Multieletrodo Recordings Matriz do Epitélio Vomeronasal

Matrizes planares de múltiplos eletrodos são usadas para gravar do órgão nasal UL. O VNO é removido do camundongo de forma que o neuro epitélio permaneça intacto. Primeiro, a cápsula VNO é removida do mouse.

Em seguida, o neuro epitélio é isolado da cápsula óssea, do vaso sanguíneo e da lâmina basal. O tecido é colocado no MEA com o botão dendrítico voltado para cima. Uma vez concluída essa configuração, usamos um braço robótico para administrar estímulos líquidos ao tecido.

Olá, sou Hannah Arnon, do laboratório de Tim Fully, do Departamento de Anatomia e Neurobiologia da Escola de Medicina da Universidade de Washington. Eu sou Cheyenne Fu, também do laboratório sagrado. Hoje mostraremos um procedimento para gravação de vários eletrodos do órgão nasal V.

Usamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar as propriedades sensoriais ou neurônios receptores no sistema afetivo acessório. Então vamos começar. As gravações elétricas são obtidas com uma matriz planar de múltiplos eletrodos ou MEA com eletrodos planos de nitreto de titânio de 10 micrômetros isolados com nitreto de silício.

60 eletrodos são dispostos em dois campos que consistem em uma grade de cinco por seis com espaçamento de centro a centro de 30 micrômetros. Usando um amplificador MEA 10 60, os sinais elétricos são amplificados. São necessários sinais de 1000 dobras a 10 kilohertz.

Usando um cartão de aquisição de dados e um software de aquisição de dados personalizado, o tecido é mantido no MEA por uma malha de náilon, que é presa a uma inserção personalizada, que se encaixa perfeitamente dentro da cultura. Para trazer o MEA, agora que vimos as medidas, vamos ver como fazer a dissecação do VNO. Antes de realizar a dissecção, encha bem o MEA com albumina de soro bovino ou BSA em seguida, enxágue o MEA usando uma solução de ringer borbulhante quente e coloque-o no gelo.

Para se preparar para a dissecação, encha duas placas de Petri de 60 por 15 milímetros com solução de ringer borbulhante e coloque-as no gelo. Além disso, encha duas placas de Petri revestidas com proteção de peitoril do mesmo tamanho com solução de campainha e coloque-as no gelo. Resfrie mais 50 mililitros de anéis borbulhantes para uso durante a dissecação.

Comece com um rato sacrificado fazendo incisões bilaterais do lado da boca paralelas à linha da mandíbula até a parte de trás da cabeça. Junte os dois cortes ao longo da nuca e remova a parte dorsal da cabeça, deixando a mandíbula inferior presa ao mouse usando uma tesoura fina. Corte entre o tecido e ambos os lados do maxilar superior para separar o tecido do osso.

Em seguida, use a pinça número três para descascar o tecido do palato, expondo a cavidade nasal usando uma tesoura pequena ou um bisturi cortado entre e em ambos os lados dos dois dentes superiores da frente para liberar a cápsula nasal vulnerável do osso usando a pinça número três. Pegue a cápsula nasal vulnerável pelo osso liso e coloque-a na placa de Petri no gelo. As etapas anteriores por imersão do VNO em toques resfriados devem ser realizadas em menos de três minutos.

Para evitar a morte do tecido, coloque o prato sob um microscópio estéreo iluminado com luz refletida. Use a pinça número três para remover a cápsula óssea de um VNO de cada vez. Use uma mão para estabilizar a cápsula óssea segurando pela extremidade do mimo e a outra mão para retirar o osso do VNO, tomando cuidado para não danificar o VNO.

Uma vez que o osso é removido, transfira o v e o para uma placa de Petri revestida de charuto. Use o prato restante para o outro VNO. Mude a iluminação para o uso de luz transmitida usando micro tesouras.

Ou fórceps número cinco. Separe o VNO do vaso sanguíneo cortando ao longo da borda do VNO. Neste ponto, você terá a folha neural completamente separada do vaso sanguíneo.

Coloque o VNO com o lado interno para cima usando uma pinça número três. Prenda o VO à proteção S em um canto do tecido usando um pequeno fragmento de uma lâmina de barbear revestida de Teflon presa com uma braçadeira. Descasque o epitélio neural da lâmina basal segurando a lâmina em um ângulo raso a menos de 30 graus da superfície do prato.

Funciona melhor. Usando uma pipeta de vidro. Transfira o pedaço de epitélio neural do prato para a posição MEA do VNO no topo do campo do eletrodo com o lado dendrítico para cima.

Remova o excesso de solução de ringer com uma pipeta e, em seguida, coloque o suporte de tecido de malha no poço da matriz para manter o vno no lugar. Encha o poço com solução de campainha gelada com a dissecação completa. Vamos ver como gravar um Para iniciar uma sessão de gravação, coloque o MEA em um amplificador MEA 10 60 e posicione a sonda do aquecedor diretamente acima do tecido para confirmar o aquecedor adequado.

A colocação da sonda estimula com solução de ringer contendo 50 milimolares de potássio por dois segundos. Ajuste o posicionamento para minimizar a latência da resposta neural à solução de potássio. O tecido requer superfusão contínua, que é obtida fornecendo solução de ringer de uma bomba de HPLC.

Super funda o tecido com solução de campainha aquecida por 45 minutos a uma hora antes da gravação para permitir que o tecido se aclimate. Os estímulos são entregues usando o braço robótico Gilson two 15 liquid handler. Eles são apresentados realizando injeções em uma válvula de HPLC e alternando entre o fluxo e o loop Sob o controle do software Gilson, o braço robótico fornece os estímulos para a linha de profusão enquanto a taxa de fluxo e a pressão constantes são mantidas.

O estado da válvula HPLC é representado por uma tensão elétrica, que é registrada pelo computador de aquisição como um canal extra. Para garantir a sincronização com a atividade neuronal, os sinais elétricos são salvos em disco usando um software de gravação personalizado. Agora mostraremos alguns resultados representativos da matriz de vários eletrodos VNO. Gravação.

Este procedimento produz grandes quantidades de dados devido ao grande número de eletrodos, e a preparação normalmente permanece estável por cerca de seis horas. Aqui está um exemplo de 400 milissegundos de dados de metade do MEA. Este procedimento é útil para medir a resposta dos neurônios sensoriais aos ligantes mostrados aqui é a resposta à urina de camundongo fêmea diluída 100 vezes registrada de um único eletrodo.

A urina foi entregue por 10 segundos, conforme indicado pela barra preta. Observe o aumento no disparo após a apresentação do estímulo. Acabamos de mostrar como realizar gravações de vários arranjos eletro no VNO do mouse ao realizar este procedimento.

É importante lembrar de ser paciente. Então é isso. Obrigado por sua observação e boa sorte com seus experimentos.