Dissecção e Cultura de Neurônios da Medula Espinhal comissural embrionárias

Este vídeo demonstra um método para dissecar e cultivar neurônios corais da medula espinhal embrionária. O procedimento começa com a colheita de embriões de ratos E 13 e, em seguida, a dissecção da medula espinhal. Durante a dissecção, as medulas espinhais são abertas ao longo da placa do teto e preparadas na configuração de livro aberto.

As tiras de tecido dorsal são dissecadas e coletadas em um tubo. O tecido dorsal é dissociado em uma única suspensão celular por tripsina e ruptura mecânica. Os neurônios comissurais são então cultivados em lamínulas de vidro revestidas de polilisina ou placas de cultura de tecidos.

Eles podem então ser usados para estudar os mecanismos celulares e moleculares de crescimento e orientação do axônio. Olá, sou Sebastian, do Laboratório de Biologia Molecular do Desenvolvimento Neural do Instituto de Pesquisa Clínica de Montreal. Olá, sou Steve Moen, também do Laboratório de Biologia Molecular do Desenvolvimento Neural.

Hoje mostraremos um procedimento para dissecar e cultivar neurônios comissurais da medula espinhal embrionária. Usamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar os mecanismos celulares e moleculares de orientação de sotaque. Então vamos começar.

Hoje, as medulas espinhais serão dissecadas de embriões de ratos E 13 recém-colhidos colocados em uma placa de meio L 15 durante toda a dissecação. É importante manter embriões e soluções no gelo. Lembre-se de que, para todas as etapas de dissecação, é crucial não esticar a medula espinhal, pois isso pode impedir o isolamento de uma medula espinhal totalmente intacta.

Sob um microscópio de dissecação, separe o embrião de todos os tecidos embrionários extras e membranas embrionárias. Em seguida, coloque um embrião na placa de dissecação. Use uma microtesoura para cortar a cabeça e as partes posteriores dos ângulos mostrados aqui.

Isso criará uma superfície plana que ajudará a posicionar o embrião para facilitar o acesso à medula espinhal. Posicione o lado ventral do embrião para baixo com o anterior apontando para longe. Use uma pinça para prender firmemente o embrião de um lado.

Não aperte ou solte a pinça ou o tecido se rasgará com o segundo par de pinças. Segure a pele ao lado da medula espinhal. Twe as pontas da pinça de retenção.

Retire a pele que cobre a parte de trás do embrião para expor a medula espinhal envolta em suas meninges para separar parcialmente o tecido à direita da medula espinhal. Use uma pinça fechada para cutucar o tecido começando no nível da pinça de retenção. Aproxime-se o máximo possível da medula espinhal sem tocá-la.

Repita várias vezes ao longo da medula espinhal. Isso anexaria alguns gânglios da raiz dorsal e interromperia os órgãos ventrais. Deixe algum tecido preso nas extremidades anterior e posterior, começando pela extremidade anterior.

Use uma agulha de tungstênio em forma de gancho para cortar as meninges e abrir a medula espinhal ao longo da placa do telhado. Gire o embrião 180 graus e interrompa o tecido do lado restante. Usando o mesmo método.

Em seguida, separe completamente o tecido do lado esquerdo da medula espinhal, o lado que foi interrompido anteriormente originalmente à direita, coloque a medula espinhal de lado e use uma pinça para remover a maior parte do tecido mesenquimal restante e dos gânglios da raiz dorsal. Use uma pinça para abrir uma aba curta de meninges. Neste ponto, as meninges e a medula espinhal são duas folhas de tecido sanduíche.

Use a pinça para fixar a porção maior da medula espinhal na extremidade anterior. Segure os dois segmentos separados com uma pinça e retire as meninges. Com um movimento suave e constante, o peeling irregular pode quebrar a camada de meninges e/ou a medula espinhal.

Se a camada de meninges se romper durante a tração, a parte da medula espinhal que permanece presa às meninges geralmente é irrecuperável. Embora às vezes seja possível. Use um tubo de plástico para transferir suavemente a medula espinhal isolada para um prato de meio L 15 com soro de cavalo inativado a 10% de calor no gelo antes de processar mais embriões.

Lembre-se de trocar o meio na placa de dissecção por L 15 resfriado para manter o embrião fresco e ajudar a preservar a integridade do tecido. Colha a medula espinhal de todos os embriões antes de prosseguir para as dissecções da medula espinhal dorsal. Para iniciar a dissecção da medula dorsal, coloque uma medula espinhal recém-isolada em uma placa de Petri contendo L 15 com 10% de calor e soro de cavalo ativado.

Corte a porção anterior mais larga, que inclui parte do cérebro posterior. Em seguida, coloque a medula espinhal plana e espalhe-se como um livro aberto. O tecido dorsal está localizado nas partes mais laterais da medula espinhal de livro aberto enquanto prende o cordão com uma agulha de tungstênio reta usando agulha de tungstênio em forma de L para cortar uma tira de aproximadamente um quinto, a largura de metade da medula espinhal cortando tiras mais largas aumentará o rendimento, mas reduzirá a pureza da cultura.

Transfira várias tiras dorsais para um tubo cônico de 15 mililitros contendo L 15 médio com 10% de soro de cavalo e coloque o tubo no gelo. O restante do procedimento ocorrerá próximo ou dentro do capuz de cultura de tecidos. Para essas culturas, é importante preparar soluções e equipamentos com antecedência, geralmente antes da dissecação.

A etapa de tação usa tubos de massa polida a fogo de dois tamanhos, um de diâmetro, que é metade do tamanho original e o outro um pouco menor. Antes de começar, cubra os dois tubos polidos com soro contendo meio, aspirando o meio nos tubos e deixando descansar por 30 segundos. Isso reduzirá o número de células que aderem ao vidro durante a ação.

Comece verificando se as tiras dorsais se acomodaram no fundo do tubo. Sob a capa de fluxo de lâmina, remova a maior parte do SUP Lave rapidamente com três mililitros de HBSS frio sem magnésio e cálcio.

Deixe a tira do tubo neural dorsal assentar por dois minutos. Em seguida, retire o HBSS com o macarrão. Aumente o volume para 4,7 mililitros.

Com HBSS quente, adicione 0,3 mililitros de 2,5% de tripsina para obter uma concentração final de 0,15% de tentina e misture delicadamente incubar em banho-maria a 37 graus Celsius por sete minutos. Misturando uma vez suavemente na metade da incubação. Quando a incubação estiver concluída, adicione DNAs para uma concentração final de 150 unidades por mililitro em sulfato de magnésio para uma concentração final de 0,15% e misture brevemente.

As seções do tubo neural dorsal agora devem ser fragmentadas. Centrifugar os fragmentos de tecido a 200 G durante quatro minutos. Remova o sobrenadante de SUP com um perpe de macarrão deixando cerca de 50 a 100 microlitros de líquido no fundo do tubo.

Agite o tubo suavemente para soltar o pellet. Em seguida, lave as células adicionando cinco mililitros de HBSS quente. Deixe as células assentarem em temperatura ambiente por dois minutos.

Gire para baixo e lave as células novamente. Desta vez, resus suspendendo em dois mililitros de HBSS quente. Use uma pipeta de polimento de fogo de meio diâmetro para triturar as células, pipetando lentamente para cima e para baixo quatro a seis vezes, pipete o líquido contra a lateral do tubo para quebrar aglomerados maiores para reduzir a morte celular.

Evite fazer bolhas e não coma demais. Use o menor perpe de massa de vidro polido para dissociar ainda mais as células, pipetando lentamente para cima e para baixo três a quatro vezes da mesma maneira. Não é necessário dissociar todos os aglomerados de células, pois os agregados tendem a se formar de células mortas nos detritos.

Deixe qualquer fragmento de tecido repousar por um minuto. Em seguida, remova 20 microlitros do SUP natant, que deve conter células suspensas para contagem em um hemossom, os neurônios devem ser pelo menos 95% viáveis por placa de íons azul trian. Os neurônios em meios de revestimento neurobasal em uma concentração apropriada para sua aplicação.

16 a 18 horas depois, mude o meio para o meio de crescimento basal neural para evitar o deslocamento. Os neurônios removem suavemente o meio com uma pipeta em vez de aspirar com uma bomba de vácuo. Aqui estão alguns resultados representativos de neurônios comissurais isolados plaqueados em lamínulas de vidro revestidas com PLL quatro horas após o revestimento, os neurônios aderiram à superfície 30 horas após o revestimento.

A maioria dos neurônios tem axônios estendidos com um cone de crescimento visível. Esses neurônios podem ser facilmente usados em experimentos de imunofluorescência. Neste exemplo, os microtúbulos são rotulados em verde f acton em vermelho e NA em azul.

Acabamos de mostrar como dissecar e cultivar neurônios comissurais da medula espinhal embrionária. Ao fazer este procedimento, é importante lembrar que a pureza dos neurônios comissurais depende da espessura da faixa dorsal que é dissecada. Então é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.