Um método melhorado de isolamento de RNA Pine Loblolly ( P. taeda L.) e espécies de coníferas Outros

O seguinte foi produzido por pesquisadores da Universidade da Geórgia e da Escola Warnell de Silvicultura e Recursos Naturais. Este vídeo demonstrativo descreve a coleta de tecidos xilemáticos e floemáticos e o subsequente isolamento de RNA de Pinus taeda, comumente conhecido como pinheiro-loblolly, que é a espécie de conífera mais importante para a produção de produtos florestais nos Estados Unidos. Após a derrubada da árvore, neste caso uma árvore de 40 anos, o tronco principal é cortado em toras com aproximadamente 50 centímetros de comprimento.

O torrão é então marcado longitudinalmente em vários pontos com a motosserra para facilitar a remoção da casca. Usando um martelo e um formão de madeira, levanta-se a casca até que possa ser descascada em seções. Em seguida, o tecido vascular é removido manualmente, separado do interior das seções de casca e imerso imediatamente em nitrogênio líquido.

Uma vez que a casca tenha sido removida, a fina camada de xilema secundário pode ser coletada raspando a superfície do lenho com uma lâmina de barbear de corte único. O tecido xilemático aquoso é imediatamente colocado em nitrogênio líquido. Nessa coleta, também reunimos amostras de madeira de reação, comumente denominadas madeira de compressão e madeira oposta, antes de cortar os ramos do tronco principal.

A orientação do ramo é primeiramente marcada com tinta spray para que as áreas contendo os dois tipos de tecido — lenho oposto na parte superior do ramo e lenho de compressão na parte inferior — possam ser determinadas. Durante a remoção da casca, os ramos são inicialmente entalhados com uma motosserra ao longo de linhas que delimitam o lenho de compressão e o lenho oposto, e a remoção da casca é realizada como nos toros do tronco principal, exceto que somente a casca da região correspondente ao tipo de reação é removida.

A madeira colhida é removida a qualquer momento. Geralmente, é mais difícil remover grandes seções de casca desses ramos menores. As amostras de madeira de reação do xilema secundário são coletadas da mesma maneira que o xilema secundário normal, raspando com a lâmina de barbear e imersão imediata em nitrogênio líquido.

Observe a coloração marrom avermelhada característica da madeira de compressão. É importante mencionar que coletar e processar múltiplas amostras de uma árvore grande exige várias pessoas, com cada indivíduo realizando uma tarefa designada, de modo que todos os tipos de tecido sejam coletados simultaneamente para ajudar a reduzir a degradação do RNA; as amostras congeladas e o nitrogênio líquido são posteriormente transferidos para sacos de armazenamento rotulados e colocados sobre gelo seco para transporte de volta ao laboratório. Nosso primeiro passo é pulverizar o tecido utilizando um moinho criogênico modelo 6850 da Specs; em comparação com a moagem usando almofariz e pistilo, este passo aumenta significativamente os rendimentos de extração de RNA em amostras de tecido lenhoso, mantendo as amostras frias com nitrogênio líquido.

O tecido é inicialmente cortado em pedaços menores manualmente e colocado na câmara da amostra. A câmara é inserida no porta-amostras e fixada no lugar, e a amostra é moída por dois minutos. O produto final tem a consistência de um pó grosso.

O protocolo de extração de RNA é um processo de dois dias. No primeiro dia, 2,5 gramas de tecido congelado são adicionadas ao tampão de extração de RNA que foi aquecido a 65 graus Celsius. A amostra é agitada vigorosamente para homogeneizar, e um volume igual de clorofórmio é adicionado e a amostra é novamente misturada com inversão suave.

A seguir, a amostra é colocada em uma roda rotativa durante cinco minutos. Em seguida, a amostra é transferida para tubos Teflon Oakridge de alta velocidade e centrifugada em um rotor SS 34 a 12.000 RPM por cinco minutos. A fração aquosa superior é extraída para um tubo novo e é adicionado um volume equivalente à metade de clorofórmio.

A amostra é vortexada por um minuto e novamente colocada em uma roda rotativa por cinco minutos. Após uma segunda centrifugação, a fração aquosa é novamente extraída para um tubo de polipropileno de alta velocidade de 50 ml e centrifugada a 10.000 RPM por 20 minutos. Para remover quaisquer resíduos de partículas, a amostra é decantada para um tubo Falcon de 50 ml e um quarto do volume de cloreto de lítio 10 molar é adicionado à amostra.

A amostra é misturada por agitação e colocada a quatro graus Celsius durante a noite. No segundo dia, a amostra precipitada com cloreto de lítio é primeiramente centrifugada a 11.000 RPM por 30 minutos a quatro graus Celsius.

O sobrenadante é derramado e descartado, e os tubos são invertidos sobre lenços químicos por um minuto. Para remover qualquer líquido em excesso, o pellet de RNA, que deve ser visível, é ressuspenso em 800 microlitros de tampão SSTE quente previamente aquecido a 65 graus Celsius. Certifique-se de pipetar para cima e para baixo várias vezes e ao redor de todas as bordas do pellet para garantir que todo o material seja completamente solubilizado.

Em seguida, transfira o RNA re-suspenso para um tubo microcêntrifuga livre de RNase de dois mil e além. Incube a amostra por um a dois minutos em banho-maria a 65 graus Celsius, seguido de vortexagem para garantir que a amostra seja completamente re-suspensa. Este procedimento pode ser repetido, se necessário.

Agora, adicione um volume igual de fenol clorofórmico tamponado. Agite a amostra em vórtex por 15 a 20 segundos e centrifugue a 14.000 rpm por três minutos. A fração aquosa é extraída para um novo tubo de microcentrífuga e um volume igual de isopropanol é adicionado.

A amostra é vortexada e microfundiada como na extração anterior. Para a fase final de extração orgânica, os tubos com gel são primeiro microfundiados a 11.000 RPM por dois minutos.

Em seguida, a amostra de RNA da extração anterior é adicionada ao gel de bloqueio de fase, seguida por um volume igual à metade de clorofórmio, e os dois são misturados pipetando suavemente. A amostra é então centrifugada a 11.000 RPM por cinco minutos, e a amostra aquosa de RNA é transferida para um novo tubo microcêntrifugo Ambion livre de RNA. O próximo passo é uma simples precipitação de RNA pela adição de um volume equivalente a um décimo de acetato de sódio 3 M, pH 4,8, e dois volumes de etanol a 100%.

A amostra é vortexeada, colocada brevemente em um congelador a menos 80 graus Celsius por 30 minutos e, em seguida, centrifugada em microcentrífuga por 30 minutos a quatro graus Celsius. O sobrenadante é cuidadosamente aspirado e o pequeno pellet branco é lavado com um mililitro de etanol a 70% gelado, aspirado, e a lavagem com etanol é repetida após a aspiração final. O etanol residual é deixado evaporar deixando os tubos abertos sobre a bancada por cinco minutos.

Os pellets de RNA são ressuspendidos em 100 microlitros de água com DEPC e ressuspendidos por vortexamento e aquecimento a 65 graus. Isso pode ser repetido, se necessário. A concentração da amostra é determinada.

Os índices espectrofotométricos 260/280 e 260/230 são calculados para estimar o grau de contaminação por proteínas e carboidratos na amostra. A eletroforese em gel de AGROS 1% é utilizada para estimar qualitativamente a qualidade da amostra, contaminação por DNA genômico e degradação de RNA. A integridade de amostras críticas é avaliada adicionalmente utilizando um bioanalisador Agilent 2100 para determinar as razões ribossomais 28S/18S e um número de integridade de RNA. Agradecemos por assistir ao nosso vídeo sobre a coleta de amostras de tecido e o isolamento de RNA total de pinheiro loblolly.

Os seguintes indivíduos são responsáveis pela filmagem e produção deste vídeo de treinamento.