramolecular FRET (Förster Resonance Energy Transfer). Descrevemos as propriedades fotofísicas chave das sondas e apresentar protocolos de calibração detalhado.

Apresentamos os princípios de medições de oxigênio por quenching fosforescência e da revisão do projeto porfirina baseado nanosensores dendríticas para geração de imagens de oxigênio em sistemas biológicos.

Síntese e calibração de nanossondas Phosphorescent for Imaging Oxigênio em Sistemas Biológicos

A medição de oxigênio por supressão de fosforescência [1, 2] consiste nas seguintes etapas: 1) a sonda é introduzida no meio de interesse (ex: sangue ...

Apresentamos o design de sondas fosforescentes para oxigênio com base em DERs de porfirina de platina e paládio. As sondas consistem em núcleos de metaloporfirina encapsulando dendrons e uma camada periférica hidrofílica de polietilenoglicol; a construção das sondas e suas calibrações serão ilustradas neste artigo. Olá, meu nome é Luis Sinks.Trabalho com o Professor Sergei OV aqui no Departamento de Bioquímica e Biofísica da Universidade da Pensilvânia. Sou Emmanuel Losis, também da Vina. Também sou do, E sou Sergei. Medidas biológicas de oxigênio por fosforilação e extinção utilizam fósforo exógeno e sondas, que são introduzidas diretamente no meio de interesse.As sondas de sangue ou fluido intersticial são o único componente invasivo do esquema de medição que exige atenção especial ao seu design. Hoje mostraremos um procedimento para a síntese e calibração de nanosondas dendríticas fosforescentes para medição de oxigênio em sistemas biológicos. Utilizamos este procedimento para sintetizar e caracterizar sondas para medições de oxigênio semiplenas e duplas.Então vamos começar. Antes de iniciarmos a construção das sondas, vamos primeiro revisar a teoria básica por trás da fosforescência das sondas. A fosforescência origina-se do estado triplete de longa duração.A molécula do sondagem deve ser projetada para apresentar alto rendimento quântico do estado triplete e para emitir fosforescência em vez de fluorescência. A excitação das sondas ocorre por meio de um fóton ou, no caso de sondas especiais com aprimoramento por dois fótons, pelo mecanismo de dois fótons. A excitação por um fóton geralmente oferece menor resolução espacial, mas exige instrumentação mais simples e pode ser utilizada em medições pontuais com fosforímetros de fibra óptica baseados em LED.Enquanto no estado triplete, a sonda pode sofrer encontros colisionais com moléculas de oxigênio, o que pode desativar o estado triplete, um processo denominado quenching. Portanto, na presença de oxigênio, o tempo de vida da fosforescência é reduzido. Como resultado do quenching, a dependência do tempo de vida do estado triplete em relação à quantidade de oxigênio no ambiente é descrita pela equação de Stern-Volmer.Em experimentos in vivo, a sonda é administrada no sangue ou no líquido intersticial de um animal, e a superfície do tecido é iluminada com luz de um comprimento de onda apropriado para levar a sonda ao seu estado triplete excitado. Para medir o tempo de vida fosforescente, os fótons fosforescentes emitidos são contados ao longo do tempo. Por exemplo, após o pulso de excitação, 3.609 fótons podem ser coletados nos primeiros cinco microssegundos, 1.421 fótons coletados nos próximos cinco microssegundos, e assim por diante até que nenhum fóton seja mais coletado.Os números nos compartimentos plotados em função do tempo fornecem o decaimento da fosforescência, que é analisado para determinar o tempo de vida da fosforescência. Na imagem, este procedimento é aplicado a cada pixel da imagem, resultando em mapas de tempo de vida fosforescente. As medidas de tempos de vida são insensíveis às heterogeneidades na distribuição da sonda ao longo do objeto, o que é comum em amostras biológicas.Agora vamos ver como construir as sondas. Inicie o procedimento de síntese adicionando um aldeído aromático a uma solução 0,01 molar de tetra hidro iso indol. Agite a mistura reacional por 10 minutos no escuro e à temperatura ambiente.Em seguida, adicione boron, trifluoreto de dietila, ate, e continue a agitação por mais duas horas. A seguir, adicione dicloreto de cianogênio, benzoquinona ou DDQ, o que resulta na mudança de cor, de vermelho pálido para verde escuro, e deixe a mistura durante a noite sob agitação contínua. No dia seguinte, lave e seque a solução, e então concentre-a sob vácuo.A cristalização do resíduo fornece o alvo na forma de um pó verde. Os rendimentos são tipicamente em torno de 50%. Em seguida, trate a porfirina na forma de base livre com acetato de paládio. Monitore a conversão por espectroscopia UV-vis.A conversão está completa após o desaparecimento da banda de absorção do Dion entre 468 e 472 nanômetros. A porfirina é isolada por cromatografia em coluna sobre gel de sílica. Para preparar o tetra-benzo porfirina de paládio, oxide a tetra-ciclo porfirina de paládio.Durante a reflexão, a cor muda de vermelho escuro para verde escuro, evapore o solvente, dilua o resíduo com lavagem de diclorometano, seque e concentre a fase orgânica em vácuo. Após a cromatografia em gel de sílica, isole o pentaclorobenzo porfirina de paládio como um pó azul-esverdeado. Em seguida, hidrolise os grupos periféricos de etro da pentaclorobenzo porfirina de paládio.Primeiro, trate o éster de tetra benzo porfirina com base em tetra hidro furano. Em seguida, prossiga com a hidrólise em base aquosa, precipite a porfirina pela adição de ácido clorídrico e seque-a em vácuo. Isso conclui a síntese da porfirina.Agora vamos ver como sintetizar entrons. Antes que as sondas sejam montadas, os entrons, que são os ramos do Denmark, precisam ser previamente sintetizados. Utilizamos aero gly, mesmos DERs, que podem ser convenientemente preparados a partir de materiais de estudo baratos usando métodos livres de cromatografia.As terons com grupos amino em seus pontos focais são então ligados aos grupos caril na fita, cuja síntese acabamos de demonstrar. Em seguida, os grupos éster na periferia do DME são hidrolisados de maneira semelhante aos grupos carboxílicos na periferia da porfirina. Neste ponto, partindo do ácido poli-carboxílico da porfirina DME, pode-se sintetizar um ou dois sondas fotônicas para obter as sondas de dois fótons.Primeiro, acople divergentemente alguns fragmentos de antena de dois fótons a diversos grupos carboxila na periferia do demer. Em seguida, prossiga com a modificação dos demais resíduos de ácido carboxílico no demer. Comece adicionando um excesso de 1,25 vezes de HBTU a uma solução altamente concentrada do rimer de porfirina e agite a mistura reacional à temperatura ambiente por 10 minutos.Agora, adicione diisopropiletilamina e metoxi polietilenoglicolamina. Agite a mistura reacional por dois dias à temperatura ambiente e, em seguida, adicione éter etílico. Separe o precipitado por centrifugação e reprecipite-o várias vezes de tetrahidrofuran adicionando éter etílico.Finalmente, purifique a sonda por cromatografia de exclusão por tamanho em esferas de poliestireno utilizando tetrahedrano como solvente. Agora vamos analisar a caracterização e calibração da sonda. Os espectros de absorção e emissão da sonda são obtidos usando soluções de sonda a um micromolar sob condições ambientes com um espectrofotômetro padrão e um fluorímetro em estado estacionário.A seguir, para obter o gráfico de calibração de Stern Ulmer, que nos permite relacionar a vida útil da sonda à concentração de oxigênio, coloque uma solução da sonda em um vete cilíndrico especial. O vete é posicionado dentro de uma câmara com temperatura controlada, localizada dentro de uma gaiola impermeável à luz, com portas para fibras ópticas de excitação e emissão. Feche o vete com uma rolha, na qual está inserido um eletrodo de oxigênio do tipo Clark altamente sensível.A rolha também possui duas portas de agulha para entrada e saída de Argônio. Ajuste a temperatura entre 36 e 37 graus Celsius e mantenha a solução sob agitação até atingir o equilíbrio. Conecte a fibra de excitação à porta de excitação de um fosforímetro digital controlado por um computador.A fonte de luz e o perímetro do fósforo é um LED de alta potência, cuja saída é controlada por uma placa digital para analógica de 333 kilohertz. A fibra de emissão está conectada a outra porta óptica do perímetro do fósforo, que é acoplada a um fotodiodo de avalanche sensível ao infravermelho. A saída do fotodiodo é amplificada e enviada ao canal ad da mesma placa de controle, permitindo a sincronização entre os canais de excitação e emissão.O software de controle desenvolvido internamente gera pulsos de excitação de qualquer duração desejada, seguidos pela coleta do decaimento da fosforescência. A saída do eletrodo de oxigênio é amplificada e direcionada a outra placa analógica-digital no mesmo computador. Esta é uma placa de baixa frequência, com limite máximo de um quilohertz, utilizada para registrar a corrente do eletrodo em pontos de tempo selecionados, tipicamente 10 vezes por segundo.Uma vez que a temperatura da solução esteja equilibrada, tanto o perímetro phos quanto os programas do eletrodo são inicializados simultaneamente. Para realizar medições a cada 10 segundos, suas saídas são registradas sincronamente em dois arquivos separados. Em seguida, Argonne é conectado à porta de entrada na rolha de vedação.À medida que o argônio flui sobre a superfície da solução agitada, ele gradualmente substitui o oxigênio. Isso resulta em uma diminuição da corrente do eletrodo e em um aumento do tempo de vida do fósforo, que é medido pelo perímetro do fósforo. Normalmente, o oxigênio é totalmente deslocado da solução.Após cerca de duas horas do término da corrida de titulação, os dados do eletrodo e os tempos de vida do fósforo são importados para um programa padrão de análise, que gera um gráfico do inverso do tempo de vida do fósforo versus a pressão parcial de oxigênio. Esse gráfico é ajustado com uma linha reta utilizando o método dos mínimos quadrados, fornecendo a constante de extinção pelo oxigênio como seu coeficiente angular. O tempo de vida fosforescente é obtido a partir desse mesmo ajuste ou diretamente da medição em oxigênio zero.A titulação pode ser repetida usando uma solução da sonda na presença de albúmina, uma proteína presente no plasma sanguíneo, a fim de emular as condições encontradas no sangue de um animal in vivo. Os gráficos de Stern-Volmer obtidos devem ser idênticos se o ER estiver protegendo a sonda. Bem, e os grupos peg isolam a sonda do contato com a albúmina.A sugestão aqui é selecionar etapas na síntese de oxigênio, em seguida tratar as sondas e calibrá-las. Ao realizar a calibração, é importante garantir que as condições sejam o mais próximas possível às do sistema biológico de interesse.É importante garantir que a molécula sonda não seja afetada por biomoléculas, como a albumina. Assim sendo, é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seu experimento.

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Biology

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