Primárias células epiteliais brônquicas humanas Grown a partir de explantes

Neste artigo, descrevemos um protocolo para crescimento e expansão de células epiteliais brônquicas humanas a partir de segmentos brônquicos humanos recém-isolados. Este protocolo consiste em cinco seções, codificação e arranhões, placas de cultura de cem milímetros, reparo de tecido brônquico, transplantes de tecido brônquico explan, passagem de células epiteliais brônquicas humanas crescendo ciliadas, células epiteliais brônquicas humanas em transwells. Antes de começar, observe que todas as etapas são feitas no gabinete de segurança biológica.

Salvo indicação em contrário, leia a seção de materiais, reagentes e preparação e certifique-se de ter preparado asicamente. A seguinte codificação, cultura de solução de estoque, soluções de dissociação média, revestimento e arranhões. Placas de cultura de cem milímetros devem ser feitas no bst.

Mantenha tudo estéril. Coloque placas de cultura estéreis de cem milímetros e solução de revestimento. Na pipeta BST, dois moinhos de solução de revestimento e uma placa de cem milímetros giram para revestir a base da placa.

Certifique-se de que a solução de revestimento cubra a base da placa uniformemente. Pipete a solução restante e use-a para revestir uma segunda placa de cem milímetros. Repita para quantas placas forem necessárias.

O número de placas necessárias varia com o número de explantes de tecido. Certifique-se de que a solução de revestimento cubra a base das placas uniformemente. Conforme demonstrado.

Cubra os pratos com Suas tampas. Deixe as placas secarem na incubadora por uma a duas horas e aspire a solução de acesso antes de usar Para explicação do tecido brônquico. As placas de cultura revestidas não utilizadas podem ser colocadas em um saco estéril e armazenadas a quatro graus Celsius para mais tarde.

Use uma tesoura limpa, pequena e afiada, bisturi e fórceps com 70% de etanol e traga para as placas revestidas com arranhões BSC pressionando firmemente com o bisturi para formar XS pequenos e profundos pelo menos quatro por placa. Se o arranhão não for profundo o suficiente, os pedaços de tecido não se depositarão nas seringas e flutuarão para fora O BSC coloca o tecido em um prato P três. Enxágue bem o tecido brônquico humano isolado em Bss.

Abra as peças brônquicas. Traga o tecido para o BS e transfira para uma placa de cultura de tecidos estéril de cem milímetros com o chamado DM EM ham F 12 mais 1% de antibiótico antimicótico. Use a tesoura pequena afiada para cortar o tecido em pedaços de dois a três milímetros de cubo.

Coloque um pedaço de tecido cortado no centro de cada X com uma pinça e pressione. Deixe suavemente os pedaços de tecido ou explantes X aderirem à placa por alguns segundos. E, em seguida, adicione suavemente 10 mils de mídia completa Se o tecido flutuar Depois de adicionar mídia, use uma pinça para empurrar o tecido para as cristas do X ou faça um novo X.It pode ser necessário fazer novos Xs se as cristas não forem profundas o suficiente.

Coloque as placas na incubadora e troque o meio a cada três ou quatro dias em que os tecidos estejam prontos para o transplante. Quando células epiteliais suficientes cresceram ao redor dos tecidos para cobrir áreas de um a dois centímetros, isso leva aproximadamente quatro semanas. Use cem milímetros revestidos E placas riscadas.

Uma vez que alguns explanação de tecido podem não ser bem-sucedidos. O número de placas depende de quantos pedaços de tecido você está transplantando. Se você estiver usando placas que foram previamente revestidas e armazenadas a quatro graus Celsius, leve à temperatura ambiente antes de usar uma pinça Usando uma pinça, pegue cuidadosamente o tecido da placa original e coloque no centro do eixo na nova placa e pressione suavemente Os tecidos sem crescimento devem ser descartados.

Deixe o tecido aderir à placa. Por alguns segundos, adicione mídia e incuba. Adicione descrito anteriormente para X explan.

Portanto, dois mils de viagens e solução de estoque de EDTA para cada placa de cultura de tecidos de cem milímetros. Diluir o estoque com seis mils de esteril 0,01 molar PBS e dois mils de solução estoque para seis mils PBS para uma concentração final de tripsina a dois 50 microgramas por mil e para EDTA a cem microgramas por mil. Depois de mover os explantes para uma nova placa, aspire o meio das placas com anéis de célula de um a dois centímetros.

Adicione oito mils de gotas diluídas quentes e edt uma solução para cada placa de cem milímetros. E coloque uma incubadora a 37 graus Celsius por três a 15 minutos. Verifique com frequência.

Deixar a tripsina por muito tempo danificará as células. Verifique as placas sob um microscópio para ter certeza de que a maioria das células foi levantada, as células serão arredondadas para cima e se desprenderão conforme mostrado a oito Mils de calor. 10% FBS em mídia por placa para inativar a solução EDT em uma solução.

Combine volumes de todas as placas em um tubo ou tubos separados de tecidos diferentes. Conte as células usando uma centrífuga Hema Cytometer a cem G por cinco minutos. Um pellet celular se formará na base do tubo ressuspendendo o pellet celular em meio completo até a concentração celular desejada.

Colocar cada um a 3 milhões de células por balão T 75 e adicionar meios completos conforme necessário. Incubar e alterar o meio. A cada três a quatro semanas, as células crescem até a subconfluência em frascos D 75.

Em cerca de quatro semanas, as células devem ser levantadas e expandidas ou usadas na subconfluência para evitar o sene. Comece preparando as membranas permeáveis dos transpoços. Use as pastilhas de 6,5 milímetros que se encaixam nas placas de 24 poços múltiplos.

Adicione o meio a ambos os lados da membrana. Aponte seis mils na parte inferior e 0,1 mils na parte superior. Incubar uma hora em incubadora de cultura de células.

Remova cuidadosamente o meio de ambos os lados da membrana. Começar com o volume basal primeiro com cuidado significa que a membrana pode ser facilmente danificada. Portanto, pipete o meio pela lateral da inserção de cultura, use o volume recomendado.

Não fazer isso resultará em vazamento de meio para outros poços para as células da semente. Após a pré-incubação do suporte permeável, pipete cuidadosamente sua suspensão celular no lado épico da membrana para poços de 6,5 milímetros a 0,1 mils de suspensão celular no lado épico da membrana. Pipeta 0,6 M, média no lado basal da membrana.

Alimente as células dos lados épico e basal por 10 dias. Estabelecer um intercâmbio cultural bem diferenciado, médio duas vezes por semana. Usando o método demonstrado, remova o volume basal.

Primeiro, substitua o volume epical, adicione 0,6 mils de meio ao lado basal da membrana. Este método promove a ligação celular à membrana e evita que as células sejam expostas ao ar por longos períodos de tempo. Troque a mídia rapidamente e coloque de volta uma incubadora.

Crie uma interface ar-líquido no dia 10 removendo o meio AAL e substituindo os 0,6 mil de meio no lado basal da membrana. Mantenha as células na interface ar-líquido por seis semanas, troque de mídia duas vezes por semana. As células ciliadas começarão a aparecer quatro semanas após a criação da orelha.

Interface líquida. As células alcançarão uma diferenciação uniforme em células ciliadas. Seis semanas após a criação da interface do líquido do ouvido.

Segmentos brônquicos humanos com células epiteliais saudáveis de explanação e transplantes. Em nosso estudo, culturas bem-sucedidas do explane do tecido brônquico ocorreram em oito dos nove tecidos. Quando uma das culturas explanadas foi infectada, os anéis de células epiteliais atingiram um raio de um a dois centímetros em três a quatro semanas.

O explan X bem-sucedido foi cultivado novamente até seis vezes. Todas as culturas bem-sucedidas mostram evidências de migração celular dentro de 48 horas após o início dos transplantes, ou X explan, como mostrado nas células B, tem uma aparência de paralelepípedo distinta para essas células epiteliais, conforme mostrado em B. E nas figuras subsequentes, a coloração imunológica de preparações de citosina de células de explanação e células semeadas em lamínulas revelou que todas as células eram positivas para a citoqueratina específica do epitélio, células brônquicas de subcultura humana cultivadas até subconfluência e frascos T 75 são mostrados aqui. Observe a aparência de paralelepípedos.

As células brônquicas da subcultura humana apresentaram imunomarcação positiva uniforme para querina e a imunomarcação de E.Can he com anticorpos específicos contra outros tipos celulares não mostrou nenhuma indicação de contaminação das culturas por fibroblastos, células mesenquimais ou endoteliais. Para mais detalhes, consulte a figura cinco e sua legenda no texto células cultivadas em membranas de poliéster permeáveis ou transwells com ou interface líquida diferenciada em epitélio ciliado como demonstrado aqui, descartar células e suas ou transplantes se células com uma morfologia diferente conforme demonstrado Aqui começam a aparecer. Neste protocolo, apresentamos métodos detalhados para cultura e expansão de células epiteliais brônquicas humanas primárias.

Estudos baseados em células humanas são necessários para determinar vias importantes dos mecanismos da doença pulmonar humana e para toxicidade e triagem farmacológica de novos medicamentos. Esperamos que os métodos descritos aqui o encorajem a cultivar células epiteliais brônquicas humanas a partir de explantes e a usar essas células em seus sistemas de estudo. Obrigado e boa sorte.