Name: Multieletrodo Recordings Matriz do Epitélio Vomeronasal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-01T16:25:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Aprenda a registrar atividade elétrica do epitélio vomeronasal de camundongos usando matrizes multieletrodos com braço robótico para estímulos líquidos. Este método permite investigar respostas sensoriais em neurociência.

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Gostaríamos de agradecer aos membros do Laboratório Santo. Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Surdez e Distúrbios da Comunicação (R01 DC005964 para THE) e NSF IGERT 0.548.890 (HAA). Experimentos em animais foram realizados de acordo com os Estados Unidos Atos Animal Welfare e Institutos Nacionais de Saúde e diretrizes foram aprovadas pelo Animal Care Washington University e do Comitê Use.

Parte 1. Instrumentação gravação elétrica <ol><li> Nós usamos uma variedade multieletrodo planar (Instrumentos Científicos ALA) com 10 mM de eletrodos planos de titânio isolado com nitreto nitreto de silício. 60 eletrodos são dispostos em dois campos que consiste em uma grade 5x6 com o centro a centro-espaçamento de 30 mm. (Outras configurações também são possíveis; eletrodos com uma superfície de gravação de 10 m de diâmetro são melhores do que os eletrodos maior em termos de isolar a atividade de neurônios individuais.) </li><li> Sinais elétricos são amplificados (amplificação 1000x), utilizando um MEA 1060 amplificador (ALA Scientific Instruments). Sinais são adquiridos em 10 kHz usando um cartão de aquisição de dados (National Instruments) e software de aquisição de dados personalizados (também pode comprar um software comercial). </li><li> O tecido é pressionada sobre o MEA por uma malha de nylon (53 mm), que é ligado a um acessório personalizado que se encaixa perfeitamente dentro do anel tubo de cultura do MEA. </li></ol> Parte 2. Instrumentação Entrega líquido <ol><li> O tecido requer superfusão contínua, o que nós garantimos, fornecendo solução de Ringer (115 cloreto de sódio mM, 5 mM cloreto de potássio, 2 cloreto de cálcio mM, 2 de cloreto de magnésio mM, 25 de bicarbonato de sódio mM, 10 HEPES mM e 10 mM D-(+ ) glicose) de uma bomba de HPLC. Estímulos são apresentados através da realização de injeções em uma válvula de HPLC e alternar entre flow-through eo loop. Tanto a bomba HPLC e bomba de injeção é o robô seringa são fornecidos com solução de Ringer. </li><li> Solução de Ringer é mantido em um banho de água aquecida (ISOTEMP 105) a 42 ° C durante todo o experimento e é continuamente aeradas com 95% O 2 / 5% CO 2. Um frasco separado de Ringer sem glicose está preparado para suportar a bomba de seringa. Solução de Ringer é entregue para o tecido usando um 307 HPLC bomba (Gilson) a uma taxa de 3 mL / min. Em um experimento típico horas 5-6, 1 L de solução de Ringer com cada é suficiente. </li><li> Durante todo o experimento, o tecido é continuamente superfused com 37 ° C solução Ringer. Uma sonda de aquecimento está posicionado diretamente acima do tecido. </li><li> Estímulos são entregues usando o Gilson 215 braço manipulador robótico líquido. Estímulos são armazenados em frascos de borracha-capped de vidro, e sob o controle de software Gilson, o braço robótico fornece os estímulos à linha de perfusão enquanto a taxa de fluxo constante e pressão são mantidas. </li><li> O estado da válvula de HPLC (loop engajados / envolvidos não) é representado por uma tensão elétrica, que é gravada pelo computador de aquisição como um canal extra para garantir a sincronização com a atividade neuronal. </li></ol> Parte 3. Preparando o MEA e estímulo dispositivo de entrega <ol><li> Antes de realizar a dissecção, preencher o MEA bem com BSA em dH2O por pelo menos 5 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Lavar a MEA usando warm-bolhas de solução de Ringer e coloque o MEA no gelo. </li><li> Primeiro o manipulador de líquido e HPLC bomba de acordo com instruções do fabricante. </li></ol> Parte 4. Dissecação VNO <ol><li> Antes de realizar a dissecção, preencher dois pratos 60x15 milímetros de Petri com solução de Ringer com bolhas e colocar no gelo. Também preencher 2 Sylgard pratos Petri revestidas do mesmo tamanho com solução de Ringer e colocar no gelo. Frio um adicional de 50 mL warm-bolhas de Ringer para uso durante a dissecção. </li><li> O mouse é sacrificado através CO 2 seguido asfixia por deslocamento cervical. </li><li> Fazer incisões bilaterais a partir do lado da boca, correndo paralela à linha da mandíbula, a parte de trás da cabeça. Junte-se a dois cortes ao longo da parte de trás do pescoço e remover a parte dorsal da cabeça, deixando o maxilar inferior ligados ao mouse. </li><li> Com uma tesoura fina, corte entre o tecido e ambos os lados do osso maxilar superior para separar o tecido do osso. </li><li> # 3 Usando uma pinça, retire o tecido do palato para expor a cavidade nasal. </li><li> Com uma tesoura pequena ou um bisturi, cortar entre e em ambos os lados da parte superior dois dentes da frente para libertar a cápsula vomeronasal do osso. </li><li> # 3 Usando uma pinça, pegar a cápsula vomeronasal pelo osso plana e coloque na placa de Petri sobre gelo. Os passos para cima através de imersão deve ser realizada em menos de 3 minutos. </li><li> Coloque o prato sob microscópio estereoscópico, iluminado com a luz refletida. Remova a cápsula óssea de um VNO em um tempo usando # 3 fórceps. Use um lado para estabilizar a cápsula óssea segurando a partir do final caudal ea outra mão para descascar o osso longe do VNO, tomando cuidado para não danificar o VNO. </li><li> Quando o osso é removido, a transferência do VNO a uma placa de Petri Sylgard revestido. Use o prato restantes para o VNO outros. Mudar a iluminação de luz transmitida. </li><li> Usando micro-tesouras ou pinças # 5, separar o VNO do vaso sanguíneo cortando ao longo da borda do VNO. Neste ponto, você vaitêm a folha neural completamente separada do vaso sangüíneo. </li><li> Coloque o VNO com o lado interno (dendríticas). # 3 Usando fórceps, âncora do VNO ao Sylgard em um canto do tecido. Descasque o epitélio neural da lâmina basal através de um pequeno fragmento de uma lâmina de barbear revestidas de Teflon realizada com uma pinça. Segurando a lâmina em um ângulo raso (&lt;30 ° da superfície da placa) é melhor. </li><li> Com uma pipeta de vidro, transferir o pedaço de epitélio neural do prato para o MEA. Posição do VNO em cima do campo eletrodo com o lado dendríticas up. Retire o excesso de solução de Ringer com uma pipeta. Coloque o suporte de tecido mesh para o bem da matriz para manter o VNO no lugar, e encha com solução de Ringer resfriada é. </li></ol> Parte 5. Gravação <ol><li> Coloque o MEA em 1060 MEA amplificador e posição da sonda aquecedor diretamente acima do tecido. </li><li> Para confirmar a colocação da sonda adequada aquecedor, estimular com solução de Ringer contendo 50 mM de potássio (substituído por sódio equimolar) por 2 segundos. Ajuste de posicionamento para minimizar a latência da resposta neural para a solução de potássio. </li><li> Superfuse o tecido com uma solução de Ringer aquecido por 45 minutos a 1 hora antes da gravação para permitir que o tecido se adapte. </li><li> Sinais elétricos são salvos no disco usando o software de gravação personalizada. </li></ol> Parte 6. Análise de Dados <ol><li> Análise de dados offline pode ser feito usando as gravações eletrodo-primas. Por exemplo, podemos medir a alterações na taxa de disparo das células gravadas em resposta a ligantes particular. Os conjuntos de dados resultantes são grandes e podem ser utilizados para tratar várias questões diferentes; familiaridade com uma linguagem de programação ou análise (C, Matlab, R, Python, ou similar) é necessária. </li></ol> Parte 7. Resultados representante Esta preparação é tipicamente estável o suficiente para gravar a partir de 6 horas, produzindo uma grande quantidade de dados (6 horas de gravação de 60 eletrodos). <img src="/files/ftp_upload/1845/1845fig1tmb.jpg" alt="Figura 1" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Um instantâneo da atividade simultânea em toda a metade da matriz é mostrado. A janela de tempo se estende por 400 ms. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1845/1845fig1.jpg">clique aqui</a> para ver uma versão ampliada da figura 1. <img src="/files/ftp_upload/1845/1845fig2tmb.jpg" alt="Figura 2" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Em um experimento típico, estimulamos com compostos de interesse particular por 10 segundos. Este traço é um exemplo de uma resposta a 100 vezes urina do rato diluída feminino. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1845/1845fig2.jpg">clique aqui</a> para ver uma versão ampliada da figura 2.

<ol><li>Dulac, C., Torelo, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+detection+of+pheromone+signals+in+mammals%3A+from+genes+to+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular detection of pheromone signals in mammals: from genes to behaviour.</a> Nat Rev Neurosci. 4, 551-562 (2003).</li>
<li>Holy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+Vomeronasal+neurons+to+natural+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Responses of Vomeronasal neurons to natural stimuli.</a> Science. 289, 1569-1572 (2000).</li>
<li>Nodari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulfated+steroids+as+natural+ligands+of+mouse+pheromone-sensing+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sulfated steroids as natural ligands of mouse pheromone-sensing neurons.</a> J Neurosci. 28, 6407-6418 (2008).</li>
</ol>

Gravações série multieletrodo permitem-nos a capacidade de monitorar a atividade simultânea de uma grande população de neurônios. Esta é uma ferramenta útil para investigar as propriedades de um sistema sensorial, especificamente o VNO. Ao contrário do sistema olfatório, o VNO detecta estímulos em fase líquida. Além disso, o VNO é um tecido heterogêneo. Existem aproximadamente 300 tipos diferentes de receptores no mouse 1, presumivelmente com perfis de resposta diferentes. Gravações MEA combinado com o braço ...

multieletrodo recordings matriz do epitélio vomeronasal

Multielectrode Array Recordings of the Vomeronasal Epithelium

Compreender os circuitos neurais requer métodos para gravar a partir de muitos neurônios simultaneamente. Para<em&gt; In vitro</em&gt; Estudos, uma tecnologia atualmente disponível é planar multieletrodo variedade de gravação (MEA). Aqui nós documentamos o uso de MEAs para estudar o rato órgão vomeronasal (VNO), que desempenha um papel essencial na detecção de feromônios e sinais sociais através de uma população diversificada de neurônios sensoriais expressando centenas de tipos de receptores. Combinando gravação MEA com um manipulador robótico líquido para entregar estímulos químicos, as respostas sensoriais de uma população grande e diversificada de neurônios pode ser gravado. A preparação nos permite remover o neuroepitélio intacta do VNO do mouse e estimular com uma bateria de produtos químicos ou ligantes potencial enquanto monitora a atividade elétrica dos neurônios durante várias horas. Portanto, essa técnica serve como um método útil para avaliar a atividade ligante, bem como explorar as propriedades dos neurônios receptores. Nós apresentamos as técnicas necessárias para preparar o epitélio vomeronasal, gravação de MEA, e estimulação química.

Multieletrodo array (MEA) gravações de fornecer um método para o estudo da atividade elétrica de grandes populações de neurônios. Aqui, apresentamos os detalhes de uma preparação MEA para gravar a partir do epitélio do mouse vomeronasal, ao mesmo tempo estimulando o tecido.

Multieletrodo Recordings Matriz do Epitélio Vomeronasal

A compreensão dos circuitos neurais requer métodos para registrar a atividade de muitos neurônios simultaneamente. Para estudos in vitro, uma tecnologia atualmente disponível é...

Matrizes planares de múltiplos eletrodos são usadas para registrar atividade do órgão nasal UL. O OVN é removido do camundongo de forma que o epitélio neurosensorial permaneça intacto. Primeiro, a cápsula do OVN é removida do camundongo.Em seguida, o epitélio neural é isolado da cápsula óssea, dos vasos sanguíneos e da lâmina basal. O tecido é posicionado na MEA com o lado do botão dendrítico voltado para cima. Após a conclusão desse arranjo, utilizamos um braço robótico para administrar estímulos líquidos ao tecido.Olá, sou Hannah Arnon do laboratório de Tim Wholly, do Departamento de Anatomia e Neurobiologia da Escola de Medicina da Universidade de Washington. Sou Cheyenne Fu, também do laboratório Holy. Hoje vamos mostrar um procedimento para gravação com matriz de múltiplos eletrodos do órgão vomeronasal.Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar as propriedades sensoriais ou os neurônios receptores no sistema atório acessório. Vamos então começar. Os registros elétricos são obtidos com uma matriz planar de múltiplos eletrodos ou MEA com eletrodos planos de nitreto de titânio de 10 micrômetros, isolados com nitreto de silício.60 eletrodos são dispostos em dois campos compostos por uma grade de cinco por seis, com espaçamento centro a centro de 30 micrômetros. Utilizando um amplificador MEA 10 60, os sinais elétricos são amplificados. São necessários sinais amplificados em 1000 vezes a 10 quilohertz.Usando uma placa de aquisição de dados e um software personalizado de aquisição de dados, o tecido é fixado sobre a MEA por uma malha de náilon, que está presa a um inserto personalizado, o qual se encaixa perfeitamente dentro da cultura. Para montar a MEA, agora que vimos as MEAs, vamos ver como realizar a dissecação do VNO. Antes de realizar a dissecação, encha o poço da MEA com albumina sérica bovina ou BSA; em seguida, lave a MEA usando solução de Ringer morna e borbulhada e coloque-a sobre gelo.Para se preparar para a dissecação, encha dois recipientes de Petri de 60 por 15 milímetros com solução de Ringer oxigenada e coloque-os sobre gelo. Além disso, encha dois recipientes de Petri revestidos com selante do mesmo tamanho com solução de Ringer e coloque-os sobre gelo. Resfrie adicionais 50 mililitros de Ringer oxigenado para uso durante a dissecação.Inicie com um camundongo sacrificado, fazendo incisões bilaterais a partir do lado da boca, paralelas à linha da mandíbula, até a parte posterior da cabeça. Una os dois cortes ao longo da parte de trás do pescoço e remova a porção dorsal da cabeça, deixando a mandíbula inferior presa ao camundongo com uma tesoura fina. Corte entre o tecido e ambos os lados do maxilar superior para separar o tecido do osso.Em seguida, utilize pin&ccedil;as n&uacute;mero tr&ecirc;s para destacar o tecido do palato, expondo a cavidade nasal com cortes pequenos feitos com tesoura ou bisturi entre e em ambos os lados dos dois dentes superiores da frente, a fim de liberar a c&aacute;psula nasal vulner&aacute;vel do osso usando pin&ccedil;as n&uacute;mero tr&ecirc;s. Segure a c&aacute;psula nasal vulner&aacute;vel pelo osso plano e coloque-a na placa de Petri sobre gelo. Os passos anteriores at&eacute; a imers&atilde;o do &oacute;rg&atilde;o vomeronasal em ringer gelado devem ser realizados em menos de tr&ecirc;s minutos.Para evitar a morte tecidual, coloque a placa sob um microscópio estereoscópico iluminado com luz refletida. Use pinças número três para remover a cápsula óssea de um órgão vomeronasal (VNO) por vez. Use uma mão para estabilizar a cápsula óssea segurando-a pela extremidade caudal e a outra mão para destacar o osso do VNO, tomando cuidado para não danificar o VNO.Uma vez removido o osso, transfira o v e o o para uma placa de Petri revestida com cigarro. Utilize a placa restante para o outro VNO. Altere a iluminação para luz transmitida utilizando tesoura microcirúrgica.Ou pin&ccedil;as n&uacute;mero cinco. Separe o &oacute;rg&atilde;o vomeronasal do vaso sangu&iacute;neo cortando ao longo da borda do &oacute;rg&atilde;o vomeronasal. Neste ponto, voc&ecirc; ter&aacute; a l&acirc;mina neural completamente separada do vaso sangu&iacute;neo.Coloque o órgão vomeronasal com o lado interno voltado para cima, utilizando pinça número três. Ancore o órgão vomeronasal ao suporte S em um canto do tecido usando um pequeno fragmento de lâmina de barbear revestida com teflon, segurado com um grampo. Remova o epitélio neural da lâmina basal, mantendo a lâmina em um ângulo raso inferior a 30 graus em relação à superfície da placa.Funciona melhor. Usando uma pipeta de vidro, transfira o fragmento de epitélio neural da placa para a MEA e posicione o órgão vomeronasal sobre o campo de eletrodos com o lado dendrítico voltado para cima.Remova a solução de Ringer em excesso com uma pipeta e, em seguida, coloque o suporte de tecido em malha no poço da matriz para manter o VNO no lugar. Preencha o poço com solução de Ringer gelada após a conclusão da dissecação. Vejamos como gravar um. Para iniciar uma sessão de gravação, coloque a MEA em um amplificador MEA 10 60 e posicione a sonda de aquecimento diretamente acima do tecido para confirmar o funcionamento adequado do aquecedor.O posicionamento da sonda estimula com solução de Ringer contendo 50 milimolares de potássio por dois segundos. Ajuste a posição para minimizar a latência da resposta neural à solução de potássio. O tecido requer uma superfusão contínua, que é obtida fornecendo solução de Ringer a partir de uma bomba HPLC.Superfuse o tecido com solução de Ringer aquecida por 45 minutos a uma hora antes da gravação, para permitir que o tecido se acostume. Os estímulos são administrados usando o braço robótico do manipulador líquido Gilson dois 15. Eles são apresentados mediante injeções em uma válvula HPLC e alternância entre fluxo contínuo e o loop sob controle do software Gilson, enquanto o braço robótico entrega os estímulos à linha de perfusão, mantendo taxa de fluxo e pressão constantes.O estado da válvula de CLAE é representado por uma voltagem elétrica, que é registrada pelo computador de aquisição como um canal adicional. Para garantir a sincronização com a atividade neuronal, os sinais elétricos são salvos em disco utilizando um software personalizado de gravação. Agora mostraremos alguns resultados representativos da gravação com matriz de eletrodos múltiplos do Órgão Vomeronasal.Este procedimento gera grandes quantidades de dados devido ao grande número de eletrodos, e o preparo geralmente permanece estável por cerca de seis horas. Abaixo há um exemplo de 400 milissegundos de dados provenientes de uma metade da MEA. Este procedimento é útil para medir a resposta dos neurônios sensoriais a ligantes; mostrada aqui está a resposta à urina de camundongo fêmea diluída 100 vezes, registrada a partir de um único eletrodo.A urina foi apresentada durante 10 segundos, conforme indicado pela barra preta. Observe o aumento na atividade de disparo após a apresentação do estímulo. Acabamos de mostrar como realizar gravações com matriz multieletrodo no VNO de camundongo ao executar este procedimento.É importante lembrar de ser paciente. Assim sendo, é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

multielectrode-array-recordings-of-the-vomeronasal-epithelium

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

O electroolfactogram gravação (EOG) é uma maneira informativa de fácil condução e confiável de avaliação da função olfativa ao nível do epitélio olfativo. Este protocolo descreve uma configuração de gravação, de preparação dos tecidos mouse, coleta de dados e análise de dados básicos.

Respostas análise de rato Olfactory neurônios sensoriais Usando a gravação Electroolfactogram Air fase

A forma robusta para estudar avalanches neuronal, ou seja, escala-invariante rajadas espaço-temporal atividade, indicativo da dinâmica do estado crítico no córtex. Avalanches surgem espontaneamente no desenvolvimento de camadas superficiais do córtex cultura que permite medições a longo prazo da atividade com arrays planar integrada multi-eletrodo (MEA), sob condições estritamente controladas.

Multieletrodos Recordings Array of Avalanches Neuronal em culturas organotípicas

O órgão vomeronasal (VNO) detecta sinais químicos intraespecíficos que transmitem informações sociais e reprodutivas. Realizamos experimentos de imagem de Ca2+ utilizando camundongos transgênicos que expressam G-CaMP2 no tecido do VNO. Essa abordagem nos permite analisar os padrões complexos de resposta dos neurônios vomeronasais a um grande número de estímulos de feromônios.

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Este vídeo demonstra o registro eletrofisiológico de neurônios sensoriais olfativos (OSNs) em camundongos usando uma técnica de patch-clamp perfurada. O epitélio olfatório, contendo OSNs com receptores de odor marcados com fluoróforo, é isolado de um camundongo e preso em uma câmara de registro. Uma pipeta de registro é presa ao botão dendrítico de um OSN, e a nistatina dentro da pipeta perfura a membrana para formar conectividade elétrica com a célula. Finalmente, outra pipeta é usada para...

Registro perfurado de neurônios sensoriais olfativos em camundongos

O vídeo do protocolo descreve o estabelecimento de um grampo de adesivo de célula inteira para registro eletrofisiológico dos neurônios sensoriais do órgão vomeronasal (VNO) em camundongos. Uma fatia coronal de VNO com neurônios sensoriais marcados com fluorescência é colocada em uma configuração de gravação. Um neurônio marcado é temendado com uma pipeta de registro em uma configuração de célula inteira para registro eletrofisiológico em resposta a estímulos químicos.

Estabelecendo um grampo de remendo de célula inteira para registro eletrofisiológico de neurônios sensoriais vomeronasalis

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A análise das propriedades fisiológicas dos neurônios sensoriais olfativos ainda enfrenta limitações técnicas. Aqui, nós os registramos por meio de patch-clamp perfurado em uma preparação intacta do epitélio olfatório em camundongos direcionados ao gene. Esta técnica permite a caracterização das propriedades da membrana e respostas a ligantes específicos de neurônios que expressam receptores olfativos definidos.

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