Robótica e Análise de Imagem Dinâmica de Estudos de Expressão Gênica em Tecidos Vegetais

Neste procedimento, a dinâmica da expressão gênica nos tecidos vegetais é visualizada ao longo do tempo com o uso da robótica, primeiro as sementes de feijão-de-lima são esterilizadas e colocadas entre toalhas de papel umedecidas em um recipiente de cultura de tecidos para germinação. Após quatro dias, os coan são removidos e bombardeados com uma construção de DNA contendo um promotor fundido ao GFP Coan colocado em placas de Petri são montadas em um sistema de coleta de imagens robóticas bidimensionais personalizado. O robô é programado para capturar imagens de cada pedaço de tecido a cada hora durante 100 horas.

As imagens são submetidas à análise de imagens, dados quantitativos sobre a intensidade da expressão de GFP ao longo do tempo. Olá, sou John Finer, diretor do Laboratório de Transformação de Plantas do Departamento de Horticultura e Ciência das Culturas da Ohio State University. Eu sou Carlos Herandez Garcia, estudante de doutorado no laboratório final da Ohio State University.

Hoje Carlos mostrará o protocolo que desenvolvemos para análise de expressão gênica e tecidos vegetais usando a proteína fluorescente verde. Usamos este procedimento que desenvolvemos em laboratório para medir a tensão da atividade do OD. Para fazer isso, promova nossa primeira coroa a montante do gene GFP, que são nossos genes repórteres.

Vou mostrar-lhe como introduzimos o controle do promotor em Lima veia Cataly e enviar um aplicativo em nosso sistema de captura de imagem robótica de design personalizado. Vou terminar examinando nosso protocolo de análise de imagens. Então vamos lá: Para começar este procedimento, sementes de feijão-de-lima esterilizadas à superfície usando procedimentos padrão.

Coloque as sementes esterilizadas em sete recipientes magenta GA entre camadas de toalhas úmidas e de papel e incube-as por quatro dias a 25 graus Celsius. Aqui usamos um vetor de expressão de alto número de cópias, útil para análises de promotores e elementos promotores. Este vetor contém o gene GFP, que é usado para visualizar a função do promotor ou do elemento promotor em tecidos transformados cerca de uma a duas horas antes do bombardeio.

Excise o chumbo de feijão-de-lima de tegumentos. A chumbo adequada para bombardeio deve ser amarela a verde clara, plana e livre de qualquer dano que possa interferir na análise de imagem imediatamente após a excisão, coloque 12 de chumbo em uma placa de Petri com meio de cultura OMS contendo sais de MS B, cinco vitaminas, sacarose a 3% e taxa de gel a 0,2% em pH 5,7. Em seguida, precipite a construção de DNA em partículas de tungstênio M 10 Primeiro, logo antes do uso, ressuspenda as partículas em água estéril a uma concentração de 100 miligramas por mililitro.

Em seguida, em um tubo de fuga de 0,6 mililitro, adicione 25 microlitros de partículas, cinco microlitros de DNA a um micrograma por microlitro, 25 microlitros de cloreto de cálcio 2,5 molar e 10 microlitros de espermatozóides 100 milimolares aine. Incube a preparação de DNA em gelo por cinco minutos, depois remova e descarte 50 microlitros da solução em cima das partículas. Ressuspenda as partículas revestidas de DNA que permanecem no fundo do tubo por vórtice.

E imediatamente após o vórtice, remova um Eloqua de dois microlitros. Repita esta etapa de vórtice. Toda vez que um Eloqua é removido, as partículas revestidas devem ser mantidas no gelo e usadas em 15 minutos.

Agora que o DNA está revestido nas partículas, coloque dois microlitros de partículas na parte superior de um filtro de seringa no meio de uma tela de filtro. Em seguida, coloque o filtro de seringa na unidade de retenção do filtro dentro da pistola de entrada de partículas ou câmara PIG. Coloque um feijão-de-lima com o lado axial para cima em um defletor que consiste em uma tela derretida no fundo de um copo.

Coloque o defletor, que é usado como uma plataforma para apoiar os tecidos durante o bombardeio na câmara do canhão de partículas. Para bombardear o tecido, primeiro abra a válvula que leva ao vácuo para evacuar a câmara. Quando o vácuo atingir 760 milímetros de mercúrio, ative o solenóide e libere o hélio para impulsionar as partículas.

A pressão de hélio usada para acelerar as partículas é de 50 a 60 PSI. Após o bombardeio de partículas, feche a válvula da linha de vácuo e libere o vácuo usando a válvula de escape. Quando o vácuo for liberado, abra a porta da câmara para recuperar a entrada de chumbo bombardeada e retorne a entrada de chumbo de co em um lado dal.

Até o meio de cultura OMS para quantificação e perfil de expressão. Bombardeie um mínimo de três co-chumbo para cada construção de DNA. Um controle positivo, que fornece um perfil de expressão gênica bem estudado, também está incluído.

Os co-líderes estão agora prontos para a obtenção de imagens. Ligue a lâmpada de mercúrio e aguarde 30 minutos para que a lâmpada aqueça. Ligue as fontes de energia da câmera SPOT R-T-C-C-D e do controlador do motor, que aciona o movimento da plataforma robótica personalizada, que comporta oito placas.

Defina o conjunto de filtros para detecção de GFP selecionando o conjunto de dois filtros GFP com excitação de 480 nanômetros e emissão de 510 nanômetros em um microscópio de dissecação MZ L três. Em seguida, esterilize as tampas espessadas da placa de Petri de policarbonato pulverizando com etanol a 70%. As tampas especializadas usadas para cobrir a base da placa de Petri, evitam a condensação durante a coleta de imagens.

Coloque as placas contendo o cuan bombardeado na plataforma robótica e aperte o parafuso de fixação lateral para prendê-las na posição. Agora abra o aplicativo de software personalizado que controla a plataforma robótica e a aquisição de imagens. Abra também o interruptor do controlador de luz branca do software usando o software, oriente a plataforma para a posição inicial.

Isso é feito antes de entrar nas posições. Para cada nó na guia do motor, selecione a primeira placa. A plataforma posicionará o centro da placa de Petri sob a objetiva do microscópio.

Usando os botões de distância de movimento, posicione com precisão o primeiro LEADIN para coleta de imagens. Usando o recurso de modo ao vivo, mova o chumbo de abraço para o apropriado viewárea Para o primeiro chumbo de abraço, use os botões manuais no microscópio de dissecação para definir o foco e definir a ampliação para 1.6 x. Depois que a região de interesse for definida, clique no botão adicionar esta posição.

O software adicionará as coordenadas desta região a um arquivo de programação de posições e a plataforma retornará ao centro das posições do conjunto de placas para todos os coens restantes nas placas. Usando os botões de distância de movimento, use os três parafusos de nivelamento manual localizados abaixo de cada placa na plataforma robótica para ajustar o foco do coan restante na mesma placa. Depois que todas as coordenadas de todos os coan tiverem sido inseridas, salve as coordenadas do cronograma de posição.

Insira os parâmetros de coleta de imagens, como tipo de luz, que é azul para GFP e configuração de exposição, bem como especifique onde armazenar as imagens conforme descrito no protocolo escrito que acompanha. Vá para a guia de controle de tempo de captura e defina o intervalo de tempo de aquisição de imagem e o número total de ciclos de coleta de imagens. As imagens são normalmente coletadas a cada hora durante 100 horas.

Gerando perfis de expressão gênica bem definidos. Inicie a aquisição de imagens abrindo a guia de agendamento de posições e clicando no botão de agendamento de execução. Isole o sistema de coleta de imagens de luz externa no final da coleta de imagens de 100 horas.

As imagens de alta resolução com cerca de cinco megabytes cada estão prontas para análise de imagem. Use a imagem pronta para montar as 100 imagens sequenciais de cada pasta. Importe todas as imagens sequenciais como quadros e redimensione-as para 800 por 600 pixels para acelerar o processamento da imagem.

Em seguida, use marcas em uma nova camada introduzida, que é visível em todos os quadros e usando pontos GFP selecionados na referência da imagem. Alinhe manualmente cada imagem quando o alinhamento estiver concluído, exclua a camada usada como referência e salve o arquivo como um único arquivo PSD. Além disso, exporte todos os quadros como um único arquivo MOV usando a resolução mais alta.

Os arquivos agora estão prontos para iniciar a quantificação do GFP. Use a imagem J para abrir o arquivo MOV e cortar uma área de 400 por 300 pixels. Em seguida, separe as imagens sequenciais em canais vermelho, azul e verde usando a ferramenta de divisão RGB para canais vermelho e verde.

Subtraia a fluorescência de fundo usando o ROI medido de subtração para cada ferramenta de plug-in de fatia. Calcule a expressão GFP ajustando os níveis de limite e usando um plug-in projetado para medir o valor médio da escala de cinza por pixel e o número total de pixels que expressam GFP. Copie os valores de saída na imagem J.Por fim, cole os valores de saída dos canais verde e vermelho no Microsoft Office.

Excel para manipulação de dados adicional para lhe dar uma ideia dos resultados do alinhamento da imagem. Esta primeira animação mostra a imprecisão do reposicionamento da plataforma robótica durante o experimento de 100 horas. O movimento pontual é um artefato resultante da incapacidade da plataforma robótica de retornar exatamente à mesma posição em cada ponto de tempo após o alinhamento manual da imagem, as células que expressam GFP podem ser prontamente observadas e os recursos exclusivos desse sistema de rastreamento são facilmente visualizados.

Como esta animação repete, observe que as células que expressam GFP que estão circuladas, a célula que está circulada em vermelho mostra um declínio muito rápido na expressão 18 a 20 horas após o bombardeio, enquanto a célula que está circulada em branco mostra um início tardio da expressão de GFP. Além das animações, este procedimento permite a rápida quantificação da expressão de GFP ao longo do tempo no tecido-alvo do feijão-de-lima. Esses resultados representativos mostram a quantificação comparativa da intensidade do promotor usando o promotor CAMV 35 S e quatro diferentes promotores de soja.

Acabamos de mostrar como introduzir DNA na catalina de germinar. As sementes de veios de Lima colocam a catalina no robô, coletam imagens para análise de imagens e analisam essas imagens. Usamos rotineiramente esse procedimento em nosso laboratório para validar promotores de plantas clones.

Pode-se gerar uma grande quantidade de dados a partir da introdução de diferentes promotores de plantas. No entanto, este procedimento é complicado com muitas etapas que podem dar errado ao fazer este procedimento é importante começar com sementes frescas de feijão ou pelo menos usar sementes de alta qualidade que foram armazenadas adequadamente. Também é importante colocar a tampa cortada na bomba e instalá-la no robô rapidamente e usar a tampa grossa do prato para animais de estimação para minimizar os problemas de condensação.

E por último, observe que o GFP que usamos é outra versão chamada SGFP, front Gen HIN Lab na Universidade de Harvard. Esta GFP não é muito estável e pode ser melhor para rastrear mudanças rápidas na expressão gênica. E isso é itra nós por nos observar.

E boa sorte com seus experimentos.