Christopher Hughes: Um modelo in vitro para o Estudo da angiogênese (Entrevista)

Olá, meu nome é Dr.Christopher Hughes. Sou professor da Universidade da Califórnia em Irvine e meu laboratório trabalha com angiogênese. E estamos particularmente interessados nos genes que regulam o processo de angiogênese.

Otimizamos um ensaio in vitro com base no trabalho de Nelson e, neste ensaio, podemos observar todos os diferentes processos que estão ocorrendo durante a angiogênese, revestimos contas de tedex, pequenas esferas com células endoteliais. Em seguida, incorporamos estes em géis de fibrina. Nós fornecemos fatores de crescimento.

E ao longo de vários dias, as células endoteliais brotam das contas. Eles migram, se alinham, proliferam, fazem tubos, se ramificam e formam anastomoses. De modo que em cerca de 10 dias temos um capilar completo como Rede em cultura.

Bem, alguns dos problemas com ensaios de envivo e angiogênese, por exemplo, aqueles que são feitos em camundongos é que é muito, não é muito fácil manipular o sistema. É difícil visualizar quando você tem isso acontecendo dentro de um animal, você, você não pode realmente ver a angiogênese acontecendo. E se você quiser manipular o sistema em nossas culturas in vitro, é muito fácil manipular geneticamente as células endoteliais, ativar e desativar os genes e observar os efeitos disso na angiogênese germinada.

E é muito mais difícil fazer isso em todo o animal. Você tem que fazer nocautes ou knockins. Então, essas são as duas principais vantagens.

É, é fácil de manipular E é fácil de visualizar. Assim, ao longo dos anos, vários ensaios de agenesia in vitro foram desenvolvidos e todos eles têm suas vantagens e desvantagens. E, em particular, um bem conhecido é o ensaio de gel de matriz, onde as células endoteliais são colocadas no topo dessa matriz extracelular chamada matrigel.

E o problema é que as células endoteliais formam estruturas semelhantes a cordões, mas nunca fazem vasos aluminizados adequados. Você não vê brotando, você não vê anastomose. Existem modelos de gel de colágeno, que podem ser bons.

Existem muitos daqueles Você não vê proliferação das células endoteliais. Você não tende a ver anastomose. O ensaio de gel de fibrina que desenvolvemos é baseado em um modelo de Nelson Kar publicado em meados dos anos noventa.

E agora melhoramos drasticamente isso de modo que podemos ver todos os estágios da angiogênese. Podemos assistir ao brotamento inicial, à migração. Vemos proliferação de células, vemos formação de lúmen, temos ramificações e, finalmente, anastomoses para formar uma rede vascular completa in vitro.

Portanto, este ensaio realmente é, acreditamos que o melhor sistema in vitro que existe, se você quiser observar todos esses diferentes estágios da angiogênese. Outra vantagem que temos com este ensaio in vitro é que podemos fazer captura a laser, microdissecação, podemos girar a cultura para que ela fique muito plana e, em seguida, usar o microscópio de microdissecção de captura a laser. Na verdade, podemos retirar células individuais e, em particular, estamos interessados nas células da ponta.

E então estamos cortando isso e podemos olhar para a expressão gênica, particularmente nas células da ponta versus as células do tronco, as células que estão realmente produzindo o lúmen. E nossa hipótese é que haverá expressão gênica diferencial entre essas duas populações de células. Podemos olhar para isso, seria praticamente impossível fazer isso em um sistema in vivo.

Portanto, achamos que essa é outra grande vantagem de usar este ensaio in vitro. O trabalho inicial que foi feito nisso, como mencionei por Nelson Recon, eles usaram células endoteliais microvasculares. E há muito pensamento de que as células endoteliais microvasculares, as células que você gostaria de usar para um ensaio como este, porque in vivo, é o EC microvascular que está realmente formando novos vasos.

Decidimos tentar fazer isso com ve. Estas são células endoteliais da veia umbilical humana por alguns motivos. Uma delas é que essas células são muito fáceis de obter.

Você pode ir ao hospital, obter cordões umbilicais nas salas de parto e isolar as células com muita facilidade. E também essas células têm sido usadas em cultura por muitos anos. Eles são muito bem caracterizados.

E então montamos esse ensaio e o otimizamos para que pudéssemos usar essas células por esses motivos. E, curiosamente, verifica-se que vex, essas células endoteliais de grandes vasos parecem assumir a forma de células endoteliais microvasculares e cultura. Eles perdem muitos genes que normalmente são expressos por grandes vasos ec e começam a expressar genes que normalmente estão associados a células endoteliais microvasculares.

E eles são perfeitamente capazes de formar brotos capilares, de fazer lúmens e fazer o que todo o mundo parece ser verdadeiros capilares na cultura. Portanto, eles são fáceis de usar, são fáceis de usar e fazem o que queremos que eles façam. Eles brotam e fazem vasos aluminizados adequados.

Quando queremos quantificar este ensaio, existem realmente algumas maneiras que podemos seguir. Podemos olhar para critérios realmente quantitativos, como o número de brotos, o comprimento dos brotos, o diâmetro dos brotos, o número de pontos de ramificação, o número de anastomoses, mas também olhamos para critérios qualitativos. E então podemos ver se eles estão formando lúmens?

E isso é provavelmente o que mais nos interessa. Em muitos dos ensaios que fazemos é a formação adequada do lúmen. E isso é realmente mais uma avaliação qualitativa, embora à medida que os vasos ficam maiores, pode-se realmente medir o diâmetro desses lúmens também.

Então, usamos fibroblastos nessas culturas. Incorporamos as contas no gel de fibrina e colocamos fibroblastos em cima do gel. Os fibroblastos são absolutamente essenciais para a germinação adequada e a formação do lúmen.

Na ausência de fibroblastos, temos alguns brotos. No entanto, as células endoteliais tendem a não ficar ligadas umas às outras. O que acontece é que eles migram para longe um do outro.

E então qualquer estrutura que você está desenvolvendo neste broto tende a desmoronar. E depois de alguns dias, as células endoteliais sofrem apoptose. Portanto, parece que os fibroblastos estão produzindo fatores essenciais para a angiogênese, pelo menos neste sistema in vitro.

E estamos muito interessados em saber quais são esses fatores. O que descobrimos é que os fibroblastos secretam algo no meio, então podemos tirar o meio de condição dos fibroblastos e isso apoiará o brotamento adequado e a formação do lúmen. Então, estamos definitivamente lidando com um fator solúvel.

Então, obviamente, estamos muito interessados em saber o que os fibroblastos estão fazendo que é tão importante para a angiogênese neste sistema. Tentamos todos os suspeitos usuais, VEGF, fg F básico são, estão na cultura, adicionar mais não substitui os fibroblastos. Também tentamos angiopoietina, TGF beta, H, GF, etc., etc.

Até agora não encontramos o fator vital. Então, o que estamos fazendo agora é purificar os fatores do meio de condição dos fibroblastos. Então, estamos colocando a condição média sobre várias colunas, cátion, troca, exclusão de tamanho, e estamos obtendo frações disso que têm atividade.

E agora estamos seguindo essa atividade e pegando essas frações, descobrindo quais estão ativas e, a partir daí, podemos executá-las em géis, garantir que tenhamos apenas um número relativamente pequeno de bandas no gel e, em seguida, podemos cortá-las e sequenciá-las por especificação de massa. E, e isso está nos dando muitos dias interessantes. Temos alguns genes candidatos agora que estamos testando individualmente para ver se eles são realmente o fator que somos, que estamos procurando.

Portanto, testamos muitos fatores angiogênicos conhecidos e sabemos que o GF veg e o FGF básico são realmente essenciais para o brotamento adequado neste ensaio. Mas eles não são toda a história. Existem fatores derivados que são importantes, pois, como mencionei, e uma maneira de analisarmos isso é pegar células tumorais, que são altamente angiogênicas in vivo, geram grandes tumores em camundongos e são altamente vascularizadas.

E nós olhamos para essas células tumorais e elas expressam níveis muito altos de vegf e nós as colocamos em nossas culturas. Portanto, substituímos os fibroblastos por essas células tumorais e elas não suportam angiogênese robusta neste ensaio. E isso, isso é muito interessante.

O que isso sugere é, e isso foi sugerido por outras pessoas também, é que há uma conversa cruzada entre o tumor, o estroma S, que são os fibroblastos e outras células de suporte no tecido e as células endoteliais. E pode muito bem ser que as células tumorais produzam alguns fatores que atuam diretamente nas células endoteliais, mas também produzem outros que estimulam os fibroblastos e outras células estromais a produzir fatores que também suportam a angiogênese robusta.