Name: Purificação do M. magneticum Strain AMB-1 proteína associada Magnetosome MamAΔ41 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-25T16:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Aprenda a purificação da proteína MamAΔ41 de Magnetospirillum magneticum AMB-1 usando cromatografia de afinidade, troca iônica e exclusão por tamanho. Este protocolo permite obter proteína pura para estudos de magnetossomos.

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Reconhecemos Dr. Amir Aharoni por seu apoio e Davidov Geula, Noam Grimberg e Chen Guttman para os seus conselhos e comentários.

1. Clonagem e expressão de Mama no Gene E. coli O mutante do gene foi amplificado mamAΔ41 usando a reação em cadeia da polimerase (PCR) de DNA genômico de Magnetospirillum magneticum AMB-1, com primers: 5'-GCATTACGCATATGGACGACATCCGCCAGGTG-3 'e 5'-GCGCGGCAGCCATA-TGGCATACG-3'. Nos fragmentos de DNA amplificado, um site NcoI foi introduzido no códon de iniciação ATG eo códon de terminação foi substituído por um site SCOI. Os fragmentos foram digeridos com NcoI e SacI e clonados no respectivos sites de pET52b (+), dando origem a pET52bMamAΔ41-AMB1. Nesta construção, o gene mamAΔ41 foi fundida em-frame com o 10-Sua tag no C-terminal. O plasmídeo foi electroporated em E. coli estirpe BL21. E. coli estirpe BL21 abrigar pET52bMamAΔ41 foi cultivado em auto-indução (15) meio contendo ampicilina (50 mg / ml) 310 ° K por 3 horas. A temperatura de cultivo foi então deslocada de 310 ° a 300 ° K e mantido por um adicional de 48 h, a 300 ° K. As células foram colhidas por centrifugação a 5465g por 10 minutos a 277 ° K. 8 cultura de litros produzidos 60 gramas de pellet celular molhado. 2. Os cálculos de bioinformática Cálculos de peso molecular (MW), de acordo com a seqüência de aminoácidos ea absorção previsto de 1mg/1ml de proteína em 280nm, utilizando o servidor ProtParam (http://www.expasy.ch/tools/protparam.html). Para 10His-Tag-MamAΔ41 o MW é 22529 Da (240 aminoácidos) e para MamAΔ41 (com 9 aminoácidos esquerda após sua remoção por tag-trombina) o Mw é 20596.5Da (187 aminoácidos). A absorção previsto de 1mg/1ml de proteína em 280nm para 10His-Tag-MamAΔ41 é 0,595 e para MamAΔ41 é 0,579. Além disso, a seqüência de aminoácidos não contém resíduos de cisteína. Portanto, agentes redutores não são necessários durante o processo de purificação. 3. Purificação da MamAΔ41 <ol><li> Para a preparação de solução estoque, pesar e preparar (200 ml cada) nas seguintes concentrações: Imidazol (MW 228,2 g / mol) solução 4M, NaCl (Mw 58,44 g / mol) solução 5M, Tris-HCl (Mw 121,3 g / mol ) solução 1M, ajustar o pH = 8. Adicionar água destilada duas vezes (DDW) e misture usando um vortex até que a solução é clara. Soluções de filtro com filtro 0.22μm e manter em temperatura ambiente. </li><li> Prepare e filtrar 6 buffers frescos a partir de soluções estoque (Tabela 1). </li><li> Diluir e suspender as células em tampão Um volume em 1:2 ratio, gramas de células para buffer (ml). </li><li> Adicionar 10μl para cada 10gr de bactérias de DNase I (1 mg / ml) a fim de quebrar fragmentos de DNA na amostra. Adicionar 1 ml para cada 20gr de bactérias de EDTA coquetel inibidor de protease livre. Incubar por 20 min no gelo. </li><li> Interrompido células por dois ciclos de imprensa francesa a 25.000 psi. Ao contrário de sonicação, a imprensa francesa tem como objetivo em alto volume (10ml&gt;) extrusão de células, forçando as células sob alta pressão através de um orifício fino. O pistão deve ser resfriado em gelo por 10 minutos antes do seu uso e de montagem devido ao acúmulo de temperatura. </li><li> Transferência de células lisadas em tubos de ultracentrífuga 25ml e equilibrá-los com precisão (50mg) com tampão A até que a amostra atinge a linha de tubo s pescoço. </li><li> Restos celulares separado por centrifugação a 270.000 g Ultra por 1 hora a 277 ° K. </li><li> Prepare um caseiro gravidade Ni coluna NTA (2,5 cm de diâmetro), adicionando 4 ml de Ni NTA, que são preserva em etanol 20%, na coluna. Deixe o líquido cair completamente, em seguida, lavar com 40 ml de DDW e deixe o líquido cair completamente. Pré-equilibrada a resina na coluna com 40 ml de tampão A. </li><li> Aplicar a fração solúvel de ultra-centrifugação de tubos sobre a gravidade coluna NTA Ni. Deixe o líquido cair, recolher flow-through (proteínas não ligada) e preservar a 277k. </li><li> Coletar amostra de pellet dos tubos de ultracentrifugação usando uma pequena dica para acabar com o pellet. Misture a ponta em 50μl de 5% β-mercaptoetanol em SDS-PAGE 2X tampão de amostra. </li><li> Lavar a coluna com 100 ml de tampão B. Deixe a queda de líquidos, coleta de fluxo e preservar a 277k. </li><li> Prepare 15 tubos eppendorf marcados (1,5 ml). </li><li> Eluição - Válvula coluna próxima e então carregar 1ml de tampão C na coluna; incubar por 3 min seguido de abertura da válvula ea vazão através da recolha. Repita este passo três vezes. </li><li> Eluir resto de suspensão de 1 ml incrementos tampão C e fechar a válvula. </li><li> OD medida em 280nm das frações e avaliar localização do pico de proteína, se o OD ainda é&gt; 0,3, as amostras adicionais são necessários. </li><li> SDS-PAGE análise das frações coletadas. Tal análise deve ser realizada também com os exemplos a seguir, as proteínas unbound flow-through, lavagem de fluxo e ultra-centrifugação da amostra de sedimento. Mix 10μl de cada amostra com 10μl de 5% β-mercaptoetanol em SDS-PAGE 2X tampão de amostra. Coloque as amostras em 15% SDS-PAGE e correr por 45 min em 180 Volts. </li><li> Manchar o gel em 15 ml de solução InstantBlue, agitar durante 1 hora. Certifique-se que a caixa de plástico é coberto e protegido da luz. </li><li> Avaliar gel, se a expressão da proteína é elevado e específico de acordo com as faixas indicativas, mesclagem selecionado frações eluídas. </li><li> A fim de remover 10-Seu-tag, adicionar trombina bovina (10 unidades / mL), 10μl de trombina por 1 mg de proteína, de acordo com a recomendação do fabricante para a amostra combinada. </li><li> A diálise é utilizada para a remoção de excesso de Imidazol e para diminuir as concentrações de NaCl para os níveis necessários durante a ligação de íons de câmbio. Para diálise, corte comprimento desejado, de 7 de peso molecular de corte kD (MWCO) tubos de diálise. Lavar com DDW e faça um nó em uma extremidade (ou selo com clipes). Transferência de solução de proteína fundiram no saco, deixando algum espaço na parte superior e grampo para cima. </li><li> Tubo de submergir a diálise em 4 tampão de diálise Litros refrigerados (buffer D). Agitar a solução lentamente durante a noite com 277 ° K. </li><li> Tire o tubo de diálise do copo, faça um pequeno corte e transferência da proteína para 50ml tubo. </li><li> Cromatografia de troca iônica: montar pré-embalados MonoQ 4.6/100 coluna PE em Cromatografia Rápida Desempenho líquido (FPLC). Lavar a coluna com 5 volumes coluna (CV) de água filtrada DDW. A coluna equilibrada com 5 CV de tampão D. </li><li> Lavar o loop de injeção com DDW (dois volumes loop) e repita com tampão D. Load a proteína no circuito de injeção. </li><li> Injectar a amostra de proteínas (vazão de 1 ml / min) e iniciar a coleta de frações de SDS-PAGE detecção de proteínas sem limites. </li><li> Se o volume inicial de proteína (passo 3.23) é maior do ciclo de injeção, repita os passos de 3,25-3,26, sem lavar o loop, até que toda a amostra é carregada na coluna. </li><li> Lavar a coluna com 3 CV de tampão C, a fim de eliminar as proteínas sem limites. </li><li> Eluir a proteína com um gradiente linear de 60 min 40 2000mm NaCl entre buffers D &amp; E (E quando buffer de 100% é o fim do gradiente), o fluxo de taxa de 1 ml / min (embora maiores taxas de fluxo pode ser usado no custo de volumes maiores, mas menos concentrado picos, proteína). Coletar picos de proteínas como eles aparecem no cromatograma 280nm. </li><li> Coluna de pré-embalados de acordo limpa para a fabricação de recomendação. </li><li> SDS-PAGE análise das frações coletadas. Tal análise deve ser realizada com as seguintes amostras, as proteínas ilimitada de fluxo e proteína picos de fluxo contínuo. Executar o SDS-PAGE e mancha como falar em passos de 3,17-3,18. </li><li> Avaliar gel para a existência de bandas de proteínas na Mw previsto de acordo com a proteína marcador pré-manchado. Mesclar frações de eluição selecionadas que contêm a proteína em questão. </li><li> Diálise das amostras fundidas, a fim de reduzir as concentrações de NaCl necessária para cromatografia por exclusão de tamanho. Realizar a diálise, como mencionado nos passos 3,21-3,23 contra tampão F. </li><li> Concentrar a amostra de proteína usando um Vivaspin-15 10000 MWCO a 8 mg / ml em uma centrífuga de mesa, 4000 rpm. Validar concentração desejo medindo OD em 280nm em cubetas de quartzo. Se a proteína é muito concentrada diluir com tampão F e medir novamente. </li><li> Montar tamanho exclusão coluna pré-embalados, HiLoad 26/60 Superdex 200, em FPLC; lavar a coluna com 3 CV de água filtrada DDW. A coluna equilibrada com 3 CV de tampão F. </li><li> Lavar ciclo de injeção com 5ml DDW (dois volumes loop) seguiu pelo mesmo volume com tampão F. Não coloque mais de 4 ml da amostra de proteína no ciclo de injeção. </li><li> Injectar a amostra de proteínas (vazão de 3,5 ml / min) e iniciar a coleta de frações de proteínas de pico como eles aparecem se o cromatograma 280nm. Deixe o fluxo de buffer até atingir o volume da coluna. </li><li> Se o volume inicial de proteína (passo 3.23) é maior do ciclo de injeção, repita os passos de 3,25-3,26, sem lavar o loop, até que toda a amostra é carregada na coluna. </li><li> Coluna de pré-embalados limpo de acordo com a recomendação de fabricação. </li><li> SDS-PAGE análise das frações coletadas. Tal análise deve ser realizada com picos nas amostras de proteínas. Executar o SDS-PAGE e mancha como falar em passos de 3,17-3,18. </li><li> Avaliar gel: se picos de proteínas são específicas, na Mw correta previsto de acordo com a proteína marcador pré-coradas e apenas uma banda é visível mesclagem selecionado frações eluídas da proteína em questão. </li><li> Concentre-se amostra de proteína usando um Vivaspin-15 10000 MWCO a&gt; 20 mg / ml em uma centrífuga de mesa, 4000 rpm. Validar concentração desejo medindo OD em 280nm. O MamAΔ41 purificada foi então concentrada a 26,5 mg / ml para a cristalização. </li> &lt;li&gt; Confirme a pureza da amostra e identificação de proteínas usando Matrix-assisted laser de dessorção / ionização (MALDI-TOF). <li> Se a proteína é purificada de acordo com o espectrômetro de massa e SDS-PAGE, divida o MamAΔ41 concentrado para tubos eppendorf pré-marcada, 25-50μl de proteína em cada um. </li><li> Flash congelados em nitrogênio líquido e armazenar a 193 ° K. </li></ol> 4. Resultados representante Quando este protocolo é feito corretamente deve-se altamente purificado, tamanho amostras de proteína homogênea e concentrada. Estas amostras de proteínas são, então, pronto para ensaios de cristalização, bem como estudos bioquímicos, tais como cinética enzimática, afinidade de ligação e muito mais. Aqui descritos são resultados representativos dos principais passos no protocolo de purificação. SDS-PAGE análise do perfil de eluição de Ni-NTA coluna de afinidade deve revelar muito mais proteína expressa na fração solúvel em MW apropriado de ~ 22kDa (Figura 1). Esta análise SDS-PAGE deve também revelar mínimo, se qualquer proteína nas proteínas ilimitada de fluxo, lavagem de fluxo e ultra-centrifugação da amostra de sedimento. Se grandes bandas da proteína apropriada aparecem nestas amostras deve-se considerar a preparação de buffer errado, problemas no rompimento celular ou problemas na cultura de auto-indução condições e crescimento. Cromatografia de troca iônica é pré-formados a fim de separar entre o nosso proteína desejável outras proteínas E.coli que estavam vinculados à resina de níquel (devido a interações eletrostáticas ou histidina / negativo aminoácidos loops ricos em proteínas) e proteína His-Tagged uncut desejável. Esta coluna separa proteínas de acordo com a afinidade de ligação à resina com carga positiva no aumento da concentração de NaCl. Proteína altamente carregadas negativamente vai eluir em maiores concentrações de NaCl appose para moderar os com carga negativa. As vantagens desta coluna são de alta vazão e capacidade de ligação. O cromatograma de troca iônica (Figura 2) revela uma boa separação entre 3 populações proteínas no aumento da concentração de NaCl. SDS-PAGE análise é necessária a fim de determinar MW de cada população, isolando a uma desejável e avaliar se as etapas de purificação que são necessários mais. A primeira população é MamAΔ41 (~ 20 kDa), enquanto a segunda população é MamAΔ41 + Tag His (~ 22kDa) que não foi clivada pela trombina bovina e à terceira população é indetectável no SDS-PAGE, devido à baixa concentração. Se os picos de proteínas não são claramente separados deve-se considerar a preparação de buffer errado ou alterar a inclinação do gradiente de NaCl. Cromatografia por exclusão de tamanho é pré-formados a fim de separar entre o nosso proteína desejável a outras proteínas de células E. coli que foram ligados à resina Ni-NTA e não foram separados durante a cromatografia de troca iônica. Esta coluna separa proteínas de acordo com seu tamanho. Grandes proteínas vai eluir em menores volumes de eluição oposição a pequenos que serão eluídos em volumes maiores. O cromatograma coluna (Figura 3) revela uma boa separação da proteína desejável como uma população principal. A população parece eluir no tamanho apropriado com um monômero MW de ~ 20 kDa. A presença de ~ 80 kDa banda (E.coli proteína típica que se liga Ni-NTA) é detectado em SDS-PAGE antes de carregá-coluna e desaparece durante essa rodada. Desde que a concentração desta proteína kDa ~ 80 é baixo, para começar, a sua população não aparece no cromatograma, devido à sua diluição e SDS-PAGE análise é necessária para determinar a eficiência de purificação. Recomendamos o carregamento de uma amostra diluída e concentrada do pico principal do SDS-PAGE para um certamente poderia determinar a presença de uma proteína pura no MW apropriado. Por esta fase, a proteína é purificada e sua homogeneidade deve ser avaliada por MALDI-TOF. Esta análise revelou uma proteína de 20.347 MW e outra em Da Mw de 10176 Da (Figura 4). O ~ proteína de 10 kDa é o ~ proteína kDa 20 dobrou cobrado. O MW previsto de MamAΔ41 com os 9 aminoácidos esquerda após sua Tag-remoção foi 20596,5 Da. Comparando-o com o obtido MALDI-TOF MW descobrimos que eles são 248 Da distante. Essa diferença pode ser resultado de erros MALDI-TOF medição e / ou devido à degradação comum do metionina primeiro eo segundo glicina. Para concluir, a proteína é altamente purificada e pode ser utilizado nos experimentos posteriores. <img src="/files/ftp_upload/1844/1844table.jpg" alt="Tabela 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabela 1"> Tabela 1. Formulações Buffer. <img src="/files/ftp_upload/1844/1844fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Representante análise SDS-PAGE de Ni-NTA purificação coluna Da direita para a esquerda;. P-ultra-centrifugação pellet (3.11 passo protocol), W-lavagem (3,12 etapa protocol), U-unbounded proteínas (3.10 passo protocol), E- cinco pistas de eluição samples (3,14 etapa protocol), M - marcador de proteína (números indicam MW). Seta indica MamAΔ41. <img src="/files/ftp_upload/1844/1844fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Análise de cromatografia de troca iônica etapa (a) de troca iónica cromatograma (coluna MonoQ); Blue - 280nm absorção, representa a concentração de proteína, Green-concentração de NaCl, Vermelho - indicação das frações coletadas. (B) Representante análise SDS-PAGE da etapa de purificação de troca iônica. Da esquerda para a direita; M - marcador de proteína (números indicam Mw), A6 - fração primeiro pico, segundo A8-fração de pico. <img src="/files/ftp_upload/1844/1844fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Tamanho análise de cromatografia de exclusão (a) a exclusão Tamanho (Superdex coluna 200) cromatograma; Blue - 280nm absorção, representa a concentração de proteína, a indicação Red das frações coletadas. (B) Representante análise SDS-PAGE do tamanho do passo de purificação de exclusão. Da esquerda para a direita; proteína M-marcador (números indicam MW), Prei pré-injeção de amostra, A4-6 fração combinada coletados a partir do primeiro pico, A4-6D-diluído fracção recolhida, a partir do pico. <img src="/files/ftp_upload/1844/1844fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Matrix-assisted laser de dessorção / ionização (MALDI-TOF) espectro de massa de purificada MamAΔ41. A matriz é o ácido Sinapic (SA). MamAΔ41 mostrado em 20347 Da, também mostrado é a espécie dobrou acusado de MamAΔ41 em 10176 Da.

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Purificação de proteínas é o passo principal em todas as proteínas estruturais ou estudos bioquímicos. Uma vez que cada proteína é o único com seu próprio comportamento, é preciso definir suas propriedades e modificar sua purificação de acordo. Proteína-alvo deve ser analisado como um primeiro passo para a purificação utilizando ferramentas de bioinformática. Eles são usados ​​para calcular o objectivo ponto iso-elétrico, avaliar a sua necessidade de redução / oxidação ambiente e sua necessidade de íons especiais / liga...

<table><tbody><tr><td>Prensa Francesa</td><td>Equipamento</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>FA-078A</td><td></td></tr><tr><td>Célula de pressão</td><td>Equipamento</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>FA-032</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrífuga</td><td>Equipamento</td><td>Sorvall, Thermo Scientific</td><td>Discovery 90SE</td><td></td></tr><tr><td>Rotor</td><td>Equipamento</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>Ti60</td><td></td></tr><tr><td>Tubos para ultracentrifugação; Frasco com tampa PC – Ensaio 26,3 ml</td><td>Equipamento</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>BC-355618</td><td></td></tr><tr><td>Colunas cromatográficas de vidro Econo-Column, diâmetro de 2,5 cm</td><td>Equipamento</td><td>Bio-Rad</td><td>737-2521</td><td></td></tr><tr><td>Resina Ni-NTA His Bind</td><td>Equipamento</td><td>Novagen, EMD Millipore</td><td>M0063428</td><td></td></tr><tr><td>Espetrofotômetro</td><td>Equipamento</td><td>Amersham</td><td>Ultraspec 2100 pro</td><td></td></tr><tr><td>Cubeta de quartzo</td><td>Equipamento</td><td>Hellma</td><td>104-QS</td><td></td></tr><tr><td>Cromatografia Líquida de Alta Performance – AKTA purifier 10</td><td>Equipamento</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4062-64</td><td></td></tr><tr><td>Coluna de troca iônica &amp;#8211; MonoQ 4,6/100 PE</td><td>Equipamento</td><td>GE Healthcare</td><td>10025543</td><td></td></tr><tr><td>Coluna pré-embalada de exclusão por tamanho – HiLoad 26/60 Superdex 200</td><td>Equipamento</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1071-01</td><td></td></tr><tr><td>Centricon – Vivaspin15 &amp;#8211; 10.000 MWCO</td><td>Equipamento</td><td>Sartorius AG</td><td>VS1501</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de bancada</td><td>Equipamento</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>IEC CL30R</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF</td><td>Equipamento</td><td>Bruker Corporation</td><td>Reflex IV</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (hidroximetil) aminometano</td><td>Reagente</td><td>BioLab</td><td>20092391</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Reagente</td><td>FRUTROM</td><td>235553470</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Reagente</td><td>Alfa Aesar</td><td>288-32-4</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail de inibidores de protease sem EDTA</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8849</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I (Deoxirribonuclease I)</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN-25</td><td></td></tr><tr><td>Trombina bovina</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP25432</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Reagente</td><td>BioLab</td><td>07132391</td><td></td></tr><tr><td>Dodecilsulfato de sódio (SDS)</td><td>Reagente</td><td>BioLab</td><td>19822391</td><td></td></tr><tr><td>Beta-mercapto&amp;#8211;etanol</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-3148</td><td></td></tr><tr><td>InstantBlue</td><td>Reagente</td><td>Expedeon</td><td>1SB01L</td><td></td></tr><tr><td>Escada de proteínas pré-colorida PageRuler</td><td>Reagente</td><td>Fermentas</td><td>SM0671</td><td></td></tr></tbody></table>

purificação do m. magneticum strain amb-1 proteína associada magnetosome mamaΔ41

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Bactérias magnetotáticas compreendem um grupo diverso de microorganismos aquáticos que são capazes de se orientar ao longo campos geomagnético. Este comportamento é acreditado para ajudar sua busca por ambientes adequados<em&gt; (1)</em&gt;. Esta capacidade é conferida pelo magnetosome, uma organela subcelulares que consiste de um conjunto linear de cadeia de lipídios vesículas cada um capaz de biomineralize e juntar um cristal ~ 50 nm de magnetita ou greigite. Um componente princípio da magnetosome que mostrou-se necessário para a formação de vesículas funcional é mamãe. Mama é uma proteína muito abundantes magnetosome-associados, que é um dos mais caracterizados magnetosome proteínas associadas<em&gt; In vivo</em&gt;<em&gt; (2-6)</em&gt;. Este artigo incide sobre a purificação da Mama, que apesar de ser estudado<em&gt; In vivo</em&gt;, Sem detalhes claros funcionais ou estruturais têm sido identificados por ele. Bioinformática análise sugeriu que mamãe é uma repetição tetra-tricopeptide (TPR), contendo proteína. TPR é um motivo estrutural encontrada como parte ou como formação de uma grande dobra em uma ampla gama de proteínas, ela serve como um modelo para interações proteína-proteína e proteína-mediador de vários complexos<em&gt; (7)</em&gt;. TPRs estão envolvidos em muitas tarefas cruciais nos processos de célula eucariótica organela e muitos caminhos bacteriana<em&gt; (8-14).</em&gt; Para entender Mama, um TPR única contendo proteína, proteína altamente purificada é necessária como um primeiro passo. Neste artigo, apresentamos o protocolo de purificação para um estábulo Mama exclusão mutante (MamAΔ41) de<em&gt; M. magneticum</em&gt; AMB-1.

Mama é uma proteína Magnetosome único associado que foi mostrado para ser envolvido na ativação magnetosome. Aqui apresentamos o protocolo de purificação da Mama exclusão mutante (MamAΔ41) de<em&gt; M. magneticum</em&gt; AMB-1.

Purificação do M. magneticum Strain AMB-1 proteína associada Magnetosome MamAΔ41

Bactérias magnetotáticas compreendem um grupo diversificado de microrganismos aquáticos que são capazes de se orientar ao longo de campos geomagnéticos. Este comportamento é ...

O processo de purificação começa com pellets celulares expressando a proteína recombinante Mame. Delta 41. A disruptura da membrana celular é seguida pela separação da fração solúvel e insolúvel. Para extrair a proteína recombinante solúvel, a cromatografia de afinidade separa a proteína recombinante marcada de outras proteínas celulares.A cromatografia de troca iônica separa a mamma Delta 41 de outras proteínas celulares que permanecem após a cromatografia de exclusão por tamanho e afinidade. A cromatografia separa ainda mais a mamma Delta 41 e revela seu estado oligomérico. Por fim, analisa-se a pureza e homogeneidade da proteína recombinante.Olá, eu sou Raza, chefe do Laboratório XVA do Departamento de Ciências da Vida da Universidade Benon do Negativo. Eu sou Natalie, também do Laboratório Z. Hoje vamos mostrar um procedimento para purificação de proteínas recombinantes.Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar proteínas associadas ao magnetismo. Então, vamos começar. No início deste protocolo, a proteína MAME Delta 41 é expressa como uma proteína de fusão com 10 histidinas.Em células BL21 de E. coli, cultive as células em meio de indução automática contendo Epi Brasilina a 310 K durante três horas. Em seguida, reduza a temperatura de cultivo para 300 K e deixe as células incubarem por 48 horas. Após a incubação, recolha as células por centrifugação, remova o sobrenadante por decantação e pese o pellet celular resultante.Oito litros de cultura devem produzir cerca de 60 gramas de pellet celular úmido. Antes da purificação da proteína, prepare soluções de 200 mililitros de tampão com quatro molar de ile, cinco molar de cloreto de sódio e um molar de tris H-C-L-P-H 8.Usando água destilada duplamente ou DDW, vortexe as soluções até ficarem límpidas e filtre-as com um filtro de 0,22 micrômetro. Filtre as soluções estoque recém-preparadas e os tampões A a F conforme descrito no protocolo escrito que acompanha este vídeo. Para iniciar a purificação da proteína, re-suspenda as células no tampão A em uma proporção de um para dois entre massa celular e volume de tampão.Para cada 10 gramas de bactérias, adicione 10 microlitros de dna, um para digerir quaisquer fragmentos de DNA na amostra. Em seguida, adicione um mililitro de E dt, um coquetel livre de inibidores de protease. Para cada 20 gramas de bactérias, incube a solução por 20 minutos em gelo.Após a incubação, lise as células com dois ciclos de prensa francesa a 25.000 PSI. Devido ao acúmulo de temperatura, o pistão deve ser resfriado em gelo por 10 minutos antes do uso. Transfira as células lisadas para tubos de ultracentrífuga de 25 mililitros.Encha os tubos até a linha do gargalo com o tamp&atilde;o A e equilibre-os com precis&atilde;o. Em seguida, separe os detritos celulares por ultracentrifugac&atilde;o. Enquanto isso, monte uma coluna de gravidade de n&iacute;quel NTA adicionando quatro mililitros de resina de n&iacute;quel NTA a uma coluna de vidro de 2,5 cent&iacute;metros.Prepare a resina para a purificação de proteínas de acordo com as instruções do fabricante e de S. Após a centrifugação das amostras, despeje a fração solúvel dos tubos de ultracentrifugação sobre a coluna de níquel NTA. Colete as proteínas não ligadas na fração do fluxo passante.Continue lavando a coluna com 100 mililitros do tampão B e colete o fluxo que passa. Preserve as frações do fluxo que passa a 277 K. Elua a proteína em 15 tubos einor de 1,5 mililitro numerados. Feche a válvula da coluna e adicione um mililitro do tampão C à coluna.Após um tempo de incubação de três minutos, abra a válvula e colete o fluxo que passa. Repita este passo três vezes. Continue a eluir a proteína em incrementos de um mililitro de tampão sem a incubação de três minutos.Utilizando um espectrofotômetro de UV, localize o pico de proteína nas frações medindo a densidade óptica a 280 nanômetros. Por fim, realize uma análise por eletroforese em gel de SDS das frações coletadas. A proteína não ligada passa pelo lavado, pelo fluxo de passagem e por uma amostra de pellet de ultracentrifugação proveniente do gel.Determine quais frações eluídas apresentam altos níveis de proteína e reúna as frações selecionadas. Para remover a marcação de 10 his, adicione 10 microlitros de trombina bovina por um miligrama de proteína à amostra combinada. Em seguida, diализar a amostra contra o tampão D para remover o excesso de inmidol e reduzir a concentração de cloreto de sódio.Em preparação para a cromatografia de troca iônica, corte o comprimento desejado de tubo de diálise com corte de peso molecular de sete quilodaltons. Lave o tubo com água desionizada e destilada (DDW) e forme uma bolsa fazendo um nó em uma extremidade. Transfira a solução proteica digerida pela trombina para a bolsa, deixando um espaço na parte superior. Feche o tubo de diálise com uma braçadeira.Submerja o tubo de diálise em quatro litros de tampão D resfriado. Agite a solução lentamente durante a noite a 277 K; após a diálise noturna, remova o tubo do béquer. Faça um pequeno corte e transfira a proteína para um tubo Falcon de 50 mililitros. A cromatografia de troca iônica é utilizada para purificar ainda mais a proteína memay Delta 41. Conecte uma coluna pré-empacotada mono Q4 0,6 100 PE a um sistema purificador FPLC ACTA.Lave a coluna com cinco volumes da coluna (VC) de água destilada filtrada e equilibre a coluna com cinco VC do tampão D. Lave o loop de injeção com dois volumes do loop de água destilada seguidos por dois volumes do loop do tampão D. Carregue a proteína no loop de injeção. Injete a amostra de proteína a uma taxa de fluxo de um mililitro por minuto e comece a coletar frações. Essas frações serão usadas para a detecção por eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) de proteínas não ligadas.Continue carregando e injetando a proteína até que toda a amostra seja aplicada na coluna. Lave a coluna com três volumes totais de tampão D. Para remover quaisquer proteínas não ligadas, elua a proteína ao longo de 60 minutos a um fluxo de um mililitro por minuto, utilizando um gradiente linear de cloreto de sódio iniciando em 40 milimolar e terminando em dois molar. Colete os picos de proteína conforme aparecem no cromatograma a 280 nanômetros após atingir 100% do tampão E.Limpe a coluna prepec de acordo com a recomendação do fabricante. Realize análise por eletroforese SDS-PAGE das frações coletadas por FPLC, incluindo a proteína não ligada e o fluxo da fração com pico proteico, utilizando marcadores pré-coloridos. Avalie as bandas proteicas para identificar as frações que contêm a proteína no peso molecular previsto para Mame.Frações Delta 41 são reunidas em preparação para a cromatografia de exclusão por tamanho. A concentração de cloreto de sódio das amostras reunidas é reduzida por diálise, conforme descrito anteriormente, contra o tampão f. Após a diálise noturna.Utilize uma centrífuga de bancada para concentrar a amostra proteica usando um concentrador centrífugo com corte de peso molecular de 10.000. Concentre a proteína até oito miligramas por mililitro a 4.000 RPM. Valide a concentração desejada medindo a OD a 280 nanômetros em uma cubeta de quartzo.Monte a coluna pré-embalada de exclusão por tamanho high load 26 60 superdeck 200 em um sistema purificador FPLC ACTO. Lave a coluna com três volumes da coluna de água filtrada e equilibre a coluna com três volumes da coluna do tampão F. Lave o loop de injeção com dois volumes do loop de água desionizada (DDW), seguidos pelo mesmo volume do tampão F. Uma vez que o FPLC tenha sido lavado e equilibrado, carregue a amostra proteica no loop de injeção. Injete a amostra proteica e comece a coletar as frações do pico proteico conforme elas aparecem no cromatograma a 280 nanômetros.Deixe o tampão fluir até atingir o volume de vazão da coluna. Limpe a coluna pré-embalada de acordo com a recomendação do fabricante. Realize a análise por eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS das frações coletadas e avalie o gel.A proteína deve aparecer no peso molecular previsto correto de acordo com o marcador de peso molecular e apenas uma banda deve ser visível. Combine as frações de proteína pura e concentre a amostra de proteína para mais de 20 miligramas por mililitro utilizando um concentrador centrífugo com corte de peso molecular de 10.000 e uma centrífuga de bancada. Valide a concentração desejada medindo a OD a 280 nanômetros.Confirme a pureza e identidade da amostra de MAME delta 41 utilizando espectrometria de massas por dessorção/ionização a laser com matriz assistida (MALDI-TOF). Por fim, divida a proteína MAME delta 41 concentrada e purificada em tubos eppendorf pré-marcados, com volume de 25 a 50 microlitros cada. A amostra pode ser congelada rapidamente em nitrogênio líquido e armazenada a 193 K. Este protocolo deve resultar em uma amostra altamente pura e homogênea em tamanho da proteína MAME Delta 41. A análise em gel de SDS-PAGE do perfil de eluição da coluna de níquel-NTA revela altos níveis da proteína MAME delta 41 com marcação de 10 histidinas nas frações de eluição, com massa aproximada de 22 quilodaltons.A análise por eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de dodecil sulfato de sódio também revelará qualquer proteína MAME Delta 41 nas frações de proteína não ligada do lavado, do fluxo passante e da amostra do pellet da ultracentrifugação. Se bandas grandes em torno de 22 quilodaltons aparecerem nessas amostras, será necessário realizar o diagnóstico de problemas. A cromatografia de troca iônica é realizada para separar a proteína MAME Delta 41 de outras proteínas na amostra por meio de troca iônica.Com concentrações crescentes de cloreto de sódio, o cromatograma de troca iônica revela boa separação entre duas populações de proteínas sob aumento da concentração de cloreto de sódio. A análise de concentração das amostras por eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) revela o peso molecular de cada população. O primeiro pico é o MAME delta 41, enquanto o segundo pico corresponde à proteína MAME delta 41 10 hiss que não foi clivada pela trombina bovina.Se a cromatografia de troca iônica não resultar em picos de proteína completamente resolvidos, solucione problemas na preparação do tampão e na inclinação do gradiente de cloreto de sódio. O passo final da purificação do MAME delta 41 é a cromatografia de exclusão por tamanho. O cromatograma revela um único pico eluindo em 20 quilodaltons.O tamanho apropriado do monômero da proteína MAME Delta 41 é analisado por MALDI-TOF para verificar a proteína MAME delta 41 purificada. Essa análise revela duas espécies, uma representando a proteína carregada simplesmente com 20.347 Daltons e a outra representando a proteína duplamente carregada com 10.176 Daltons. O peso molecular previsto para a proteína recombinante MAME delta 41 após a remoção da marcação por histidina é de 20.597 Daltons.A pequena diferença de 250 Daltons pode ser devida à degradação comum da primeira metionina na segunda glicina. Os resultados revelam uma proteína MAME delta 41 altamente purificada. Ela pode ser utilizada para experimentos posteriores.Acabamos de mostrar como purificar uma proteína recombinante de sílaba. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de ajustar os tampões à sua proteína específica e executar esses experimentos o mais rapidamente possível. Assim sendo, é isso.Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

purification-m-magneticum-strain-amb-1-magnetosome-associated-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

O vídeo explica uma maneira de purificar as células B por direcionamento imunomagnético e separação da suspensão de células mononucleares do sangue periférico. O método envolve a marcação de tipos de células indesejadas com anticorpos ou ligantes específicos (ligados a partículas magnéticas) direcionados a proteínas específicas da superfície celular, a serem esgotadas da suspensão celular heterogênea por separação magnética.

Seleção Imunomagnética Negativa: Um Método para Purificar Células B de Células Mononucleares do Sangue Periférico

Neste vídeo, demonstramos um procedimento para isolar exossomos de biofluidos alvo usando microesferas magnéticas. O procedimento permite a captura rápida de exossomos, que podem ser usados para análise a jusante.

Extração de exossomos baseada em esferas magnéticas: uma técnica para isolar exossomos específicos de biofluidos

Neste vídeo, descrevemos um protocolo para isolar células CD11b, incluindo microglia, de cérebros de filhotes de camundongos usando classificação de células ativadas por magnetismo. Os tecidos cerebrais são homogeneizados para obter suspensões unicelulares, que são incubadas com microesferas revestidas com anticorpos anti-CD11b, seguidas por uma separação baseada em coluna magnética para purificar a população de células CD11b+.

Isolamento magnético de microglia de cérebros de filhotes de camundongos

Nós demonstramos um método para recolher bactérias magnetotáticas (MTB), que podem ser aplicadas para águas naturais. MTB podem ser isolados e enriquecidos a partir de amostras de sedimento utilizando uma configuração relativamente simples que aproveita magnetismo da bactéria natural. Isolado MTB pode então ser analisada em detalhe utilizando luz e microscopia eletrônica.

Isolamento, coleta e Enriquecimento de bactérias naturais magnetotáticas do Meio Ambiente

Este procedimento ilustra como isolar a partir do cérebro do rato adulto membranas mitocôndrias associadas ER ou mams e as fracções enriquecidas glicoesfingolipídeos-microdomínio de MAMs e preparações mitocondriais.

Mitocôndrias associadas Membranas ER (MAMs) e glicoesfingolipídeos microdomínios enriquecidos (GEMS): Isolamento de cérebro de rato

Os exossomos são estruturas microvesiculares encontradas em biofluidos que potencialmente carregam importantes biomarcadores discriminatórios de doenças. Aqui, um novo método é usado para extrair especificamente exossomos e testar rapidamente a carga exossômica para ambos os alvos de RNA / proteína após a interrupção de exossomos usando ondas quadradas cíclicas elétricas não uniformes.

Detecção de Exosomal Biomarker por induzida pelo campo elétrico de lançamento e Mensuração (Efirm)

Um protocolo para a síntese e catiação de magnetoferritina dopada com cobalto é apresentado, bem como um método para magnetizar rapidamente células-tronco com magnetoferritina catiônica.

Síntese de cationizada Magnetoferritin para a magnetização ultra-rápida de Células

Este manuscrito descreve a entrega eficiente, não-viral de miR a células endoteliais por um vector de PEI / MNP e a sua magnetização. Assim, em adição à modificação genética, esta abordagem permite a orientação celular magnética e ressonância magnética detectabilidade. A técnica pode ser usada para melhorar as características de produtos de células terapêuticas.

preparação e<em&gt; In Vitro</em&gt; Caracterização de magnetizado miR-modificado Células Endoteliais

O método descrito aqui é um novo protocolo de isolamento de vesículas, que permite a purificação dos compartimentos celulares onde os antígenos exógenos são processados pelo retículo endoplasmático associado a degradação em cruz-apresentação.

Purificação do compartimento da membrana retículo endoplasmático associado a degradação de antígenos exógenos em cruz-apresentação

Aqui, descrevemos um método de homogeneização de alta velocidade assistido por separação magnética para produção em larga escala de nanovesículas derivadas do endossomo como um novo tipo de imitação de exossomos (MEs) que compartilham a mesma origem biológica e estrutura, morfologia e composição proteica semelhantes de vesículas extracelulares nativas (EVs).

Um Método de Homogeneização de Alta Velocidade Assistida por Separação Magnética para Produção em Larga Escala de Vesículas Derivadas do Endossomo

Este protocolo descreve um método de triagem baseado em esferas magnéticas, utilizando anticorpos de citometria de fluxo marcados com ficoeritrina (PE) e microesferas anti-PE para isolar subpopulações específicas de células-tronco mesenquimatosas com alta positividade de marcadores-alvo pós-sorte, preservando a proliferação/atividade metabólica baseada em CCK-8 sob as condições testadas, sem exigir classificadores celulares caros ou esferas personalizadas específicas para o alvo.

Isolamento e validação de subpopulações de células-tronco mesenquimais positivas para podoplanina usando uma estratégia indireta de esferas magnéticas

Aprenda a purificação da proteína MamAΔ41 de Magnetospirillum magneticum AMB-1 usando cromatografia de afinidade, troca iônica e exclusão por tamanho. Este protocolo permite obter proteína pura para estudos de magnetossomos.

Purificação do M. magneticum Strain AMB-1 proteína associada Magnetosome MamAΔ41

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