Name: Preparação de Abóboras Drosophila cromossomos politênicos para Rotulagem de anticorpos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Aprenda a técnica de squash para preparar cromossomos politênicos de Drosophila melanogaster para rotulagem de anticorpos. Este método permite visualizar proteínas específicas e estudar expressão gênica em microscopia.

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Agradecemos a Sra. V. Lephart para manutenção de estoques voar Este trabalho foi financiado pelo National Institutes for Health subvenção (GM62916) e National Science Foundation subvenção (MCB0817107).

O seguinte protocolo para a preparação politênicos cromossomo de squash é uma adaptação do procedimento descrito no Johansen et al. (2009). 1. Cultura de larvas de terceiro instar Drosophila A fim de obter melhor cromossomos politênicos para preparações de squash de alta qualidade, condições de cultivo uncrowded são essenciais (ou seja, coloque em torno de 20 egg-laying moscas fêmeas em um padrão de garrafa fly 4 "e mudar para um novo frasco a cada dia). Selecione o mais gordo indivíduos a partir da primeira safra de escalada larvas 3 enquanto eles ainda estão vagando, mas pouco antes de pupação. Nós cultura rotineiramente a 21 ° C 18 ° C, mas vai render mais gordos que os cromossomos podem ser mais adequados para determinados fins, como por exemplo quando a banda / interband regiões precisam ser visualizados em alta resolução. 2. Politênicos materiais de squash <ul><li> Pinça de dissecção Drummond (2) </li><li> Placas de Petri (60 x 15 mm) </li><li> Lâminas de microscopia fosco (n º 12-544-3 Fisher) (poli-lisina-revestido) </li><li> 22 x 22 mm N º 15 lamínulas (Fisher No. 12-520B) (revestido com Sigmacote; Sigma # SL2) </li><li> 22 x 40 No. 15 mm lamínulas (Fisher No. 12-530B) </li><li> Kim-wipes </li><li> Microscópio de contraste de fase com objetivo 20X </li><li> Pequena Dewar (por exemplo, balão de vácuo ou garrafa térmica garrafa) </li><li> Forceps longo </li><li> Giletes </li><li> Coplin Jar </li><li> Maid de borracha ou bandeja de Tupperware (ou bandeja selável equivalente) </li><li> Parafilme (corte em 22 quadrados mm) </li><li> 175 pesos g </li></ul> 3. Fixadores e soluções <ol><li> Estoque de formaldeído 5X. Prepare uma nova solução de 0,74 g. paraformaldeído em 4,0 ml de dH 2 O e com 28 mL de KOH 1N. Quente a 65 ° C para dissolver o paraformaldeído e depois armazenar no gelo. </li><li> Fixador 1. Prepare uma nova solução de 0,5 ml de PBS 10X, 50μl Triton X-100, 3,45 ml dH 2 O e 1,0 ml de um estoque de formaldeído 5X. Quente para dispersar o Triton X-100 e usar dentro de 1 hora. </li><li> Fixador 2. Prepare uma nova solução de 1,5 ml dH 2 O, 2,5 ml de ácido acético glacial, e 1,0 ml de um estoque de formaldeído 5X e usar dentro de 1 hora. </li><li> Solução de ácido Lactoacetic. Prepare uma solução de 1 ml de ácido lático, 2 ml dH 2 O, e 3 ml de ácido acético. </li></ol> 4. Politênicos preparação de squash cromossomo: <ol><li> Enxágüe com água e larvas de transferência para PBS em um prato de cultura de tecidos para dissecção. </li><li> Segure a ponta da boca ganchos com um par de pinças, segurar o corpo cerca de 2 / 3 do caminho para baixo com o outro par, e puxar a boca ganchos para as glândulas salivares são expostas. Separe as glândulas salivares do cérebro e olho-antenais discos, e dissecar afastado a gordura corporal e quaisquer outros tecidos associados das glândulas. </li><li> Adicione 200 microlitros de Fixação 1 para o primeiro poço de uma lâmina de depressão duas bem e 200-300 microlitros de 2 de Fixação para o bem dois. Transferência de um par de glândulas salivares em um momento de um fixador em um bem e incubar para a quantidade de tempo necessário para o epítopo alvo, geralmente cerca de 1-2 minutos. (Nota: alguns epítopos, como para a maioria das modificações das histonas, pode exigir 5 minutos ou mais fixação.) </li><li> Forceps utilizando transferência de as glândulas salivares a 2 de Fixação em dois bem e incubar por dois minutos. </li><li> Transferência das glândulas para 10-30 ml de solução de ácido Lactoacetic em uma lamela limpa Sigmacoted. Suavemente inferior uma lâmina de microscópio polilisina revestido para a lamela e, sem aplicar pressão vertical, pegar a lamela para as glândulas são entre a lâmina ea lamela. Imediatamente facilitar a lise celular e cromossômica espalhando com cuidado segurando a lamela com uma pinça em uma extremidade e suavemente movendo-a ligeiramente para trás e para frente, tentando minimizar qualquer pressão vertical sobre o tecido. Como alternativa, use o lado da borracha de um lápis ou até mesmo um dedo para mover suavemente a lamínula e para trás. Note que qualquer atraso no movimento a lamela trás e para frente tende a diminuir se espalhando dos braços cromossômicos como eles tendem a tornar-se mais rígida em cima da exposição à solução de ácido Lactoacetic. Turvação da solução é muitas vezes uma boa indicação de separação de células. Batendo a lamela obliquamente (para evitar a pressão vertical) com o lado da borracha de um lápis, algumas vezes também pode ajudar na divulgação cromossômicas. </li><li> Examinar imediatamente o tecido ao microscópio de contraste de fase com um objectivo de 20 ou 40X para determinar se os cromossomos são bem distribuídos. </li><li> Quando o cromossômicas espalhando é suficiente, configure o slide com o lado da lamínula para baixo em uma pilha de limpeza Kim-wipes. Coloque um segundo Kim-limpe em cima e alise cromossomos, colocando o polegar sobre onde as lamelas é posicionado e pressionando firmemente, evitando qualquer movimento horizontal da lamela que cisalhamentoos cromossomos. </li><li> Examine o slide novamente sob o microscópio para determinar se a preparação é adequada para a finalidade pretendida. Se os cromossomos se mudaram significativamente após esmagamento, use menos volume de solução de ácido Lactoacetic em suas preparações subseqüentes. Repita os passos 4,1-4,8 até que um número suficiente de slides adequados foram obtidos. Coloque 175 g pesos sobre as lamelas das lâminas. </li><li> Preencher um pequeno Dewar (por exemplo, garrafa térmica) com nitrogênio líquido. Usando uma pinça longa, mergulhe em líquido deslize N 2 até o pára ferver, retire slide, e imediatamente usar a borda de uma lâmina de barbear limpa em um canto para virar fora da lamela. Se deslize será usado imediatamente, colocar em uma jarra Coplin com PBS a 4 ° C. De outra forma coletar o slide em uma jarra Coplin cheia de etanol a 95%. Examine a lamela uma vez que a geada tenha sublimado longe para confirmar que o tecido aderido ao slide e não permanecer com a lamela. Repita com o restante dos slides até que todos os slides são armazenados em um PBS (para uso dentro de algumas horas) ou etanol (para armazenamento a longo prazo). </li></ol> Resultados representante O primeiro passo crítico para a obtenção de alta qualidade, preparação de squash politênicos é crescer larvas de gordura com núcleos das glândulas salivares grande. A segunda é uma boa técnica com o procedimento se espalhando, o que pode levar um pouco de prática. Uma dica para o sucesso espalhar melhor é encontrar o volume mínimo de solução de ácido lactoacetic durante a etapa de esmagamento. Isto irá promover a divulgação suficiente dos cromossomos sem gerar excesso de forças de fluxo que pode lavar os braços do cromossomo distância. Também é importante notar que qualquer atraso no movimento a lamela frente e para trás irá reduzir espalhando dos braços cromossômicos como eles se tornam mais rígida quando exposta à solução de ácido Lactoacetic. Se tudo correr bem, deve haver numerosos bem distribuídos cromossomos politênicos. A Figura 1 mostra um exemplo de uma tal preparação, duplamente marcada com um marcador para regiões interband em verde e com um corante que as manchas nas regiões em faixas em azul. Se espalhando insuficiente é obtido, os cromossomos se parecerá com pequenas bolas, como mostrado na Figura 2. Por outro lado, se espalhando muito ocorreu, o chomosomes vai ser muito fino e prolongado ou em alguns casos, fragmentado em pequenos pedaços, como mostrado na Figura 3. <img src="/files/ftp_upload/1748/1748fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Preparação de squash politênicos duplamente marcada com o anticorpo para o JIL-1 histona H3S10 quinase (em vermelho) e Hoechst (azul). <img src="/files/ftp_upload/1748/1748fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Politênicos de squash com espalhando insuficiente. <img src="/files/ftp_upload/1748/1748fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Politênicos de squash com muita divulgação.

<ol><li>Cai, W., Bao, X., Deng, H., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+II-mediated+transcription+at+active+loci+does+not+require+histone+H3S10+phosphorylation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase II-mediated transcription at active loci does not require histone H3S10 phosphorylation in Drosophila.</a> Development. 135, 2917-2925 (2008).</li>
<li>DiMario, P., Rosby, R., Cui, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+GFP-fusion+proteins+on+polytene+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Dros.+Inf.+Serv%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of GFP-fusion proteins on polytene chromosomes.</a> Dros. Inf. Serv. 89, 115-118 (2006).</li>
<li>Johansen, K. M., Cai, W., Deng, H., Bao, X., Zhang, W., Girton, J., Johansen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+transcription+and+epigenetic+chromatin+modification+in+Drosophila+polytene+chromosome+squash+preparations+using+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for studying transcription and epigenetic chromatin modification in Drosophila polytene chromosome squash preparations using antibodies.</a> Methods. 48, 387-397 (2009).</li>
</ol>

A inclusão de ácido acético e láctico em protocolos convencionais de fixação de squash facilita tanto a resolução interband e braço cromossômico de propagação mas infelizmente alguns epítopos não sobrevivem este tratamento. Um exemplo de tal é um epítopo H3S10ph (Cai et al., 2008). Uma vez que o tratamento com ácido também tem a desvantagem de que sacia a fluorescência inerente de proteínas GFP, DiMario et al. (2006) desenvolveu recentemente um formaldeído-based &quot;técnica de squash acid-free&quot; ...

preparação de abóboras drosophila cromossomos politênicos para rotulagem de anticorpos

Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

Drosophila tem sido um modelo de sistema favorito para estudar a relação entre estrutura da cromatina e regulação de genes devido às vantagens citológicos fornecidos pela gigante cromossomos politênicos da glândula salivar de larvas de terceiro ínstar. Neste tecido dos cromossomos passar por muitos ciclos de replicação, na ausência de divisão celular dando origem a cerca de 1000 cópias. O DNA permanece alinhada após cada ciclo replicativo, resultando em cromossomos muito alargada que fornecem uma oportunidade única para correlacionar a morfologia da cromatina com a localização de proteínas específicas. Conseqüentemente, tem havido um alto nível de interesse na definição das modificações epigenéticas presente em genes diferentes e em diferentes estágios do processo de transcrição. Uma ferramenta importante para esses estudos é a rotulagem dos cromossomos politênicos com anticorpos para a enzima, fator de transcrição, ou modificação das histonas de interesse. Este protocolo de vídeo ilustra a técnica de squash usado no laboratório de Johansen para preparar cromossomos politênicos de Drosophila para a rotulagem de anticorpos.

Este protocolo de vídeo ilustra a técnica de squash usado em laboratório para preparar Johansen<em&gt; Drosophila</em&gt; Cromossomos politênicos para a rotulagem de anticorpos.

Preparação de Abóboras Drosophila cromossomos politênicos para Rotulagem de anticorpos

A Drosophila tem sido, há muito tempo, um sistema modelo preferido para estudar a relação entre a estrutura da cromatina e a regulação gênica devido à citologia...

Este procedimento começa com o cultivo de larvas de terceiro estágio de drosófila em garrafas para moscas. Utilizando dois pares de pinças, as glândulas salivares são dissecadas a partir das larvas. Em seguida, as glândulas salivares são fixadas com sucesso em dois fixadores diferentes em um lâmina com duas cavidades.Por fim, as glândulas são esmagadas em uma solução de ácido lático acético entre uma lamínula e uma lâmina de microscópio. Olá, sou a Dra. Kristen Johansen do Departamento de Bioquímica, Biofísica e Biologia Molecular da Universidade Estadual de Iowa. Olá, sou estudante de pós-graduação assistente de ensino no laboratório da Johansen.Hoje vamos mostrar um procedimento para preparar esmagamentos de cromossomos politênicos de drosófila adequados para marcação com anticorpos. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar modificações epigenéticas do tipo histona e sua relação com a estrutura da cromatina e a expressão gênica. Então, vamos começar.Para obter cromossomos politênicos ideais para preparações de esmagamento de alta qualidade, condições de cultivo não superlotadas são essenciais. Coloque cerca de 20 moscas fêmeas ponedoras em um frasco padrão de quatro polegadas e transfira-as para um frasco novo a cada dia. O cultivo a 21 graus Celsius é adequado para a maioria dos propósitos, mas a incubação a 18 graus Celsius produzirá cromossomos mais grossos, que podem ser mais adequados para alguns experimentos, como quando regiões interbanda proibidas precisam ser visualizadas em alta resolução.Selecione os indivíduos mais gordos da primeira colheita de larvas de terceiro estágio que sobem pela garrafa. Enquanto ainda estiverem se deslocando, mas logo antes da pupação, as larvas são facilmente visíveis na parede da garrafa, acima do meio de cultura. Utilize pinças para colocar as larvas em uma placa de cultura de tecidos.Para cada rodada de esmagamento, lave dois a três larvas juntos com água antes de transferi-los para um recipiente limpo contendo PBS para dissecação. O PBS deve cobrir os larvas, mas o tempo não é essencial. Como os larvas podem sobreviver por horas nessas condições, coloque o recipiente com os larvas em PBS sobre a platina de um microscópio estereoscópico com um par de pinças.Segure a ponta dos ganchos bucais enquanto segura o corpo. Aproximadamente a dois terços do caminho, com um segundo par, puxe os ganchos bucais com a pinça para expor as glândulas salivares. Separe as glândulas salivares do cérebro, dos olhos e dos discos tenais e dissecque o corpo gorduroso e quaisquer outros tecidos associados.Adicione 200 microlitros do fixador um ao primeiro poço de uma lâmina com dois poços e de 200 a 300 microlitros do fixador. Dois ao poço dois. Transfira um par de glândulas salivares por vez para o fixador um no poço um e incube pelo tempo necessário para o epítopo-alvo, geralmente cerca de um a dois minutos, usando pinça.Transfira as glândulas salivares para fixá-las por dois, bem dois, e incube por dois minutos. Usando pinça, transfira as glândulas para uma lamínula limpa revestida com sigma, contendo 10 a 30 microlitros de solução fresca de ácido lático-acético. Abaixe suavemente uma lâmina de microscópio revestida com polilisina sobre a lamínula.Levante cuidadosamente a lâmina utilizando a adesão do líquido ao vidro para pegar o lamínula sem aplicar pressão vertical. Na preparação, espalhe imediatamente os cromossomos e segure com pinça a borda do lamínula, movendo-o suavemente para frente e para trás. Novamente, minimizando a pressão vertical sobre o tecido, o movimento oscilante do lamínula é importante para separar adequadamente as células individuais da glândula salivar.Bater suavemente no lamínula obliquamente com o lado da borracha de um lápis também pode auxiliar na disseminação; a turvação da solução é frequentemente um bom indicativo de separação celular. Examine imediatamente o tecido ao microscópio de contraste de fase para verificar se os cromossomos estão bem espalhados, conforme indicado por braços cromossômicos claramente separados e estendidos. Se os cromossomos não parecerem bem espalhados na primeira vez.É possível repetir a leve batida na lamínula até que se obtenha uma espalhamento suficiente. Coloque a lâmina com a lamínula voltada para baixo sobre uma pilha de lenços Kim limpos. Coloque um lenço limpo sobre a preparação.Cubra a posição do lamínula com o polegar e pressione firmemente para baixo. Evite movimentos horizontais, que poderiam cisalhar os cromossomos. Reexamine o lâmina ao microscópio para determinar sua adequação para o experimento em curso.Repita a dissecação e o preparo do esmagamento cromossômico para obter um número suficiente de lâminas. Coloque um peso de 175 gramas sobre a lamínula das lâminas utilizando pinças longas. Mergulhe uma lâmina preparada em um pequeno recipiente com nitrogênio líquido e mantenha-a ali até que a ebulição cesse.Remova a lâmina e use imediatamente a borda de uma lâmina de barbear limpa sob o canto da lamínula para virá-la. Colete a lâmina em um frasco coplan contendo PBS frio para uso imediato, ou contendo etanol 95% para armazenamento prolongado. Assim que a geada tiver sublimado, examine a lamínula para confirmar que o tecido permaneceu com a lâmina.O primeiro passo crítico para obter um bom preparo de esmagamento de INE é cultivar larvas gordas com núcleos grandes nas glândulas salivares. O segundo é dominar bem a técnica do procedimento de espalhamento, o que pode exigir alguma prática. Uma dica para melhorar o sucesso do espalhamento é determinar o volume mínimo da solução de ácido lático acético durante a etapa de esmagamento.Isso promoverá uma espalhamento suficiente dos cromossomos sem gerar forças de fluxo excessivas que podem arrastar os braços cromossômicos. Também vale a pena observar que qualquer atraso ao mover a lamínula para frente e para trás reduzirá o espalhamento dos braços cromossômicos, pois eles se tornam mais rígidos ao serem expostos à solução de ácido lático acético. Se tudo correr bem em cada lâmina, deve haver numerosos cromossomos politênicos bem espalhados.Aqui mostramos um exemplo de tal preparação duplamente marcada com um marcador para regiões interbanda em vermelho e com um corante que cora as regiões em banda em azul. Se a espalhamento for insuficiente, os cromossomos terão aparência de pequenas bolas, como mostrado aqui. Por outro lado, se ocorrer espalhamento excessivo, os cromossomos ficarão muito finos e alongados ou, em alguns casos, fragmentados em pequenos pedaços, como mostrado aqui.Então, acabamos de mostrar como preparar esmagamentos de cromossomos de politémio de drosófila. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de começar com larvas gordas. É isso aí.Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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