Name: Otimizado de fibrina Gel Assay Bead para o Estudo da angiogênese (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 14 s
Description: Aprenda o ensaio de fibrina com esferas para estudar angiogênese in vitro usando células endoteliais. Este método permite visualizar brotamento, formação de lúmen e ramificação em imagens de lapso de tempo.

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CÉLULAS PREPARAÇÃO <ol><li> Trazer HUVEC e fibroblastos em M199/10% FBS / Pen-Strep (1:100) 1-2 dias antes beading. </li><li> Interruptor de médio a EGM-2 (CLONETICS) no dia anterior beading para HUVEC e no dia anterior a incorporação de fibroblastos. </li><li> A concentração de ~ 400 HUVEC por talão é necessário. </li><li> 20.000 fibroblastos por poço é necessário. </li></ol> REVESTIMENTO as contas com HUVEC - -1 dia <ol><li> Trypsinize HUVEC. </li><li> Permitir contas para resolver (Não centrifugar!). Aspirar o sobrenadante e lavar as contas brevemente em 1 mL de meio de EGM-2 quente. </li><li> Mix contas 2500 w / 1X10 6 HUVEC em 1,5 mL de meio de EGM-2 quente em um tubo FACS. Colocá-lo na vertical na incubadora. (Isso será suficiente para ~ 10 poços. Scale up se necessário) </li><li> Incubar por 4 horas a 37 ° C, agitando o tubo a cada 20 minutos. (Revestimento Bom é crucial para a brotação.) </li><li> Após 4 horas, as contas de transferência para um balão revestido T25 em 5 mL de EGM-2 e deixar S / N. </li></ol> Incorporação BEADS REVESTIDO EM GEL fibrina - DIA 0 <ol><li> Preparar a solução de fibrinogênio 2,0 mg / mL (Ver secção receita). </li><li> Adicionar 0,15 Unidades / mL de aprotinina para a solução de fibrinogênio. </li><li> Transferência de contas revestida para um tubo cônico 15mL e deixe grânulos resolver. Contas ressuspender em 1 ml de EGM-2 e transferir para um tubo de centrifugação 1,5 ml. </li><li> Lave as contas 3X com 1mL de EGM-2 por pipetagem para cima e para baixo lentamente. </li><li> Contagem de contas em uma lamela e ressuspender em solução de fibrinogênio em uma concentração de aproximadamente 500 contas / mL. </li><li> Adicionar 0,625 Unidades / mL de trombina em cada poço. </li><li> Adicionar 0,5 mL da suspensão de fibrinogênio / talão para cada poço de uma placa de 24 poços. Alterar a ponta da pipeta para cada poço! </li><li> Misture a trombina eo fibrinogênio por subir e descer suavemente com a ponta da pipeta ~ 4-5 vezes. Tenha cuidado para não fazer bolhas grandes. </li><li> Deixar a placa por 5 min na capa, em seguida, colocá-lo na 37 ° C-incubadora por 10-15 min para gerar um coágulo. </li><li> Enquanto espera para o coágulo, trypsinize fibroblastos. </li><li> Adicionar 1 mL da EGM-2 por poço queda sábio. </li><li> Fibroblastos de sementes em cima de fibrina gel em uma concentração de 20.000 células por poço. </li></ol> NOTAS: Normalmente, quando o gel de fibrina é formada, você verá pequenas bolhas no gel. Não se preocupe, eles vão desaparecer em 3-4 dias. Troque a mídia todos os dias, ou seja, Dia 2, 4, 6, etc .. De dia 3 ou 4, você deve começar a ver a germinação.

<ol><li>Nehls, V., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microcarrier-based+cocultivation+system+for+the+investigation+of+factors+and+cells+involved+in+angiogenesis+in+three-dimensional+fibrin+matrices+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A microcarrier-based cocultivation system for the investigation of factors and cells involved in angiogenesis in three-dimensional fibrin matrices in vitro.</a> Histochem Cell Biol. 104, 459-466 (1995).</li>
<li>Nehls, V., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+microcarrier-based+in+vitro+assay+for+rapid+and+reliable+quantification+of+three-dimensional+cell+migration+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis.</a> Microvasc Res. 50, 311-322 (1995).</li>
</ol>

Há um consenso crescente de que em três dimensões (3D) em ensaios de angiogênese in vitro oferecer um modelo que é muito mais próximo do ambiente real in vivo do que pode ser conseguido usando culturas 2D. É evidente que sistemas 3D superiores deve ser reprodutível, e ser capaz de imitar vários dos principais passos da angiogênese. Apesar de vários ensaios anteriores 3D têm sido desenvolvidos, muitos destes usar difíceis de obter células microvascular, ou apenas recapitular algumas das etapas. Neste vídeo, descrevemos e realizar um ensaio i...

<table><tbody><tr><td>Esferas Cytodex-3</td><td>Reagente</td><td>Amersham</td><td>17-0485-01</td><td>10 g/frasco. 1.0,5 g de esferas secas são hidratadas e inchadas em 50 mL de PBS (pH = 7,4) por pelo menos 3 h à temperatura ambiente (RT). Use um tubo de 50 mL e coloque-o no agitador orbital. 2. Deixe as esferas sedimentarem (~15 min). Descarte o sobrenadante e lave as esferas por alguns minutos em PBS fresco (50 mL). 3. Descarte o PBS e substitua por PBS fresco: 25 mL -&amp;gt; 20 mg/mL =&amp;gt; 60000 esferas/mL ou 50 mL -&amp;gt; 10 mg/mL =&amp;gt; 30.000 esferas/mL. 4. Coloque a suspensão de esferas em um frasco de vidro silanizado (Windshield Wiper ou Sigmacote). 5. Esterilize as esferas por autoclavagem por 15 min a 115&amp;#x00B0;C. 6. Armazene a 4&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>Aprotinina</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-1153</td><td>10 mg/frasco. Reconstitua a aprotinina liofilizada a 4 U/mL em água desionizada (DI). Filtre esterilizando. Faça alíquotas de 1 mL cada. Armazene a -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Fibrinogênio Tipo I</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-8630</td><td>1 g. Dissolva o fibrinogênio a 2 mg/mL em DPBS. Observar a porcentagem de proteína coagulável e ajustar conforme necessário. Aqueça em banho-maria a 37 &amp;#x00B0;C para dissolver o fibrinogênio. Misture invertendo o tubo. Não vortex. Filtre esterilizando através de filtro de 0,22 µm.</td></tr><tr><td>Trombina</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-3399</td><td>22 mg = 1.000 unidades. Reconstitua em água estéril a 50 U/mL. Faça alíquotas de 0,5 mL cada. Armazene a -20 &amp;deg;C.</td></tr></tbody></table>

otimizado de fibrina gel assay bead para o estudo da angiogênese

Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis

A angiogênese é um processo de várias etapas complexas, onde, em resposta a estímulos angiogênicos, novos vasos são criados a partir da vasculatura existente. Estes passos incluem: degradação da membrana basal a proliferação e migração (sprouting) das células endoteliais (CE) na matriz extracelular, o alinhamento da CE em cordas, ramificação, formação de lúmen, a anastomose, e formação de uma nova membrana basal. Muitos ensaios in vitro têm sido desenvolvidos para estudar este processo, mas a maioria apenas imitar determinadas fases da angiogênese, e morfologicamente os vasos dentro dos ensaios muitas vezes não se assemelham a vasos in vivo. Baseado em trabalhos anteriores por Nehls e Drenckhahn, temos otimizado um ensaio in vitro que utiliza a angiogênese umbilical humano veia CE e fibroblastos. Este modelo recapitula todas as etapas chave no início da angiogênese e, sobretudo, os vasos mostrar patente lumens intercelular cercado por CE polarizada. CE são revestidos em microcarregadores Cytodex e incorporados em um gel de fibrina. Os fibroblastos são camadas em cima do gel, onde eles fornecem necessárias fatores solúveis que promovem CE brotando da superfície das esferas. Depois de vários dias, numerosos vasos estão presentes que podem ser facilmente observado sob contraste de fase e microscopia de lapso de tempo. Este vídeo demonstra os passos-chave na criação dessas culturas.

Este vídeo demonstra o protocolo de um ensaio in vitro angiogênese que recapitula vários estágios de angiogênese. Lapso de tempo imagens de germinação, formação de lúmen, ramificação e anastomose - características-chave da angiogênese - são mostrados.

Otimizado de fibrina Gel Assay Bead para o Estudo da angiogênese

A angiogênese é um processo complexo de múltiplas etapas no qual, em resposta a estímulos angiogênicos, novos vasos são criados a partir da vasculatura existente. Estes...

Olá, meu nome é Mar Katsu. Sou do Laboratório Hughes, do Departamento de Biologia Molecular e Bioquímica da uc Irvine. Vou realizar o ensaio de microesferas de fibrina.O processo inteiro leva dois dias para ser concluído. No primeiro dia, realiza-se o revestimento de microesferas com células endoteliais pubianas ou da veia umbilical humana. No segundo dia, essas microesferas revestidas são incorporadas a géis de fibrina e, em seguida, são recobertas com uma camada de fibroblastos.Utilizamos este ensaio para estudar as diversas etapas da angiogênese em um ambiente in vitro. No primeiro dia, na parte um, utilizamos as microesferas CY X three. No segundo dia, utilizamos estes três reagentes: fibrinogênio, trombina e aprotinina cytx.As microesferas três são da Amazon Biosciences e são especialmente codificadas com colágeno para que as células endoteliais aderem às microesferas. O próximo reagente é o fibrinogênio, que obtemos da sigma. Este forma o gel ou coágulo real no ensaio com microesferas.A trombina é um fator de coagulação. Essa proteína converte o fibrinogênio em fibrina, por isso a adicionamos ao ensaio. A aprotinina é um inibidor de protease sérico.Usamos isso para impedir qu

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

A cascata de adesão de plaquetas ocorre na presença de fluxo de cisalhamento, não um fator contabilizado em convencional (estática) bem-placa ensaios. Este artigo relata um ensaio de agregação plaquetária, utilizando um formato de prato bem-microfluídicos para emular condições fisiológicas do fluxo de cisalhamento.

Adesão e agregação plaquetária sob fluxo usando células de fluxo microfluídicos

Este vídeo demonstra um ensaio baseado em microesferas transportadoras modificadas incorporando pericitos para estudar o brotamento endotelial durante os estágios iniciais da angiogênese. O ensaio fornece um modelo experimental in vitro para entender os mecanismos moleculares da angiogênese e o efeito da terapêutica antiangiogenética.

Ensaio de germinação de grânulos para avaliação da angiogênese em estágio inicial: um modelo in vitro baseado em grânulos para estudar o brotamento endotelial na presença de pericitos

Foram utilizadas técnicas de microscopia e processamento de imagem com lapso de tempo para observar e analisar a compactação de gel mediada por fibroblasto e o realinhamento da fibra fibrina em um bioreator ambientalmente controlado durante um período de 48 horas.

Observando e quantificando compactação de gel de fibrina mediada por fibroblasto

A recapitulação do microambiente órgão-específico, que estimula a angiogênese local, é indispensável para a regeneração bem-sucedida dos tecidos danificados. Este relatório demonstra um novo método para implantar géis de fibrina na superfície pulmonar de camundongos vivos, a fim de explorar como o microambiente específico do pulmão modula a angiogênese e a regeneração alveolar em camundongos adultos.

Implantação de fibrina Gel no tapete do pulmão para o Estudo de angiogênese Lung-specific

As células cancerígenas são incorporadas em um gel de colágeno e, em seguida, ensanduichadas em um gel de fibrina acelular para gerar um sistema de cultura 3D no qual a invasividade e a formação de tumores satélites podem ser monitoradas.

Tridimensional Cultura Ensaio para Explorar Cancer Invasividade celular e formação de tumor Satélite

Este apresenta protocolo um grânulo de romance em vitro ensaio que mais apropriadamente modela o processo na vivo brotando angiogênese incorporando pericitos. Esta modificação permite que o ensaio de grânulo mais fielmente recapitular as interações heterotypic celulares entre células endoteliais e células murais que são críticas para a angiogênese.

Incorporando um grânulo de célula endotelial brotando ensaio pericitos

Aqui, apresentamos um protocolo para estudar a fisiopatologia da retinopatia diabética proliferativa usando tecidos derivados de paciente, cirurgicamente extirpado, fibrovasculares para cultura de tecido tridimensional nativa caracterização e ex vivo. Ex vivo modelo de cultura é também favorável para teste ou desenvolvimento de novos tratamentos.

Um modelo de cultura de tecidos de Ex Vivo para fibrovasculares complicações retinopatia diabética proliferativa

Este método descreve a cultura das células endotélias derivadas do iPSC como 40 microvasos 3D perfundidos em uma plataforma microfluídica padronizada. Esta plataforma permite o estudo do sprouting angiogenic gradiente-conduzido em 3D, incluindo a anastomose e a estabilização dos sprouts angiogenic em uma maneira escalável e high-throughput.

Ensaio padronizado e escalável para estudar perfundido 3D Angiogênico Sprouting de células endotelias derivadas do iPSC in vitro

O método aqui apresentado pode avaliar o efeito dos reagentes na angiogênese ou permeabilidade vascular in vivo sem coloração. O método utiliza injeção de dextran-FITC através da veia caudal para visualizar neovasos ou extravasamento vascular.

Ensaio de plugue de gel de matriz in vivo modificado para estudos de angiogênese

A fração vascular estromal isolada mecanicamente (SVF) em combinação com um hidrogel de fibrina oferece um transportador fácil e eficiente para células estromais derivadas de tecido adiposo viáveis para várias indicações, incluindo engenharia de tecidos e/ou fins de cicatrização de feridas. Aqui, apresentamos a preparação de uma construção mecânica de SVF (mSVF)-hidrogel de fibrina para pesquisa translacional e aplicação clínica.

A combinação de fração vascular estromal isolada mecanicamente e hidrogel de fibrina: um protocolo de processamento

Aqui, apresentamos um protocolo de eletroforese em gel de fibrinogênio-poliacrilamida (PAGE) para separar e exibir rapidamente os agentes fibrinogenolíticos de Sipunculus nudus.

Separação Rápida e Exibição de Agentes Fibrinogenolíticos Ativos em Sipunculus nudus por meio de Eletroforese em Gel de Fibrinogênio-Poliacrilamida

Aprenda o ensaio de fibrina com esferas para estudar angiogênese in vitro usando células endoteliais. Este método permite visualizar brotamento, formação de lúmen e ramificação em imagens de lapso de tempo.

Otimizado de fibrina Gel Assay Bead para o Estudo da angiogênese

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