Name: Dissecção e Cultura de Neurônios da Medula Espinhal comissural embrionárias (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-25T17:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 23 s
Description: Aprenda a dissecar e cultivar neurônios comissurais da medula espinal dorsal de embriões de rato E13. Este método permite estudar mecanismos celulares e moleculares do crescimento e orientação de axônios em neurociência.

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Este trabalho foi financiado por concessões do Canadian Institutes of Health Research (CIHR), o Peter Lougheed Medical Research Foundation, o Programa de McGill em Neuroengenharia, o Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ), ea Fundação Canadense para Inovação (CFI ). Sébastien D. Langlois foi apoiada pelo Prêmio de Mestre de Formação do Fonds de la Recherche en santé du Québec (FRSQ) e Frederick Banting por Charles e Prêmio de Melhor Canadá de Pós-Graduação Mestrado Bolsas de Estudo a partir do Canadian Institutes of Health Research (CIHR). Somos gratos a Jessica MT Pham de assistência com os números.

1. Dissecção da medula espinhal dorsal embrionárias de rato Recomendações gerais Mantenha L-15 médio no gelo e muitas vezes mudar o meio no prato dissecção para manter os embriões frescos. Isso ajuda a preservar a integridade dos tecidos. Todas as etapas são realizadas com duas pinças Dumont # 5 a menos que indicado. Para evitar a contaminação, spray todas as ferramentas e superfícies de trabalho com etanol 70% e manter a garrafa meio dissecção fechado. A transferência de embriões entre pratos, use uma pipeta de plástico recortado ou uma colher perfurada. É fundamental para não danificar a medula espinhal (nicking, alongamento) para completar com sucesso a dissecção. Preparação <ul><li> Frio L-15 de médio </li><li> 50 mL de L-15 + inativado pelo calor de 10% soro de cavalo (HiHS). Manter no gelo. </li></ul> Dissecção da medula espinhal <ol><li> Euthanize um E13 gravidez encenado rato (E0 = primeiro dia dia seguinte acasalamento) com uma câmara de CO 2 de acordo com as diretrizes institucionais. </li><li> Spray de etanol a 70% sobre o abdome. Beliscar e puxar para cima a pele da região abdominal inferior com uma pinça e cortado com tesoura cirúrgica. Repita a operação para cortar o músculo e as camadas peritoneal para alcançar a cavidade abdominal. Criar uma incisão em forma de V, cortando o tecido ao longo dos lados do abdômen, até o tórax. Levante e puxe o tecido para expor a cavidade abdominal. </li><li> O útero é anexado em três locais: no abdômen inferior central, e em ambos os cantos superior lateral. Levante o útero, agarrando no tecido entre sacos embrionárias. Corte o tecido conjuntivo para remover o útero e coloque em um prato de Petri cheia de L-15 no gelo. </li><li> Os próximos passos são feitos sob um microscópio de dissecação. Para separar um embrião a partir de tecidos extra-embrionário e as membranas embrionárias, pegue o tecido entre sacos uterina com um par de fórceps,. Com o outro par, aperte o lado mais transparente do saco para cortar através das membranas superficial (o lado mais escuro é a placenta). Esprema o embrião pressionando suavemente o lado placenta do saco. Remova todos os embriões e coloque em um prato de Petri cheia de L-15 no gelo. </li><li> Embrião único lugar a 10 centímetros prato cheio de Petri gelada L-15. Usando microtesoura, cortar a cabeça e partes posterior em ângulos mostrados na figura 1a. Corte nestes ângulos irá ajudar a posicionar o embrião quando colocado "face ventral para baixo". </li><li> Posição do embrião "face ventral para baixo" (anterior apontando para fora, posterior apontando para o experimentador) (fig. 1b). </li><li> Segure firmemente o embrião de um lado, usando a pinça para "fechar" o embrião (fig. 1c). Não mova a fórceps, uma vez que irá rasgar o tecido. Com o outro par de fórceps, retire a pele que cobre a parte traseira do embrião a partir da região entre a "holding" fórceps (fig 1d-e). Isto irá expor a medula espinhal que, neste momento, é envolto por membranas (as meninges). Agarre a pele dos lados em vez de acima da medula espinhal para evitar nicking da medula espinhal. </li><li> Parcialmente retirar o tecido para o lado direito da medula espinhal (fig. 1f). Começando ao nível do fórceps segurando, picar o tecido com uma pinça fechada, o mais próximo possível para a medula espinhal. Então, abra lentamente a pinça para rasgar o tecido. Isso deve retirar os gânglios da raiz dorsal (DRGs) da medula espinhal, e também deve atrapalhar os órgãos ventral. Deixe um pouco de tecido ligado nas extremidades anterior e posterior. Tecido Deixando anexado adiciona peso ao embrião, impedindo-o de ser puxado para cima durante a próxima etapa. Além disso, o tecido que é usado para segurar o embrião em etapas posteriores. </li><li> A partir do final anterior, use a agulha de tungstênio em forma de gancho para cortar as meninges e abra a medula espinhal ao longo do roofplate (fig. 1g). </li><li> Gire o embrião de 180 graus (posterior apontando para fora, apontando para o experimentador anterior) (fig. 1h). Isso permite que o pesquisador de utilizar a mesma mão para retirar o tecido do outro lado do embrião. </li><li> Segure o embrião agarrando-se ao lado anteriormente individual, e perturbar o tecido do lado restante usando o mesmo método (ver 1.8.). Quando terminar, retire completamente o tecido em ambos os lados da medula espinhal. Alternativa: separar completamente o tecido remanescente no lado esquerdo, mas deixar algum tecido em anexo no final anterior e posterior do lado direito. Isto às vezes pode ajudar a manter a coluna vertebral na posição no passo 1.12. </li><li> Coloque a medula espinhal do seu lado e remover a maioria do tecido remanescente mesenquimais e DRGs (fig. 1-I). </li><li> Nesta etapa, as meninges ea medula espinhal são duas "folhas" de tecido apposed para o outro. Pino para baixo o maior, porção ântero-a maior parte da medula espinhal, e descolar um pequeno segmento de meninges da cor da coluna vertebrald (fig. 1-J, à esquerda). Agora, segure os dois segmentos separados por agarrar todo com uma pinça, e descolar as meninges com um movimento suave e constante (fig. 1-J). Desigual "peeling" levará à ruptura da medula espinhal e / ou a camada de meninges. Geralmente não é possível recuperar a parte da medula espinhal ainda ligado ao meninges. </li><li> Usando uma pipeta, transferir o cabo isolado espinhal para uma placa de Petri contendo HiHS L-15 + 10% e deixar no gelo. Tipicamente, medula espinhal de todos os embriões são coletados antes de dissecar as porções dorsal. </li></ol> Dissecção medula espinhal dorsal <ol start="15"><li> Medula espinhal um lugar numa placa de Petri contendo L-15 HiHS +10%, deitado em um "livro aberto" de configuração. Cortar a maior parte, anterior (que inclui parte do cérebro posterior) (fig. 1k). </li><li> O tecido dorsal está localizado na parte mais lateral da medula espinhal (fig 1l, esquerda). Enquanto pinagem do cabo com uma agulha de tungstênio em linha reta, use a agulha de tungstênio em forma de L para cortar uma tira que é a largura 1/5th de metade da medula espinhal. (Fig. 1l, direita). Coloque as tiras dorsal em um tubo de plástico contendo 15 mL L-15 + HiHS 10% sobre o gelo. Dorsal seções do tubo neural de embriões E13 ~ 12 ~ renderá 3,5-4.000.000 células para revestimento após a dissociação. Mais células podem ser obtidas através da realização de uma dissecção grossa do cordão espinhal dorsal (corte mais largo tiras dorsal), mas a pureza de neurônios comissurais será reduzida. </li></ol> 2. Comissural cultura neurônio Recomendações gerais Todos os passos devem ser realizados em condições estéreis em uma capa de cultura de tecidos, salvo indicação contrária. Use meio fresco e suplementos recém-descongelado e reagentes. A dissociação e as etapas de trituração são realizados em Ca 2 + / Mg 2 + livre HBSS para minimizar Ca 2 + / Mg 2 + dependente de adesão. Preparação <ul><li> lamínulas revestido (uso de vidro Desag alemão) ou placas de cultura de tecidos (ver procedimento de revestimento abaixo). </li><li> quente Mídia Plating Neurobasal (veja abaixo), em pratos de cultura de tecidos e CO 2 equilibrado na cultura de tecidos incubadora de pelo menos 1,5 h antes do plaqueamento. </li><li> Tripsina 2,5% no banho-maria 37 ° C </li><li> 2 garrafas de HBSS Ca 2 + / Mg 2 + livre, um de 4 ° C, uma temperatura de 37 ° C. </li><li> dois-fogo de vidro polido pipetas Pasteur uma com um diâmetro de metade do tamanho normal, e um com um diâmetro ligeiramente menor que a metade. Use pipetas esterilizadas Pasteur. Ao fogo polonês as pipetas, use um bico de Bunsen (o topo da chama azul claro) para derreter a ponta para diminuir ligeiramente o diâmetro. Porque esta etapa é realizada fora do capô de cultura de tecido, spray as pipetas com etanol 70% antes de colocar sob o capô cultura de tecidos. Para uma recuperação mais eficiente dos neurônios, o revestimento do pipetas Pasteur com a mídia contendo soro antes do início da dissociação ou apenas antes da etapa de trituração (preencher pipetas com a mídia e manter por 30 segundos). Isso vai evitar que as células de degola para o interior da pipeta Pasteur durante a trituração. </li><li> água MilliQ estéril para lavar PLL revestido pratos ou lamelas </li><li> 12,5% MgSO 4 em solução HBSS </li></ul> Poli-L-lisina revestimento Se estiver usando lamínulas de vidro, ácido lavagem por 24 horas e esterilizar antes de chapeamento (ver Kaech e Banker, 2006). Use lamínulas de vidro alemão Desag. Para o revestimento de poli-L-lisina em lamínulas de vidro ou placas de cultura de tecido de plástico: <ul><li> sob uma capa de cultura de tecidos, cobrir superfícies com uma pequena cúpula de 100 ug / ml solução PLL para 1,75-2 horas. </li><li> lavar duas vezes com água MilliQ, pelo menos 5 minutos por lavagem (pode ser realizada durante a etapa de dissociação de células abaixo). </li><li> armazenamento em água até o uso. Não deixe que a superfície PLL revestido seco. Para reduzir o desperdício de PLL para o revestimento de lamelas, coloque as lamelas em estéril pratos bacteriana Petri. Brasão e lavar as lamelas, colocando uma cúpula de líquido no lamínulas. Os pratos bacteriana Petri são hidrofóbicos, de modo que o líquido deve permanecer no lamínulas de vidro. Transferir as lamelas para placas de cultura de tecidos logo antes do plaqueamento das células. Para os neurônios semeadas em placas de cultura de tecido de plástico, a adesão é normalmente mais elevada, alongamento, assim, neurite poderiam ser diminuídos. </li></ul> Dissociação e chapeamento <ol><li> Verifique se as tiras dorsal ter resolvido até o fundo do tubo. Remover a maioria dos HiHS L-15 +10% com uma pipeta Pasteur. Rapidamente lavar a dorsal tiras do tubo neural, uma vez adicionando 3 ml de frio (4 ° C) HBSS. </li><li> Deixe o dorsal tiras do tubo neural se contentar com dois minutos, depois remover o HBSS com uma pipeta Pasteur. </li><li> Adicionar quente (37 ° C) HBSS a um volume de 4,7 ml. Tgalinha adicionar 0,3 ml de tripsina 2,5% para dar uma concentração final de tripsina 0,15%. </li><li> Incubar a 37 ° C em banho-maria por 7 min. Misture delicadamente uma vez a meio da incubação. </li><li> Adicionar 30 mL DNAse (25 000 U / mL) para uma concentração final de 150 U / mL. Adicionar 60 mL de MgSO 4 e misture rapidamente, para uma concentração final de 0,15%. Para o tecido de dissecção grossa, incubar por um minuto extra de 1 a 37 ° C em banho-maria. Nesta fase, o dorsal seções de tubo neural devem ser fragmentado. Se o dorsal seções do tubo neural não ter começado a se fragmentar, isso normalmente significa que o estoque de tripsina 2,5% é velho, e novas ações devem ser descongeladas, ou a lavagem com HBSS frio não retirar o HiHS da amostra. </li><li> Centrifugar os fragmentos de tecido em 200 g por 4 min. </li><li> Remover o sobrenadante com uma pipeta Pasteur, deixando ~ 5-10 mL de líquido no fundo do tubo. </li><li> Flick suavemente o tubo para soltar a pelota, em seguida, lave as células, adicionando 5 ml de HBSS quente. Vamos resolver em temperatura ambiente por 2 min. </li><li> Centrifugar a 200 g por 5 min. </li><li> Remover o sobrenadante com uma pipeta Pasteur, deixando ~ 5-10 mL de líquido no fundo do tubo. </li><li> Flick suavemente o tubo para soltar a pelota e parcialmente ressuspender as células. Em seguida, adicione 2 ml de HBSS quente. </li><li> Use o pequeno (diâmetro meia)-fogo de vidro polido pipeta Pasteur para dissociar as células por pipetagem lentamente para cima e para baixo 4-6 vezes. Evitar fazer bolhas, e pipetar o líquido contra a parede do tubo. Não excesso de triturar. </li><li> Use o menor-fogo de vidro polido pipeta Pasteur para continuar a dissociar as células por pipetagem lentamente para cima e para baixo 3-4 vezes. Evitar fazer bolhas, e pipetar o líquido contra a parede do tubo. Não excesso de triturar. Para o tecido de dissecção grossa, adicionar um ml um extra de HBSS quente para o tubo no final da dissociação. Ao dissociar as células, não é necessário dissociar todos os aglomerados de células e agregados. Parar pipetando para cima e para baixo ou mudar para uma pipeta Pasteur com um diâmetro menor, se você não vê nenhuma redução ainda maior no tamanho dos agregados de células com mais de pipetagem. </li><li> Que qualquer fragmento de tecido restantes se estabelecer no tubo durante 1 min. Não é necessário transferir as células para um novo tubo. </li><li> Tome 20 l da suspensão celular e adicionar 5 mL de azul de tripano. Contagem de células em um hemocitómetro. Neurônios deve ser ≥ 95% viáveis ​​por exclusão do azul tripan. </li><li> Placa de neurônios no Media Plating Neurobasal (veja receitas abaixo). <ul><li> Sugeridos para a obtenção de densidades plating neurônios isolados (culturas de baixa densidade para evitar a aglomeração de neurônios ou sobrepostos uns aos outros): </li><li> 120 000 - 180 000 células / poço de uma placa de 6 bem </li><li> 60 000 - 75 000 células / poço de uma placa de 12 poços </li></ul></li><li> 16-18 horas mais tarde, mudar a mídia para mídia Crescimento Neurobasal (veja receitas abaixo) Não use uma bomba de vácuo para aspirar a mídia da placa de cultura quando se muda de mídia; delicadamente use uma pipeta. Isto evita o desprendimento de neurônios. </li></ol> Resultados representativos: Quatro horas após o plaqueamento, os neurônios devem ter aderido à poli-L-lisina (PLL) revestido de superfície. Sob iluminação de contraste de fase, corpos celulares aderidos são tipicamente relativamente plana e de formato oval (fig. 2a). Células que não têm bem aderidas aparecem como esferas que se movem levemente quando o prato é muito gentilmente bateu na lateral. Muitos fatores podem potencialmente impedir a adesão de células (ver discussão). Após 30 horas in vitro, a maioria dos neurônios estenderam um axônio com um cone de crescimento visível (fig. 2c, d). Se o crescimento axonal pobres é observado, verifique se o meio de crescimento Neurobasal foi feito com meio fresco e suplementos. Neurônios permanecem saudáveis ​​por pelo menos seis dias nestas condições. Este procedimento tem se mostrado confiável rendimento preparações altamente enriquecido em neurônios comissurais, com 90% de neurônios expressando DCC (Yam et al. 2009). A largura da faixa de medula espinhal dorsal que é usado para preparar a suspensão de células irá afetar a pureza da cultura, com maior pureza, quando tiras mais finas são utilizadas. Um exemplo de aplicação é mostrado na figura 3 (imunofluorescência). Ver o artigo de Yam et al. (2009) para mais exemplos. <img src="/files/ftp_upload/1773/1773fig1tmb.jpg" border="0" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Schematics de passos dissecção da medula espinhal. D = dorsais, V = Ventral. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1773/1773fig1.jpg">Clique aqui para ver uma figura maior.</a> <img src="/files/ftp_upload/1773/1773fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Resultado Representante da comissural isoladoneurônios semeadas em uma lamela de vidro PLL-revestido. a, b) 4 horas após o plaqueamento, os neurônios têm aderido à superfície. Bar = 20 mM. c, d) 30 horas após o plaqueamento, a maioria dos neurônios ter estendido um axônio com um cone de crescimento visível. Bar = 20 mM. <img src="/files/ftp_upload/1773/1773fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Um neurônio comissural histoquímica para gama-tubulina (verde), com F-actina marcados por phalloidin (F-actina, vermelho) eo núcleo por DAPI (azul). Receitas e comentários Neurobasal Mídia Plating <ul><li> Neurobasal </li><li> 10% inativadas pelo calor FBS (HiFBS) </li><li> 2 mM L-glutamina (de 200 mM solução estoque) Opcional: antibióticos penicilina / estreptomicina (use metade da concentração normal) </li></ul> Neurobasal Mídia Crescimento <ul><li> Neurobasal </li><li> B27 (1 / 50 de diluição do estoque) </li><li> 2 mM L-glutamina (de 200 mM solução estoque) </li><li> Opcional: antibióticos penicilina / estreptomicina (use metade da concentração normal) Uma vez que a mídia é feita, ela pode ser mantido a 4 ° C por duas semanas. Para equilibrar a temperatura eo pH dos meios de comunicação antes do plaqueamento das células, a mídia local em pratos de cultura de tecidos Petri e coloque em uma cultura de tecidos incubadora de pelo menos 1,5 horas. </li></ul> Neurobasal Depois de uma garrafa de meio Neurobasal foi aberto, ele pode ser mantido por um mês a 4 ° C no escuro. Dispor de Neurobasal que foi aberta há mais de um mês, a sobrevivência da célula será menor. Inativado pelo calor soro fetal bovino (HiFBS) ou soro de cavalo (HiHS) Para aquecer-inativar calor FBS ou HS, a 56 ° C em banho-maria por 30 minutos. Agitar o frasco aproximadamente a cada 10 minutos ou assim. (Para maior precisão utilizar um frasco de tamanho semelhante cheio de água. Coloque um termômetro na garrafa de água para ver quando 56 ° C seja atingida. Inicie o tempo neste momento.) Inativadas pelo calor FBS pode precisar de ser centrifugadas para eliminar precipitados e pode ser aliquotado e re-congeladas a -20 ° C. L-Glutamina Descongelar sempre uma nova porção da L-glutamina para cada experimento. B27 Alíquotas de B27 pode ser mantida a 20 ° C para o armazenamento a longo prazo, ou a 4 ° C por até um mês.

<ol><li>Charron, F., Stein, E., Jeong, J., McMahon, A. P., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+morphogen+sonic+hedgehog+is+an+axonal+chemoattractant+that+collaborates+with+netrin-1+in+midline+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance.</a> Cell. , 113-1111 (2003).</li>
<li>Fabre, P., Shimogori, T., Charron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segregation+of+ipsilateral+retinal+ganglion+cell+axons+at+the+optic+chiasm+requires+the+Shh+Receptor+Boc%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Segregation of ipsilateral retinal ganglion cell axons at the optic chiasm requires the Shh Receptor Boc.</a> Journal of Neuroscience. 30, 266-275 (2010).</li>
<li>Helms, A. W., Johnson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitors+of+dorsal+commissural+interneurons+are+defined+by+MATH1+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Progenitors of dorsal commissural interneurons are defined by MATH1 expression.</a> Development. 125, 919-928 (1998).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocols. 1, 2406-2415 (2006).</li>
<li>Okada, A., Charron, F., Morin, S., Shin, D. S., Wong, K., Fabre, P. J., Tessier-Lavigne, M., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boc+is+a+receptor+for+sonic+hedgehog+in+the+guidance+of+commissural+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Boc is a receptor for sonic hedgehog in the guidance of commissural axons.</a> Nature. 444, 369-373 (2006).</li>
<li>Yam, P. T., Langlois, S. D., Morin, S., Charron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+guides+axons+through+a+noncanonical%2C+Src-family-kinase-dependent+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog guides axons through a noncanonical, Src-family-kinase-dependent signaling pathway.</a> Neuron. 62, 349-362 (2009).</li>
</ol>

Nós descrevemos um método para dissecar e cultura neurônios comissurais do cordão espinhal de ratos embrionárias. Este procedimento tem sido utilizado rotineiramente em nosso laboratório para preparar os neurônios de forma confiável para estudar os mecanismos celulares e moleculares de orientação axônio. Para a biologia celular e experimentos imunoquímica, a dissecção de uma ninhada produz neurônios suficientes. Quando as células são mais necessários, como em muitos experimentos de bioquímica, dissecção de duas ninhadas...

Dissecção da medula espinhal dorsal embrionárias de rato (ver também Quadro I) <ul><li> E13 gravidez encenado rato </li><li> Etanol 70% </li><li> Tesoura cirúrgica, Ferramentas Ciência Belas </li><li> Fórceps, Dumont # 5, Ferramentas Ciência Belas </li><li> Placas de Petri </li><li> L-15 de médio </li><li> Microscópio de dissecção, Leica </li><li> Plástico pipetas de transferência </li><li> Microtesoura, Ferramentas Ciência Belas </li><li> Agulhas de tungstênio e retentores de pinos (uma agulha em forma de gancho, uma agulha L-formas, uma agulha), Ferramentas da Ciência Belas </li><li> Inativado pelo calor soro de cavalo (HiHS) </li><li> 15 ml de tubos de plástico </li></ul> Comissural neurônio cultura (ver também Quadro I) <ul><li> Tecido incubadoras cultura (37 ° C, umidade 5% CO 2, controlada) </li><li> Alemão Desag lamínulas de vidro e / ou placas de cultura de tecido de plástico </li><li> Poli-L-lisina, Sigma </li><li> Estéril MilliQ H 2 O </li><li> Neurobasal, Invitrogen </li><li> Inativado pelo calor soro fetal bovino (HiFBS) </li><li> L-Glutamina </li><li> B27, Invitrogen </li><li> Penicilina / estreptomicina antibióticos </li><li> Banho-maria 37 ° C </li><li> Pasteur estéril Pipettes </li><li> Bunsen queimador de gás </li><li> HBSS, Ca 2 + / Mg 2 + livre, Invitrogen </li><li> DNAse, Worthington </li><li> MgSO 4 </li><li> Centrifugador </li><li> Hemocitômetro </li><li> Solução Azul Trypan </li></ul>

dissecção e cultura de neurônios da medula espinhal comissural embrionárias

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Neurônios comissurais têm sido amplamente utilizados para investigar os mecanismos subjacentes a orientação dos axônios durante o desenvolvimento embrionário medula espinhal. Os corpos celulares desses neurônios estão localizados na medula espinhal dorsal e seus axônios seguem trajetórias estereotipados durante o desenvolvimento embrionário. Axônios comissurais inicialmente para o projeto ventralmente floorplate. Depois de cruzar a linha média, esses axônios vez anteriormente e projeto para o cérebro. Cada uma dessas etapas é regulado pela ação de várias pistas de orientação. Culturas altamente enriquecido em neurônios comissurais são ideais para muitas experiências abordando os mecanismos de pathfinding axônio, incluindo ensaios de torneamento, imunoquímica e bioquímica. Aqui, nós descrevemos um método para dissecar e cultura de neurônios comissurais E13 rato medula espinhal dorsal. Em primeiro lugar, a medula espinhal é isolado e tiras dorsal são dissecados. O tecido é então dissociado dorsal em uma suspensão de células por tripsinização e perturbação mecânica. Neurônios são banhados em lamínulas poli-L-lisina-revestido de vidro ou de cultura de tecidos de pratos. Após 30 horas<em&gt; In vitro</em&gt;, A maioria dos neurônios ter estendido um axônio. A pureza da cultura (Yam<em&gt; Et al.</em&gt; 2009), geralmente mais de 90%, pode ser avaliada por imunomarcação com o comissural DCC marcadores neurônio, LH2 e tag1 (Helms e Johnson, 1998). Esta preparação neuronal é uma ferramenta útil para<em&gt; In vitro</em&gt; Estudos dos mecanismos celulares e moleculares do crescimento do axônio comissural e orientação durante o desenvolvimento da medula espinhal.

Este vídeo demonstra um método para dissecar e cultura de neurônios comissurais E13 rato medula espinhal dorsal. Dissociada neurônios comissurais são úteis para estudar os mecanismos celulares e moleculares do crescimento do axônio e orientação.

Dissecção e Cultura de Neurônios da Medula Espinhal comissural embrionárias

Os neurônios comissurais têm sido amplamente utilizados para investigar os mecanismos subjacentes à orientação axonal durante o desenvolvimento embrionário da medula espinhal. Os corpos celulares...

Este vídeo demonstra um método para dissecar e cultivar neurônios motores comissurais da medula espinhal embrionária. O procedimento começa com a coleta de embriões de rato E13 e, em seguida, a dissecação das medulas espinhais. Durante a dissecação, as medulas espinhais são abertas ao longo da placa dorsal e preparadas na configuração de livro aberto.Tiras de tecido dorsal são dissecadas e coletadas em um tubo. O tecido dorsal é dissociado em uma suspensão de células únicas por tripsina e disruptura mecânica. Em seguida, neurônios comissurais são cultivados em lamínulas de vidro revestidas com polilisina ou em placas de cultura de tecidos.Eles podem então ser utilizados para estudar os mecanismos celulares e moleculares do crescimento e orientação de axônios. Olá, sou Sebastian do Laboratório de Biologia Molecular do Desenvolvimento Neural do Instituto de Pesquisa Clínica de Montreal. Olá, sou Steve Moen, também do Laboratório de Biologia Molecular do Desenvolvimento Neural.Hoje vamos mostrar um procedimento para dissecar e cultivar neurônios comissurais da medula espinhal embrionária. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar os mecanismos celulares e moleculares da orientação axonal. Então, vamos começar.Hoje, as medulas espinhais serão dissecadas de embriões de rato E 13 recém-coletados, colocados em uma placa contendo meio L 15 durante toda a dissecação. É importante manter os embriões e as soluções em gelo. Lembre-se de que, em todos os passos da dissecação, é fundamental não esticar a medula espinhal com pinça de níquel, pois isso pode dificultar o isolamento de uma medula espinhal completamente intacta.Sob um microscópio estereoscópico, separe o embrião de todos os tecidos extraembrionários e membranas embrionárias. Em seguida, coloque um embrião no recipiente de dissecação. Utilize tesoura microcirúrgica para remover a cabeça e as partes posteriores dos ângulos mostrados aqui.Isso criará uma superfície plana que ajudará a posicionar o embrião para facilitar o acesso à medula espinhal. Posicione o embrião com o lado ventral voltado para baixo e a extremidade anterior apontando para longe. Use uma pinça para prender firmemente o embrião em um dos lados.Não aperte nem solte a pinça, ou o tecido se rasgará com o segundo par de pinças. Segure a pele ao lado da medula espinhal. Ajuste as pontas das pinças de fixação.Retire a pele que recobre a região dorsal do embrião para expor a medula espinhal envolvida pelas meninges, com o objetivo de destacar parcialmente o tecido localizado à direita da medula espinhal. Utilize pinças fechadas para furar o tecido a partir do nível das pinças de fixação. Aproxime-se o máximo possível da medula espinhal sem tocá-la.Repita várias vezes ao longo da medula espinhal. Isso fixará alguns gânglios da raiz dorsal e perturbará órgãos ventrais. Deixe algum tecido aderido nas extremidades anterior e posterior, começando pela extremidade anterior.Use uma agulha de tungstênio em forma de gancho para cortar as meninges e abrir a medula espinhal ao longo da placa do teto. Gire o embrião 180 graus e rompa o tecido do lado restante. Utilizando o mesmo método.Em seguida, solte completamente o tecido no lado esquerdo da medula espinhal, o lado que foi inicialmente lesionado anteriormente no lado direito; coloque a medula espinhal de lado e use pin&ccedil;as para remover a maior parte do tecido mesenquimal remanescente e os g&acirc;nglios das ra&iacute;zes dorsais. Use pin&ccedil;as para destacar uma pequena aba das meninges. Neste ponto, as meninges e a medula espinhal formam duas camadas de tecido semelhantes a uma fatia de sandu&iacute;che.Use a pinça para fixar a porção maior da medula espinhal na extremidade anterior. Segure os dois segmentos separados com a pinça e remova as meninges. Com um movimento suave e constante, a remoção irregular pode romper a camada das meninges e/ou a medula espinhal.Se a camada de meninges se romper durante a tração, a porção da medula espinhal que permanece aderida às meninges geralmente é irrecuperável. Embora às vezes seja possível. Use um pipeta de plástico para transferir suavemente a medula espinhal isolada para uma placa contendo meio L 15 com 10% de soro de cavalo inativado pelo calor em gelo antes de processar mais embriões.Lembre-se de trocar o meio no recipiente de dissecação por L-15 gelado para manter o embrião frio e ajudar a preservar a integridade do tecido. Colete os cordões espinhais de todos os embriões antes de prosseguir para as dissecações da porção dorsal da medula espinhal. Para iniciar a dissecação da medula dorsal, coloque um cordão espinhal recém-isolado em uma placa de Petri contendo L-15 com 10% de soro de cavalo aquecido e ativado.Remova a porção anterior mais larga, que inclui parte do cérebro posterior. Em seguida, acomode a medula espinhal em uma superfície plana, abrindo-a como um livro. O tecido dorsal localiza-se nas partes mais laterais da medula espinhal aberta, enquanto fixa a medula com uma agulha reta de tungstênio, utilizando uma agulha de tungstênio em forma de L para cortar uma faixa com aproximadamente um quinto da largura de uma metade da medula espinhal; cortar faixas mais largas aumentará o rendimento, mas reduzirá a pureza da cultura.Transfira várias tiras dorsais para um tubo cônico de 15 mililitros contendo meio L 15 com 10% de soro de cavalo e coloque o tubo sobre gelo. O restante do procedimento será realizado próximo ou dentro da cabine de cultura de tecidos. Para essas culturas, é importante preparar as soluções e o equipamento com antecedência, geralmente antes da dissecação.O passo de tação utiliza tubos de vidro polidos ao fogo de dois tamanhos, um com diâmetro igual à metade do tamanho original e outro ligeiramente menor. Antes de iniciar, recubra os dois tubos polidos ao fogo com meio contendo soro, aspirando o meio para dentro dos tubos e deixando repousar por 30 segundos. Isso reduzirá o número de células que aderem ao vidro durante a tação.Inicie verificando se as faixas dorsais assentaram no fundo do tubo. Sob capela de fluxo laminar, remova a maior parte do sobrenadante SUP com uma pipeta Pasteur. Lave rapidamente com três mililitros de HBSS frio sem magnésio e sem cálcio.Deixe a faixa do tubo neural dorsal repousar por dois minutos. Em seguida, remova o HBSS com o espátula. Complete o volume até 4,7 mililitros.Com HBSS morno, adicione 0,3 mililitros de tripsina a 2,5% para obter uma concentração final de 0,15% de Tryin e misture suavemente. Incube em banho-maria a 37 graus Celsius por sete minutos, misturando delicadamente uma vez, no meio do tempo de incubação. Ao final da incubation, adicione DNAse para uma concentração final de 150 unidades por mililitro e sulfato de magnésio para uma concentração final de 0,15%, e misture brevemente.As seções do tubo neural dorsal devem estar fragmentadas agora. Centrifugue os fragmentos de tecido a 200 G durante quatro minutos. Remova o sobrenadante SUP com uma pipeta Pasteur, deixando cerca de 50 a 100 microlitros de líquido no fundo do tubo.Bata suavemente no tubo para soltar o pellet. Em seguida, lave as células adicionando cinco mililitros de HBSS morno. Deixe as células sedimentarem à temperatura ambiente por dois minutos.Centrifugue e lave as células novamente. Desta vez, re-suspenda em dois mililitros de HBSS morno. Use uma pipeta de vidro com ponta polida de diâmetro reduzido para triturar as células, pipetando lentamente para cima e para baixo quatro a seis vezes, direcionando o líquido contra a parede do tubo para quebrar aglomerados maiores e reduzir a morte celular.Evite formar bolhas e não exagere. Use o menor vidro de pasta pirex polido a fogo para dissociar ainda mais as células, pipetando lentamente para cima e para baixo de três a quatro vezes da mesma maneira. Não é necessário dissociar todos os aglomerados celulares, pois agregados tendem a se formar a partir de células mortas em detritos.Deixe os fragmentos de tecido sedimentarem por um minuto. Em seguida, remova 20 microlitros do sobrenadante SUP, que deverá conter as células suspensas para contagem em um hemocitômetro; os neurônios deverão apresentar viabilidade de pelo menos 95% pelo teste de exclusão de azul de tripano. Plaque os neurônios em meio de cultivo neurobasal em uma concentração apropriada para sua aplicação.16 a 18 horas depois, troque o meio por meio de crescimento neural basal para evitar deslocamento. Os neurônios devem ter o meio removido suavemente com uma pipeta, em vez de aspirado com uma bomba de vácuo. Abaixo estão alguns resultados representativos de neurônios comissurais isolados cultivados em lamínulas de vidro revestidas com PLL; quatro horas após a semeadura, os neurônios aderiram à superfície, 30 horas após a semeadura.A maioria dos neurônios possui axônios alongados com um cone de crescimento visível. Esses neurônios podem ser facilmente utilizados em experimentos de imunofluorescência. Neste exemplo, os microtúbulos são marcados em verde, o f actina em vermelho e o NA em azul.Acabamos de mostrar como dissecar e cultivar neurônios comissurais de medulas espinhais embrionárias. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que a pureza dos neurônios comissurais depende da espessura da faixa dorsal que é dissecada. É isso aí.Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este ensaio avalia a capacidade de uma molécula de sinalização, aqui proteína morfogenética óssea 7 (BMP7), para reorientar axônios comissurais. Um explante da medula espinhal dorsal embrionárias cultivadas é adjacente a um agregado de células secretoras de COS os fatores de crescimento candidato. Reorientou axônios comissurais crescendo dentro do explante são visualizados através da imuno-histoquímica.

Doseamento do Capacidade de difusíveis moléculas sinalizadoras para Reorientar embrionárias Spinal Axônios comissural

Demonstramos como dissecar e cultura pinto gânglio statoacoustic E4 e E6 explantes medula espinhal. Explantes são cultivados sob condições sem soro em gel de colágeno 3D por 24 horas. Neuritos resposta é testado com o meio do fator de crescimento suplementado com proteína e revestido contas.

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O vídeo demonstra o isolamento de neurônios oculomotores, trocleares e motores espinhais de um embrião de camundongo transgênico. O embrião expressa neurônios motores marcados com uma proteína fluorescente verde (GFP) para fácil visualização e identificação. Os neurônios motores são isolados cirurgicamente sob um microscópio de fluorescência e mantidos em meio de cultura.

Isolamento e cultura de neurônios oculomotores, trocleares e motores espinhais de um embrião de camundongo

Cultura de lâminas de facilitar a manipulação do gene de desenvolvimento do embrião e perturbações farmacológicas. No entanto, as condições de cultura devem assegurar que o desenvolvimento normal pode prosseguir dentro do ambiente reduzido da fatia. Ilustramos um protocolo que facilita o desenvolvimento normal, medula espinhal prosseguir durante pelo menos 24 horas.

Embrião de galinha Spinal Cord Protocolo Cultura Slice

Processos de desenvolvimento, tais como a proliferação, a modelagem, diferenciação, e a orientação do axónio pode ser facilmente modelada na medula espinal do peixe-zebra. Neste artigo, nós descrevemos um procedimento de montagem para os embriões de peixe-zebra, que otimiza a visualização destes eventos.

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A placa do piso é uma estrutura fundamental das desenvolvimento da medula espinhal, que fornecem sinais difusíveis para progenitores e diferenciação de neurônios. Nós descrevemos um método para produzir laje meio condicionado, para aplicá-lo ao novo tecido da medula espinhal, e para avaliar as consequências sobre as proteínas de interesse pela bioquímica.

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As lampreias recuperar locomoção após uma lesão completa da medula espinhal. No entanto, alguns neurônios espinhais de projeção são bons regeneradores e outros não. Este artigo ilustra as técnicas para larvas de lampreia mar habitação (e adultos recém-transformados), produzindo completos transecções medulares e preparar cérebros wholemount e medulas espinhais de hibridização in situ.

Spinal Cord Injury completo e Cérebro Dissection Protocolo para Wholemount Subsequente<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização em larval da lampreia de mar

Modelos de cultura celular proporcionar um controle detalhado sobre as condições ambientais e, assim, proporcionar uma plataforma poderosa para elucidar vários aspectos da biologia celular neuronal. Nós descrevemos um método rápido, barato e confiável para isolar, dissociar e cultura neurônios sensoriais a partir de embriões de galinha. Os detalhes da preparação substratos e imunocitoquímica também são fornecidos.

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Aqui apresenta-se um protocolo que é baseado em fatias de medula espinhal cultivadas em matrizes multi-eléctrodos para estudar a regeneração funcional de ligações propriospinal in vitro.

Investigando regeneração funcional em organotï¿½icas Medula Espinhal Co-culturas cultivadas em Arrays Multi-eletrodo

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Isolamento e Cultura dos neurônios oculomotores, trochlear e motores espinhais de pré-natal Islmn:GFP Ratos Transgênicos

Aprenda a dissecar e cultivar neurônios comissurais da medula espinal dorsal de embriões de rato E13. Este método permite estudar mecanismos celulares e moleculares do crescimento e orientação de axônios em neurociência.

Dissecção e Cultura de Neurônios da Medula Espinhal comissural embrionárias

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