Doseamento do Capacidade de difusíveis moléculas sinalizadoras para Reorientar embrionárias Spinal Axônios comissural

Explantes de medula espinhal dorsal são dissecados de embriões de rato e cultivados em colágeno tridimensional. O gel é colocado em oposição a células que expressam uma molécula sinalizadora candidata. A capacidade da molécula sinalizadora de realinhar axônios em crescimento dentro do explante de medula espinhal dorsal é avaliada por meio de imunohistoquímica.

Olá, sou Virginia Hazen do laboratório de Samantha Butler do Departamento de Ciências Biológicas da Universidade da Califórnia do Sul. Sou Keith Fun, também do laboratório Butler. E sou Ken Ya Mai do laboratório Butler.

Hoje vamos mostrar um procedimento para o cultivo de implantes dorsais da medula espinhal e agregados de células cost transfectadas em uma matriz de colágeno. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para avaliar a capacidade de moléculas sinalizadoras candidatas de orientar neurônios motores da medula espinhal. Neste experimento, examinaremos a capacidade da proteína morfogenética óssea, ou BMP-7, de atuar como um quimiorrepelente.

Vamos começar. Prepare agregados de células-co utilizados para desafiar a trajetória dos axônios comissurais provenientes das células-co. Transfetadas com o plasmídeo de expressão para a molécula de interesse aqui, a proteína morfogenética óssea ou BMP-7.

Aspire o meio do recipiente e lave as células com um mililitro de PBS 1X. Remova o PBS e trate as células com meio meio mililitro de meio de dissociação celular livre de enzimas por 15 minutos. Interrompa a reação adicionando um mililitro de meio contendo soro bovino fetal.

Usando uma ponteira de pipeta de 1000 microlitros, pipete as células repetidamente até que nenhuma permaneça na superfície da placa de cultura. Transfira as células para um tubo cônico de 15 mililitros e centrifugue as células por dois minutos. A 2000 RPM, remova o sobrenadante e pipete para cima e para baixo para ressuspender.

Em 100 microlitros de meio, coloque várias gotas de 20 microlitros da solução celular no interior da tampa de uma placa de cultura de 35 milímetros. Feche a tampa sobre a placa e coloque no incubador por várias horas para permitir que as células se agreguem. Para preparar implantes do cordão espinhal dorsal, mantenha recém-colhidos.

E 11 embriões de rato sobre gelo. Em meio L 15 com uma agulha de tungstênio afiada, remova uma seção de quatro a seis segmentos de miosite da região do tronco imediatamente abaixo do botão do membro anterior de cada embrião. Usando uma pipeta de plástico, colete o tecido em um poço de um quatro.

Bem, não há placa sobre gelo. Quando todos os segmentos tiverem sido dissecados, use a pipeta para transferir os pedaços para um segundo poço da placa contendo meio L-15 mais disco de pasta. Incube o tecido à temperatura ambiente por não mais de cinco minutos.

Para evitar a morte celular, não digerir o tecido em excesso. Adicione um mililitro de meio L 15 fresco com 5% de soro de cabra inativado pelo calor ao terceiro poço da placa. E transfira os fragmentos de tecido para este poço.

No final da incubação no espaço de dissecção, deixe o tecido repousar no gelo por uma hora. Para facilitar a subsequente dissecção em um tubo de microcentrífuga, adicione 40 microlitros de meio mínimo essencial 10 x a 360 microlitros de colágeno. E agite brevemente para misturar, centrifugando em um pico fuge.

A solução ficará amarela e deve ser mantida em gelo tanto quanto possível para evitar que o colágeno solidifique. Para cada lote de colágeno, titule com a quantidade de bicarbonato de sódio 0,8 molar que deixa a solução de colágeno levemente alaranjada. Misture a solução após cada adição. Quando a solução de colágeno atingir essa coloração, permanecerá líquida se mantida em gelo, mas estará pronta para solidificar ao ser levada à temperatura ambiente. Se a solução ficar rosa após a mistura, recomece com um tubo novo de colágeno com meio. Coloque 20 microlitros de colágeno em cada poço de uma placa limpa de quatro poços sem revestimento.

Usando a ponta da pipeta, espalhe o colágeno para formar uma pequena camada. Deixe o colágeno solidificar à temperatura ambiente por cerca de 10 minutos. Sob o microscópio de dissecação, utilize uma agulha de tungstênio recém-afiada e um par de pinças finas para remover, com a agulha de tungstênio, a mesoderme que envolve a medula espinhal de um embrião, removendo também a porção ventral da medula espinhal, que pode ser identificada pela presença da placa do assoalho.

Na borda mais ventral, a placa do assoalho é ligeiramente mais espessa do que a placa do teto na borda dorsal. Neste exemplo, a medula espinhal está posicionada com o lado ventral para baixo. Corte cuidadosamente o tecido trabalhando paralelamente à placa do assoalho e descarte o quinto ventral da medula espinhal.

Use a agulha para bissectar verticalmente o explante da medula espinhal dorsal. Certifique-se de que as bordas sejam cortadas da forma mais limpa possível e recorte-as novamente, se necessário. Use uma pipeta de boca equipada com um tubo capilar de vidro de 0,5 milímetro de diâmetro para transferir cada explante para uma almofada de colágeno separada.

Com a agulha de tungstênio, corte o agregado de células co transfectadas em quadrados com largura aproximadamente igual à da borda lateral da medula espinhal dorsal. Explicação. Use uma pipeta de boca para transferir um dos quadrados para o suporte de colágeno com o x explicação. Use a pipeta de boca para aspirar qualquer líquido em excesso.

Não aspire em excesso, pois uma pequena quantidade de líquido auxiliará na aplicação subsequente de colágeno; aplique quatro microlitros de colágeno ativado sobre o suporte. Use a agulha de tungstênio para mover o colágeno sobre os implantes sem tocar diretamente no tecido. Movendo a agulha no colágeno, oriente cada x explan de modo que o agregado de células co esteja adjacente à sua borda lateral.

Deixe o colágeno solidificar por 15 a 20 minutos. Repita o processo de aplicação com mais quatro microlitros de colágeno para garantir que o explante x esteja completamente envolto em colágeno antes de passar ao próximo embrião em uma capela de cultura de tecidos com 0,5 mililitros de meio e cultive por 30 a 40 horas. Em uma incubadora dentro de uma capela de exaustão, fixe os explantes com 0,5 mililitros de solução de paraformaldeído 4% em PBS por 45 minutos. Mantendo o tecido sobre gelo, lave duas vezes com 0,5 mililitros da solução de bloqueio e permeabilização. PBTN.

Incube os explantes x na solução bloqueadora a quatro graus Celsius, preferencialmente durante a noite. Use pinças para retirar o explante X do poço da placa de quatro poços e coloque cada um em um poço de uma placa de 48 poços.

Adicione 200 microlitros de anticorpo primário a cada poço. Para visualizar os axônios comissurais, utilize o anticorpo anti-ttag de camundongo e, para determinar se a transfeção entre células foi bem-sucedida, inclua um anticorpo contra a molécula em análise. Incube durante a noite a quatro graus Celsius.

Lave cada amostra cinco vezes com a solução bloqueadora PBTN, sendo cada lavagem de uma hora, a quatro graus Celsius. Remova o PBTN e adicione 200 microlitros de anticorpo secundário a cada amostra. Cubra bem com filme aderente para evitar descoloração e incube durante a noite a quatro graus Celsius.

Lave as amostras cinco vezes em PBTN, como antes. Transfira cada explante para um lâmina com três poços. Remova o meio de montagem em excesso, monte com o meio Invecta Shield e cubra com uma lamínula.

Armazene as lâminas em uma pasta ou caixa protegida da luz a quatro ou menos vinte graus Celsius até o momento de visualizá-las ao microscópio. Agora mostraremos algumas imagens representativas de explantes de X após terem sido cultivados, fixados, corados e analisados por microscopia confocal. O painel A mostra que um explante de placa do teto, delimitado em branco, pode reorientar os axônios corais positivos para a tag um para longe dele, demonstrando que a placa do teto é a fonte de um quimiorrepelente axonal. O painel B mostra que células co que secretam a molécula sinalizadora M tact, a proteína morfogenética óssea ou BMP sete, podem repelir axônios carceriais de maneira semelhante à placa do teto.

Os axónios de células que secretam apenas o plasmídeo de expressão não têm efeito sobre a orientação dos axónios. Acabamos de mostrar como dissecar, orientar e cultivar um explante da medula espinhal e induzir agregados celulares para que possa determinar se uma molécula sinalizadora candidata possui atividade de reorientação de axónios. Ao realizar este procedimento, é importante manter o colagénio o máximo possível em gelo e envolver completamente o explante com colagénio, de modo que este não entre em contato direto com o meio de cultura.

E finalmente, cultive apenas pelo tempo necessário para que os axônios se estendam até a borda ventral do x explan. É isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.I.