Dissecção e Cultura de Neurônios da Medula Espinhal comissural embrionárias

Este vídeo demonstra um método para dissecar e cultivar neurônios motores comissurais da medula espinhal embrionária. O procedimento começa com a coleta de embriões de rato E13 e, em seguida, a dissecação das medulas espinhais. Durante a dissecação, as medulas espinhais são abertas ao longo da placa dorsal e preparadas na configuração de livro aberto.

Tiras de tecido dorsal são dissecadas e coletadas em um tubo. O tecido dorsal é dissociado em uma suspensão de células únicas por tripsina e disruptura mecânica. Em seguida, neurônios comissurais são cultivados em lamínulas de vidro revestidas com polilisina ou em placas de cultura de tecidos.

Eles podem então ser utilizados para estudar os mecanismos celulares e moleculares do crescimento e orientação de axônios. Olá, sou Sebastian do Laboratório de Biologia Molecular do Desenvolvimento Neural do Instituto de Pesquisa Clínica de Montreal. Olá, sou Steve Moen, também do Laboratório de Biologia Molecular do Desenvolvimento Neural.

Hoje vamos mostrar um procedimento para dissecar e cultivar neurônios comissurais da medula espinhal embrionária. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar os mecanismos celulares e moleculares da orientação axonal. Então, vamos começar.

Hoje, as medulas espinhais serão dissecadas de embriões de rato E 13 recém-coletados, colocados em uma placa contendo meio L 15 durante toda a dissecação. É importante manter os embriões e as soluções em gelo. Lembre-se de que, em todos os passos da dissecação, é fundamental não esticar a medula espinhal com pinça de níquel, pois isso pode dificultar o isolamento de uma medula espinhal completamente intacta.

Sob um microscópio estereoscópico, separe o embrião de todos os tecidos extraembrionários e membranas embrionárias. Em seguida, coloque um embrião no recipiente de dissecação. Utilize tesoura microcirúrgica para remover a cabeça e as partes posteriores dos ângulos mostrados aqui.

Isso criará uma superfície plana que ajudará a posicionar o embrião para facilitar o acesso à medula espinhal. Posicione o embrião com o lado ventral voltado para baixo e a extremidade anterior apontando para longe. Use uma pinça para prender firmemente o embrião em um dos lados.

Não aperte nem solte a pinça, ou o tecido se rasgará com o segundo par de pinças. Segure a pele ao lado da medula espinhal. Ajuste as pontas das pinças de fixação.

Retire a pele que recobre a região dorsal do embrião para expor a medula espinhal envolvida pelas meninges, com o objetivo de destacar parcialmente o tecido localizado à direita da medula espinhal. Utilize pinças fechadas para furar o tecido a partir do nível das pinças de fixação. Aproxime-se o máximo possível da medula espinhal sem tocá-la.

Repita várias vezes ao longo da medula espinhal. Isso fixará alguns gânglios da raiz dorsal e perturbará órgãos ventrais. Deixe algum tecido aderido nas extremidades anterior e posterior, começando pela extremidade anterior.

Use uma agulha de tungstênio em forma de gancho para cortar as meninges e abrir a medula espinhal ao longo da placa do teto. Gire o embrião 180 graus e rompa o tecido do lado restante. Utilizando o mesmo método.

Em seguida, solte completamente o tecido no lado esquerdo da medula espinhal, o lado que foi inicialmente lesionado anteriormente no lado direito; coloque a medula espinhal de lado e use pinças para remover a maior parte do tecido mesenquimal remanescente e os gânglios das raízes dorsais. Use pinças para destacar uma pequena aba das meninges. Neste ponto, as meninges e a medula espinhal formam duas camadas de tecido semelhantes a uma fatia de sanduíche.

Use a pinça para fixar a porção maior da medula espinhal na extremidade anterior. Segure os dois segmentos separados com a pinça e remova as meninges. Com um movimento suave e constante, a remoção irregular pode romper a camada das meninges e/ou a medula espinhal.

Se a camada de meninges se romper durante a tração, a porção da medula espinhal que permanece aderida às meninges geralmente é irrecuperável. Embora às vezes seja possível. Use um pipeta de plástico para transferir suavemente a medula espinhal isolada para uma placa contendo meio L 15 com 10% de soro de cavalo inativado pelo calor em gelo antes de processar mais embriões.

Lembre-se de trocar o meio no recipiente de dissecação por L-15 gelado para manter o embrião frio e ajudar a preservar a integridade do tecido. Colete os cordões espinhais de todos os embriões antes de prosseguir para as dissecações da porção dorsal da medula espinhal. Para iniciar a dissecação da medula dorsal, coloque um cordão espinhal recém-isolado em uma placa de Petri contendo L-15 com 10% de soro de cavalo aquecido e ativado.

Remova a porção anterior mais larga, que inclui parte do cérebro posterior. Em seguida, acomode a medula espinhal em uma superfície plana, abrindo-a como um livro. O tecido dorsal localiza-se nas partes mais laterais da medula espinhal aberta, enquanto fixa a medula com uma agulha reta de tungstênio, utilizando uma agulha de tungstênio em forma de L para cortar uma faixa com aproximadamente um quinto da largura de uma metade da medula espinhal; cortar faixas mais largas aumentará o rendimento, mas reduzirá a pureza da cultura.

Transfira várias tiras dorsais para um tubo cônico de 15 mililitros contendo meio L 15 com 10% de soro de cavalo e coloque o tubo sobre gelo. O restante do procedimento será realizado próximo ou dentro da cabine de cultura de tecidos. Para essas culturas, é importante preparar as soluções e o equipamento com antecedência, geralmente antes da dissecação.

O passo de tação utiliza tubos de vidro polidos ao fogo de dois tamanhos, um com diâmetro igual à metade do tamanho original e outro ligeiramente menor. Antes de iniciar, recubra os dois tubos polidos ao fogo com meio contendo soro, aspirando o meio para dentro dos tubos e deixando repousar por 30 segundos. Isso reduzirá o número de células que aderem ao vidro durante a tação.

Inicie verificando se as faixas dorsais assentaram no fundo do tubo. Sob capela de fluxo laminar, remova a maior parte do sobrenadante SUP com uma pipeta Pasteur. Lave rapidamente com três mililitros de HBSS frio sem magnésio e sem cálcio.

Deixe a faixa do tubo neural dorsal repousar por dois minutos. Em seguida, remova o HBSS com o espátula. Complete o volume até 4,7 mililitros.

Com HBSS morno, adicione 0,3 mililitros de tripsina a 2,5% para obter uma concentração final de 0,15% de Tryin e misture suavemente. Incube em banho-maria a 37 graus Celsius por sete minutos, misturando delicadamente uma vez, no meio do tempo de incubação. Ao final da incubation, adicione DNAse para uma concentração final de 150 unidades por mililitro e sulfato de magnésio para uma concentração final de 0,15%, e misture brevemente.

As seções do tubo neural dorsal devem estar fragmentadas agora. Centrifugue os fragmentos de tecido a 200 G durante quatro minutos. Remova o sobrenadante SUP com uma pipeta Pasteur, deixando cerca de 50 a 100 microlitros de líquido no fundo do tubo.

Bata suavemente no tubo para soltar o pellet. Em seguida, lave as células adicionando cinco mililitros de HBSS morno. Deixe as células sedimentarem à temperatura ambiente por dois minutos.

Centrifugue e lave as células novamente. Desta vez, re-suspenda em dois mililitros de HBSS morno. Use uma pipeta de vidro com ponta polida de diâmetro reduzido para triturar as células, pipetando lentamente para cima e para baixo quatro a seis vezes, direcionando o líquido contra a parede do tubo para quebrar aglomerados maiores e reduzir a morte celular.

Evite formar bolhas e não exagere. Use o menor vidro de pasta pirex polido a fogo para dissociar ainda mais as células, pipetando lentamente para cima e para baixo de três a quatro vezes da mesma maneira. Não é necessário dissociar todos os aglomerados celulares, pois agregados tendem a se formar a partir de células mortas em detritos.

Deixe os fragmentos de tecido sedimentarem por um minuto. Em seguida, remova 20 microlitros do sobrenadante SUP, que deverá conter as células suspensas para contagem em um hemocitômetro; os neurônios deverão apresentar viabilidade de pelo menos 95% pelo teste de exclusão de azul de tripano. Plaque os neurônios em meio de cultivo neurobasal em uma concentração apropriada para sua aplicação.

16 a 18 horas depois, troque o meio por meio de crescimento neural basal para evitar deslocamento. Os neurônios devem ter o meio removido suavemente com uma pipeta, em vez de aspirado com uma bomba de vácuo. Abaixo estão alguns resultados representativos de neurônios comissurais isolados cultivados em lamínulas de vidro revestidas com PLL; quatro horas após a semeadura, os neurônios aderiram à superfície, 30 horas após a semeadura.

A maioria dos neurônios possui axônios alongados com um cone de crescimento visível. Esses neurônios podem ser facilmente utilizados em experimentos de imunofluorescência. Neste exemplo, os microtúbulos são marcados em verde, o f actina em vermelho e o NA em azul.

Acabamos de mostrar como dissecar e cultivar neurônios comissurais de medulas espinhais embrionárias. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que a pureza dos neurônios comissurais depende da espessura da faixa dorsal que é dissecada. É isso aí.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.