Name: Primárias células epiteliais brônquicas humanas Grown a partir de explantes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-26T17:10:00.000+00:00
Duration: 14 min 32 s
Description: Aprenda a cultivar células epiteliais brônquicas humanas primárias a partir de explantes de tecido brônquico fresco. Este protocolo utiliza interface ar-líquido para diferenciação celular e estudos de doenças pulmonares.

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Os autores são muito gratos ao Dr. Richard Inculet para fornecer os tecidos bronquiais. Aprovações Conselho de Ética em Pesquisa foram obtidos a partir Saúde de São José Hamilton e The University of Western Ontario / London Health Sciences Centre (Dr. David McCormack), Comitê de Tecidos e Arquivos, Departamento de Patologia. Agradecemos também a Ernie Spitzer (Electron Microscopy, McMaster University) para a prestação de TEMs das culturas de nosso ALI, e Farkas Daniela para fornecer alguns dos materiais necessários para a imunocoloração. Este trabalho foi financiado por uma doação de termo Bloco da Sociedade Torácica Ontário; Dr. Asma Yaghi foi apoiado por uma bolsa FSORC, Saúde São José, Hamilton, Ontário, Canadá.

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</ol>

Neste estudo nós apresentamos métodos detalhados para a cultura e expansão do ensino primário células epiteliais brônquicas humanas. Demonstramos como explantes e transplantes de tecido dos brônquios, cultivados nos meios de comunicação que promovem o crescimento de células epiteliais, pode fornecer uma fonte contínua de células epiteliais das vias aéreas humanas para estudos de modelos não-diferenciada de células (submersa) e diferenciados (cultivadas em ar-líquido interface) . Estas células podem ser utilizadas em sis...

Outros requisitos: incubadora, segurança biológica gabinete (BSC), centrífuga, placas de cultura 100mm, tubos estéreis (15 ml, 50 ml e 2 ml), pontas de pipeta estéril, lidar com bisturi e lâminas, pequena tesoura afiada, aventais e luvas. Estes podem ser obtidos a partir de seus fornecedores preferenciais.

primárias células epiteliais brônquicas humanas grown a partir de explantes

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Células epiteliais brônquicas humanas são necessários para os modelos de celular da doença e para investigar o efeito de excipientes e agentes farmacológicos sobre a função e estrutura de células epiteliais. Aqui nós descrevemos em detalhe o método de cultivo de células epiteliais brônquicas tecido das vias aéreas brônquicas que é colhida pelo cirurgião na hora da cirurgia de pulmão (câncer de pulmão por exemplo, ou cirurgia redutora de volume). Com a ética aprovação e consentimento informado, o cirurgião leva o que é necessário para a patologia e nos fornece uma porção brônquica que é remota a partir das áreas doentes. O tecido é então usado como fonte de explantes que podem ser usados ​​para o cultivo de células epiteliais brônquicas primária em cultura. Segmentos brônquica cerca de 0,5 a 1 cm de comprimento e um centímetro de diâmetro ≤ são lavados com EBSS frio e do tecido parenquimatoso em excesso é removido. Segmentos são cortadas e picadas em 2-3mm<sup&gt; 3</sup&gt; Peças de tecido. As peças são usadas como fonte de células primárias. Depois de placas de revestimento 100 milímetros cultura por 1-2 hr com uma combinação de colágeno (30 mcg / ml), a fibronectina (10 mcg / ml) e BSA (10 mcg / ml), as placas estão riscados em áreas 4-5 e tecido peças são colocadas nas áreas riscado, então, meio de cultura (DMEM / Ham F-12 com aditivos) adequado para o crescimento das células epiteliais é adicionada e as placas são colocadas em uma incubadora a 37 ° C em 5% de CO<sub&gt; 2</sub&gt; Ar umidificado. O meio de cultura é trocado a cada 3-4 dias. As células epiteliais crescem as peças que formam cerca de 1,5 cm de diâmetro anéis em 3-4 semanas. Explantes pode ser reutilizado até 6 vezes movendo-as para novas placas pré-revestidas. Células são levantadas usando tripsina / EDTA, agrupados, contados e re-banhado em frascos T75 Bind celular para aumentar seus números. T75 frascos semeados com 2-3 milhões de células crescem a 80% em confluência de 4 semanas. Expandiu principal células epiteliais humanas podem ser cultivadas e permitiu diferenciar no ar-líquido interface. Métodos descritos aqui fornecer uma fonte abundante de células epiteliais brônquicas humanas a partir de tecidos recém-isoladas e permitir a estudar essas células como modelos de doença e de farmacologia e toxicologia de triagem.

Aqui nós descrevemos um método detalhado para o cultivo primário células epiteliais brônquicas humanas a partir de explantes de tecido das vias aéreas brônquicas humanas incluindo o crescimento diferenciado em uma interface ar-líquido. Este método fornece uma fonte abundante de células primárias para investigar o papel do epitélio das vias aéreas pulmonares em saúde humana e doenças.

Primárias células epiteliais brônquicas humanas Grown a partir de explantes

Células epiteliais brônquicas humanas são necessárias para modelos celulares de doenças e para investigar o efeito de excipientes e agentes farmacológicos sobre o...

Neste artigo, descrevemos um protocolo para o crescimento e expansão de células epiteliais brônquicas humanas a partir de segmentos brônquicos humanos recém-isolados. Este protocolo consiste em cinco seções: codificação e arranhão, placas de cultura de cem milímetros, reparo do tecido brônquico, transplantes de tecido brônquico em explante, passagem de células epiteliais brônquicas humanas ciliadas em crescimento e células epiteliais brônquicas humanas em transwell. Antes de começar, observe que todas as etapas são realizadas na cabine de segurança biológica.A menos que indicado de outra forma, leia a seção de materiais, reagentes e preparação e certifique-se de que você já tenha se preparado basicamente. Os seguintes procedimentos de codificação, cultura de solução estoque, meio, soluções de dissociação, revestimento e raspagem devem ser realizados no bst.Mantenha tudo estéril. Coloque placas de cultura estéreis de cem milímetros e solução de revestimento. Na pipeta BST, adicione dois mililitros de solução de revestimento e gire a placa de cem milímetros para revestir a base da placa.Certifique-se de que a solução de revestimento cubra uniformemente a base da placa. Pipete a solução restante e use-a para revestir uma segunda placa de cem milímetros. Repita para quantas placas forem necessárias.O número de placas necessário varia conforme o número de explantes teciduais. Certifique-se de que a solução de revestimento cubra uniformemente a base das placas. Como demonstrado.Cubra as placas com suas tampas. Deixe as placas secarem no incubador por uma a duas horas e aspire o excesso de solução antes do uso para explante de tecido brônquico. As placas de cultura revestidas não utilizadas podem ser colocadas em um saco estéril e armazenadas a quatro graus Celsius para uso posterior.Use spray limpo, tesoura pequena e afiada, bisturi e pinça com etanol a 70% e leve ao BSC placas com arranhões revestidos pressionando firmemente com o bisturi para formar pequenos X profundos, pelo menos quatro por placa. Se o arranhão não for profundo o suficiente, os fragmentos de tecido não irão assentar nas seringas e flutuarão para fora. Fora do BSC, coloque o tecido em uma placa P três. Enxágue o tecido brônquico humano isolado abundantemente em BSS.Abra os fragmentos brônquicos. Coloque o tecido no BS e transfira para uma placa de cultura de tecidos estéril de cem milímetros contendo DMEM/Ham F-12 suplementado com 1% de antibiótico-antimicótico. Use uma tesoura pequena e afiada para cortar o tecido em fragmentos cúbicos de dois a três milímetros.Coloque um pedaço de tecido cortado no centro de cada X com uma pinça e pressione. Deixe suavemente os pedaços de tecido ou explantes em formato de X aderirem à placa por alguns segundos. Em seguida, adicione cuidadosamente 10 mL de meio completo. Se o tecido flutuar após a adição do meio, use a pinça para empurrar o tecido para dentro das reentrâncias do X ou crie um novo X. Pode ser necessário criar novos Xs se as reentrâncias não forem suficientemente profundas.Coloque as placas no incubador e troque o meio a cada três a quatro dias; os tecidos estarão prontos para transplante quando células epiteliais suficientes tiverem crescido ao redor dos tecidos, cobrindo áreas de um a dois centímetros, o que leva aproximadamente quatro semanas. Utilize placas revestidas e riscadas de cem milímetros.Como alguns explantes de tecido podem não ter sucesso, o número de placas depende da quantidade de fragmentos de tecido que você está transplantando. Se estiver utilizando placas previamente revestidas e armazenadas a quatro graus Celsius, aqueça-as até a temperatura ambiente antes do uso. Com uma pinça, retire cuidadosamente o tecido da placa original e coloque no centro do eixo da nova placa, pressionando suavemente. Descarte os tecidos que não apresentarem crescimento externo.Deixe o tecido aderir à placa. Por alguns segundos, adicione o meio e incube. Adicione conforme descrito anteriormente para X explan.Então, dois mililitros de tripsina e solução estoque de EDTA para cada placa de cultura tecidual de cem mililitros. Dilua o estoque com seis mililitros de PBS estéril 0,01 molar e dois mililitros da solução estoque em seis mililitros de PBS, para uma concentração final de tripsina de duzentos e cinquenta microgramas por mililitro e de EDTA de cem microgramas por mililitro. Após transferir os explantes para uma nova placa, aspire o meio das placas com anéis de um a dois centímetros de células.Adicione oito mililitros de gotas mornas diluídas e edte uma solução em cada placa de cem milímetros. Em seguida, coloque no incubador a 37 graus Celsius por três a quinze minutos. Verifique com frequência.Deixar a tripsina por muito tempo danificará as células. Verifique as placas ao microscópio para garantir que a maioria das células tenha sido destacada; as células ficarão arredondadas e se desprenderão, conforme mostrado aos oito minutos de aquecimento. Adicione 10% de FBS no meio por placa para inativar a solução de EDTA.Combine os volumes de todas as placas em um único tubo ou em tubos separados de diferentes tecidos. Conte as células utilizando uma centrífuga Hema Cytometer a cem G durante cinco minutos. Um pellet celular se formará na base do tubo; re-suspenda o pellet celular em meio completo até a concentração celular desejada.Coloque de dois a três milhões de células por frasco T 75 e adicione o meio completo conforme necessário. Incube e troque o meio. A cada três a quatro semanas, as células atingem subconfluência em frascos D 75.Em cerca de quatro semanas, as células devem ser destacadas e expandidas ou utilizadas em subconfluência para evitar o envelhecimento. Comece preparando as membranas permeáveis dos transbem. Utilize os insertos de 6,5 milímetros que se encaixam nas placas de múltiplos poços de 24 poços.Adicione meio a ambos os lados da membrana. Seis décimos de mililitro na parte inferior e 0,1 mililitro na parte superior. Incube por uma hora em incubadora de cultura celular.Remova cuidadosamente o meio de ambos os lados da membrana. Começar primeiro com o volume basal pode significar que a membrana seja facilmente danificada. Portanto, pipete o meio pela lateral do inserto de cultura, utilizando o volume recomendado.Não fazer isso resultará em vazamento do meio para outros poços, contaminando as células semeadas. Após a pré-incubação do suporte permeável, pipete cuidadosamente a suspensão celular no lado apical da membrana para poços de 6,5 milímetros, utilizando 0,1 mL da suspensão celular no lado apical da membrana. Pipete 0,6 mL de meio no lado basal da membrana.Alimente as células pelos lados epical e basal durante 10 dias. Para estabelecer uma troca de cultura bem diferenciada, troque o meio duas vezes por semana. Utilizando o método demonstrado, remova o volume basal.Primeiro, substitua o volume apical, adicionando 0,6 mL de meio ao lado basal da membrana. Este método promove a adesão celular à membrana e evita que as células fiquem expostas ao ar por longos períodos. Troque o meio rapidamente e retorne à incubadora.Crie uma interface ar-líquido no dia 10 removendo o meio AAL e substituindo 0,6 mil do meio no lado basal da membrana. Mantenha as células na interface ar-líquido por seis semanas, trocando o meio duas vezes por semana. As células ciliadas começarão a aparecer quatro semanas após a criação da interface.Interface líquida. As células atingirão diferenciação uniforme em células ciliadas. Seis semanas após a criação da interface líquida da orelha.Segmentos brônquicos humanos com células epiteliais saudáveis de explantes e transplantes. Em nosso estudo, culturas bem-sucedidas a partir de explantes do tecido brônquico ocorreram em oito dos nove tecidos. Como uma das culturas de explante foi infectada, os anéis de células epiteliais atingiram um raio de um a dois centímetros em três a quatro semanas.Culturas bem-sucedidas de explantes X foram novamente cultivadas até seis vezes. Todas as culturas bem-sucedidas mostram evidência de migração celular nas primeiras 48 horas após o início dos transplantes, ou explantes X, conforme mostrado em B; as células apresentam uma aparência em mosaico distinta dessas células epiteliais, como mostrado em B. Em figuras subsequentes, a imunomarcação de preparações de citosina de células de explantes e células semeadas em lamínulas revelou que todas as células foram positivas para a citoceratina específica do epitélio. Células brônquicas subcultivadas de humanos cultivadas até a subconfluência em frascos T 75 são mostradas aqui. Observe a aparência em mosaico.Células bronquiais humanas subcultivadas mostraram imunomarcação uniformemente positiva para queratina e E-CAM. A imunomarcação com anticorpos específicos contra outros tipos celulares não mostrou qualquer indicação de contaminação das culturas por fibroblastos, células mesenquimais ou endoteliais. Para mais detalhes, consulte a figura cinco e sua legenda no texto. Células cultivadas em membranas de poliéster permeáveis ou transwell, com ou sem interface líquida, diferenciaram-se em epitélio ciliado, conforme demonstrado aqui. Descarte as células e seus ou transplantes se células com morfologia diferente da esperada começarem a aparecer. Neste protocolo, apresentamos métodos detalhados para o cultivo e expansão de células epiteliais brônquicas humanas primárias.Estudos baseados em células humanas são necessários para determinar vias importantes dos mecanismos de doenças pulmonares humanas e para triagem de toxicidade e farmacológica de novas drogas. Esperamos que os métodos descritos aqui o incentivem a cultivar células epiteliais brônquicas humanas a partir de explantes e a utilizar essas células em seus sistemas de estudo. Obrigado e boa sorte.

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JoVE Journal

Biology

Biologia

Células epiteliais nasais, obtidas através de biópsia superficial raspar de voluntários humanos, são expandidas e transferido para tecido inserções de cultura. Ao atingir a confluência, as células são cultivadas na interface ar-líquido, obtendo-se culturas de células ciliadas e não ciliadas. Culturas de células epiteliais nasais diferenciados fornecem modelos experimentais para o estudo de viáveis ​​da mucosa respiratória.

A cultura de células epiteliais nasais Humano na interface ar líquido

Esta publicação demonstra métodos para amostragem e cultura bem-sucedidas da mucosa epitelial nasal de crianças e reprogramação dessas células para células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs).

Cultivar células primárias Nasal epiteliais de Crianças e reprogramar em células-tronco pluripotentes induzidas

As células epiteliais brônquicas humanas primárias são difíceis de transduzir. Este protocolo descreve a produção de lentivírus e sua concentração, bem como as condições ideais de cultura necessárias para obter transduções altamente eficientes nessas células durante a diferenciação para um epitélio pseudoestratificado.

Optimal Lentivírus produção e cultura celular condições para sucesso pilhas transdução primária brônquicas humanas epiteliais

Este artigo fornece uma metodologia detalhada para as abordagens de dissociação tecidual e fracionamento celular permitindo o enriquecimento de células epiteliais viáveis de regiões proximais e distais do pulmão humano. Aqui essas abordagens são aplicadas para a análise funcional das células progenitoras epiteliais pulmonares através do uso de modelos de cultura organoides 3D.

Isolamento e enriquecimento de células progenitoras epiteliais pulmonares humanas para a cultura organoide

Aqui descrevemos o isolamento, amplificação e diferenciação das células epiteliais nasais primárias (HNE) na interface ar-líquido e um protocolo de biobanco permitindo congelar com sucesso e, em seguida, descongelar HNE amplificada. O protocolo analisa propriedades eletrofisiológicas de células HNE diferenciadas e correção de secreção de cloreto relacionada ao CFTR em diferentes tratamentos moduladores.

Células Epiteliais Nasais Humanas Primárias: Biobanco no Contexto da Medicina de Precisão

O protocolo apresenta um método para derivar organoides pulmonares humanos de tecidos pulmonares primários, expandir os organoides pulmonares e induzir diferenciação proximal para gerar organoides das vias aéreas 3D e 2D que ferem fielmente o epitélio das vias aéreas humanas.

Estabelecendo organoides pulmonares humanos e diferenciação proximal para gerar organoides maduros das vias aéreas

O presente protocolo descreve células pluripotentes pluripotentes induzidas por células-tronco derivadas do tipo 2 (iAT2s). Essas células podem ser cultivadas como esferas de auto-renovação na cultura 3D ou adaptadas à cultura de interface ar-líquido (ALI).

Gerando esferas 3D e culturas de interface ar-líquido 2D de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem

Os recentes avanços nos protocolos de diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidos pelo homem permitem a derivação stepwise de tipos celulares específicos de órgãos. Aqui, fornecemos etapas detalhadas para a manutenção e expansão das células basais derivadas das vias aéreas derivadas do iPSC e sua diferenciação em um epitélio mucociliary em culturas de interface ar-líquido.

Geração de culturas de interface ar-líquido de células epiteliais das vias aéreas a partir de células-tronco pluripotentes humanas

Apresentamos aqui um método reprodutível, acessível e robusto para o isolamento e expansão de células epiteliais brônquicas primárias para biobanco de longo prazo e geração de células epiteliais diferenciadas por cultura na interface ar-líquido.

Isolando Células Epiteliais Brônquicas de Tecido Pulmonar Ressecado para Biobanco e Estabelecendo Culturas de Interface Ar-Líquido Bem Diferenciadas

A cultura de interface ar-líquido é comumente usada para desenvolver epitélio pseudoestratificado das vias aéreas, diferenciando células epiteliais brônquicas humanas normais primárias que imitam o lado apical das vias aéreas pulmonares. Aqui, descrevemos um protocolo fácil para determinar sua qualidade monitorando suas propriedades biofísicas, como função ciliar e integridade da membrana.

Determinando a função ciliar e a impermeabilidade da membrana do epitélio pseudoestratificado das vias aéreas pulmonares

Aprenda a cultivar células epiteliais brônquicas humanas primárias a partir de explantes de tecido brônquico fresco. Este protocolo utiliza interface ar-líquido para diferenciação celular e estudos de doenças pulmonares.

Primárias células epiteliais brônquicas humanas Grown a partir de explantes

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