Primárias células epiteliais brônquicas humanas Grown a partir de explantes

Neste artigo, descrevemos um protocolo para o crescimento e expansão de células epiteliais brônquicas humanas a partir de segmentos brônquicos humanos recém-isolados. Este protocolo consiste em cinco seções: codificação e raspagem, placas de cultura de cem milímetros, reparo do tecido brônquico, transplantes de tecido brônquico em explante e passagem de células epiteliais brônquicas humanas ciliadas em transwell. Antes de começar, observe que todas as etapas são realizadas na câmara de segurança biológica.

A menos que indicado em contrário, leia a seção de materiais, reagentes e preparação e certifique-se de que você já tenha se preparado basicamente. Os seguintes procedimentos de codificação, cultura de solução estoque, meio, soluções de dissociação, revestimento e raspagem devem ser realizados no melhor momento.

Mantenha tudo estéril. Coloque placas de cultura estéreis de cem milímetros e solução de revestimento. Na pipeta BST, adicione dois mililitros de solução de revestimento e gire a placa de cem milímetros para revestir a base da placa.

Certifique-se de que a solução de revestimento cubra uniformemente a base da placa. Pipete a solução restante e use-a para revestir uma segunda placa de cem milímetros. Repita o procedimento para quantas placas forem necessárias.

O número de placas necessário varia conforme o número de explantes teciduais. Certifique-se de que a solução de revestimento cubra uniformemente a base das placas. Como demonstrado.

Cubra as placas com suas tampas. Deixe as placas secarem no incubador por uma a duas horas e aspire a solução em excesso antes do uso para explante de tecido brônquico. As placas de cultura revestidas não utilizadas podem ser colocadas em um saco estéril e armazenadas a quatro graus Celsius para uso posterior.

Use pequenas tesouras afiadas, bisturi e pinça limpos com spray de etanol 70% e leve ao BSC placas com arranhões revestidos, pressionando firmemente com o bisturi para formar pequenos X profundos, pelo menos quatro por placa. Se o arranhão não for suficientemente profundo, os fragmentos de tecido não irão assentar; as seringas flutuarão fora do BSC. Coloque o tecido em uma placa P três. Enxágue o tecido brônquico humano isolado abundantemente em BSS.

Abra os fragmentos brônquicos. Coloque o tecido no BS e transfira para uma placa de cultura de tecidos estéril de cem milímetros contendo DMEM/Ham F12 suplementado com 1% de antibiótico-antimicótico. Use a tesoura pequena e afiada para cortar o tecido em fragmentos cúbicos de dois a três milímetros.

Coloque um pedaço de tecido cortado no centro de cada X com pinça e pressione. Deixe suavemente os pedaços de tecido ou explantes em formato X aderirem à placa por alguns segundos. Em seguida, adicione cuidadosamente 10 mL de meio completo. Se o tecido flutuar após a adição do meio, use a pinça para empurrar o tecido para dentro das reentrâncias do X ou crie um novo X. Pode ser necessário criar novos Xs se as reentrâncias não forem suficientemente profundas.

Coloque as placas no incubador e troque o meio a cada três a quatro dias; os tecidos estarão prontos para transplante quando células epiteliais suficientes tiverem crescido ao redor dos tecidos, cobrindo áreas de um a dois centímetros, o que leva aproximadamente quatro semanas. Utilize placas revestidas e riscadas de cem milímetros.

Como alguns explantes teciduais podem não ter sucesso, o número de placas depende da quantidade de fragmentos de tecido que você está transplantando. Se estiver usando placas previamente revestidas e armazenadas a quatro graus Celsius, aqueça-as até a temperatura ambiente antes do uso. Com uma pinça, levante cuidadosamente o tecido da placa original e posicione-o no centro do eixo da nova placa, pressionando suavemente. Descarte os tecidos que não apresentarem crescimento externo.

Deixe o tecido aderir à placa. Por alguns segundos, adicione o meio e incube. Adicione conforme descrito anteriormente para X explan.

Adicione dois mililitros da solução estoque de tripsina e EDTA para cada placa de cultura de tecidos de cem mililitros. Dilua o estoque com seis mililitros de PBS estéril 0,01 molar e dois mililitros da solução estoque em seis mililitros de PBS, para uma concentração final de tripsina de duzentos e cinquenta microgramas por mililitro e de EDTA de cem microgramas por mililitro. Após transferir os explantes para uma nova placa, aspire o meio das placas com anéis de um a dois centímetros de células.

Adicione oito mililitros de gotas mornas diluídas e edte uma solução em cada placa de cem milímetros. Em seguida, coloque no incubador a 37 graus Celsius por três a quinze minutos. Verifique com frequência.

Deixar a tripsina por muito tempo danificará as células. Verifique as placas ao microscópio para garantir que a maioria das células tenha sido destacada; as células ficarão arredondadas e se desprenderão, conforme mostrado aos oito minutos de aquecimento. Adicione 10% de FBS no meio por placa para inativar a solução de EDTA.

Combine os volumes de todas as placas em um único tubo ou em tubos separados de diferentes tecidos. Conte as células utilizando um centrífugo de hemocitômetro a cem G durante cinco minutos. Um pellet celular se formará na base do tubo; re-suspenda o pellet celular em meio completo na concentração celular desejada.

Coloque de dois a três milhões de células por frasco T 75 e adicione o meio completo conforme necessário. Incube e troque o meio. A cada três a quatro semanas, as células atingem subconfluência em frascos D 75.

Em cerca de quatro semanas, as células devem ser destacadas e expandidas ou utilizadas em subconfluência para evitar o envelhecimento. Comece preparando as membranas permeáveis dos transbem. Utilize os insertos de 6,5 milímetros que se encaixam nas placas de múltiplos poços de 24 poços.

Adicione meio aos dois lados da membrana. Seis décimos de mil no fundo e 0,1 mil no topo. Incube por uma hora em incubadora de cultura celular.

Remova cuidadosamente o meio de ambos os lados da membrana. Começar primeiro pelo volume basal pode danificar facilmente a membrana. Portanto, pipete o meio ao longo da lateral do inserto de cultura, utilizando o volume recomendado.

Não fazer isso resultará em vazamento do meio para outros poços, contaminando as células semeadas. Após a pré-incubação do suporte permeável, pipete cuidadosamente a suspensão celular no lado apical da membrana para poços de 6,5 milímetros, utilizando 0,1 mL da suspensão celular no lado apical da membrana. Pipete 0,6 mL de meio no lado basal da membrana.

Alimente as células pelos lados apical e basal durante 10 dias. Para estabelecer uma troca de cultura bem diferenciada, troque o meio duas vezes por semana. Utilizando o método demonstrado, remova o volume basal.

Primeiro, substitua o volume epical e adicione 0,6 mils de meio ao lado basal da membrana. Este método promove a adesão celular à membrana e evita que as células fiquem expostas ao ar por longos períodos. Troque o meio rapidamente e retorne à incubadora.

Crie uma interface ar-líquido no dia 10 removendo o meio AAL e substituindo 0,6 mil do meio no lado basal da membrana. Mantenha as células na interface ar-líquido por seis semanas, trocando o meio duas vezes por semana. As células ciliadas começarão a aparecer quatro semanas após a criação da interface.

Interface líquida. As células atingirão diferenciação uniforme em células ciliadas. Seis semanas após a criação da interface líquida da orelha.

Segmentos brônquicos humanos com células epiteliais saudáveis de explantes e transplantes. Em nosso estudo, culturas bem-sucedidas a partir de explantes do tecido brônquico ocorreram em oito dos nove tecidos. Como uma das culturas de explante foi infectada, os anéis de células epiteliais atingiram um raio de um a dois centímetros em três a quatro semanas.

Culturas bem-sucedidas de explantes X foram cultivadas novamente até seis vezes. Todas as culturas bem-sucedidas mostram evidência de migração celular nas primeiras 48 horas após o início dos transplantes, ou explantes X, como mostrado em B; as células apresentam uma aparência em "calçamento" distinta dessas células epiteliais, conforme mostrado em B. Em figuras subsequentes, a imunomarcação de preparações de citosina de células de explantes e células semeadas em lamínulas revelou que todas as células foram positivas para a citoceratina específica do epitélio. Células bronquiais subcultivadas de humanos, cultivadas até a subconfluência em frascos T 75, são mostradas aqui. Observe a aparência em "calçamento".

Células bronquiais humanas subcultivadas mostraram imunomarcação uniformemente positiva para queratina e E-CAM. A imunomarcação com anticorpos específicos contra outros tipos celulares não mostrou qualquer indicação de contaminação das culturas por fibroblastos, células mesenquimais ou endoteliais. Para mais detalhes, consulte a figura cinco e sua legenda no texto. Células cultivadas em membranas de poliéster permeáveis ou transwell, com ou sem interface líquida, diferenciaram-se em epitélio ciliado, conforme demonstrado aqui. Descarte as células e seus ou transplantes se células com morfologia diferente da demonstrada aqui começarem a aparecer. Neste protocolo, apresentamos métodos detalhados para o cultivo e expansão de células epiteliais brônquicas humanas primárias.

Estudos baseados em células humanas são necessários para determinar as vias importantes dos mecanismos das doenças pulmonares humanas e para triagem de toxicidade e farmacológica de novas drogas. Esperamos que os métodos descritos aqui o incentivem a cultivar células epiteliais brônquicas humanas a partir de explantes e a utilizar essas células em seus sistemas de estudo. Obrigado e boa sorte.