Name: Análise do desenvolvimento de um fenótipo morfológico como uma função da concentração de proteínas em levedura de brotamento (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-24T16:05:00.000+00:00
Duration: 15 min 2 s
Description: Aprenda a analisar o desenvolvimento de fenótipos em Saccharomyces cerevisiae em função da concentração de proteínas. Este protocolo utiliza promotor regulável para expressão controlada em níveis populacionais e de célula única.

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Agradecemos a Brian G. Coon e Claudia B. Hanna para discussões úteis e de apoio. Este projecto foi apoiado pelo start-up fundos do Dep. de Ciências Biológicas, da Universidade Purdue de Claudio R. Aguilar e um American Cancer Society Research Grant Institucional de Claudio R. Aguilar através do Centro de Câncer Purdue.

A. Cultura de Células e indução de proteínas Esta seção descreve as condições de cultura celular, ciclo celular sincronização com Nocodazol, seguida de indução da expressão da proteína a partir de um promotor regulável em células de levedura. <ol><li> A cepa de levedura tipo selvagem W303 (leu2-3, 112 trp1-1 CAN1-100 ura3-1 ade2-1 his3-11, 15) é transformada com cópia de alta (2μ) DNA plasmídeo que contém o nosso gene de interesse (ENTH2) sob o controle de um promotor de metionina-repressor (MET25). 2mM metionina é suficiente para suprimir a atividade do promotor, enquanto a mídia sem metionina permite a expressão máxima. Assim, uma gama de concentrações de metionina pode ser usado para expressar a proteína no nível desejado. Transformação de um plasmídeo de DNA em células W303 é feito usando o método LiAc-TE acordo com os procedimentos padrão. 2 Nota: Este experimento deve ser realizado através do crescimento das células durante a noite, na presença de 2mM metionina para assegurar a expressão da proteína apenas em níveis de fundo. Na manhã seguinte, a expressão da proteína deve ser induzido pela ressuspensão das células em meios de falta de metionina imediatamente a sincronização do ciclo celular seguinte (cerca de 4h). No entanto, descobrimos que o ENTH2-dependente fenótipo divisão celular é induzida somente após uma concentração considerável de ENTH2 construiu nas células (geralmente depois de 4-6h de indução de proteínas 3), fazendo o curso de tempo para a análise de todas as manifestações de o fenótipo muito longo (pelo menos 16h). Descobrimos que as células de crescimento durante a noite, na presença de 0,2 mM metionina reprime o fenótipo morfológico, mas permite a concentração de proteína subcrítica que podem ser rapidamente aumentado para fenótipo induzindo-os níveis, quando transferido para mídia sem metionina. Isto permite uma análise detalhada das manifestações graves do defeito a divisão celular em um período relativamente curto de tempo. Nós, portanto, recomendamos que o experimentador determinar a concentração de metionina, que é sub-limiar para a indução do fenótipo em uma base caso a caso. </li><li> Escolha seis colônias de uma placa contendo as células recém-transformada e inocular em 50 ml de meios seletivos com 0,2 mM de metionina em um frasco esterilizado cônica usando técnicas estéreis. Incubar durante a 30 ° C com agitação a 200 rpm. (Para mais informações sobre as condições de cultura padrão fermento, ver ref. 4) </li><li> Na manhã seguinte, a densidade de células estimativa através da medição da densidade óptica da cultura em 600nm. Transferir o equivalente a 20 OD 600nm de células em um tubo de centrifugação estéril e colheita girando a 2200 rpm durante 5min à temperatura ambiente. </li><li> Ressuspender as células em YPD em uma concentração de 0,4 OD 600nm / ml e adicionar Nocodazol para uma concentração final de 15μg/ml de partir de um estoque de 1mg/ml em DMSO. Incubar por 4h a 30 ° C com agitação em 200 rpm. Nota: Os métodos alternativos de prisão, incluindo parada na fase G0 usando fator alfa-ou em fase G1-S usando hidroxiuréia pode ser usado. Nós descobrimos que a prisão em mitose utilizando Nocodazol é simples e eficaz o suficiente para os nossos propósitos. </li><li> Após 4h, verifique porcentagem de células em mitose preso pela contagem do número de células com igual gomos de tamanho através da visualização no microscópio. Se a prisão for superior a 90%, avance para o passo seguinte. Caso contrário, manter as células em Nocodazol até que a porcentagem desejada de paragem da mitose é alcançado. </li><li> Células colheita por centrifugação a 2200 rpm para 5min e lave com água gelada por três vezes. Após a lavagem final, ressuspender o sedimento em meios seletivos falta de metionina, a uma densidade de células de ~ 0,5 OD 600nm / ml. Transferência de metade do volume de células para um novo tubo estéril e adicionar metionina para uma concentração final 0,2 mM. Isto irá servir como um controle para efeitos devido aos níveis basais de expressão da proteína. Isto marca o primeiro ponto do tempo do experimento (tempo = 0h). Analise as células a cada hora por 6h. </li></ol> B. Análise do Desenvolvimento Fenótipo Nota: Todos os métodos de análise descritos a seguir não precisam ser executadas simultaneamente. Determinação dos níveis de expressão de proteínas por western Blotting <ol><li> Em cada ponto do tempo, medir o OD 600nm da cultura e colheita 2 OD 600nm equivalentes de células por centrifugação a 2200 rpm por 5 minutos. </li><li> Ressuspender o sedimento em 1 ml de água estéril e transferir a suspensão para um tubo eppendorf de 1,5 ml. Repetir a centrifugação para obter uma pelota. Aspirar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o sedimento em 50μl tampão de amostra SDS-PAGE Laemmli (50 mM Tris pH 6,8, SDS 2%, glicerol 10%, 2% β-mercaptoetanol e 0,006% de azul de bromofenol). Adicionar 50μl de contas ácido lavou o vidro (diâmetro 0,2-0,4 microns) e vortex por 1 min. </li><li> Tubos de ferver em um 95 ° C de calor block por 2 minutos, vortex durante 30 segundos e recomeçar a ferver durante 5 minutos. Congelar a amostra de proteína a -20 ° C. </li><li> Executar amostras de proteínas em um gel 12% SDS-PAGE, transferido para uma membrana de nitrocelulose e executar Western blotting com anticorpos adequado para detectar a proteína de interesse. Neste exemplo, investigar a presença de hemaglutinina (HA) com a tag domínios ENTH pela incubação com o mouse de anticorpos anti-HA (Covance, Princeton, NJ), 1:2000 diluição em Blotto-Tween (1XPBS, 5% de leite sem gordura seca , 0,1% Tween). HRP tag anticorpo de cabra anti-rato secundário (Pierce) na diluição 1:2.500 de, também em Blotto-Tween, é permitido ligar o anticorpo primário na membrana por 1h em temperatura ambiente. Supersignal Substrato Pico Oeste Chemiluminescent é usado para detectar anticorpos do mouse HRP tagged anti. </li><li> Quantificar os níveis de expressão da proteína por densitometria. </li></ol> Esta seção descreve dois métodos de desenvolvimento de fenótipo de rastreamento em função do aumento da concentração de proteína. O primeiro método é a célula de base populacional, enquanto os estudos de segundo, ao nível de uma única célula. Quantificação de divisão celular e morte celular fenótipo <ol><li> Em cada ponto do tempo, a transferência de 1 ml de suspensão celular para um tubo eppendorf estéril usando técnicas estéreis e células colheita por centrifugação a 2200 rpm por 5 minutos. </li><li> Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 70μl de mídia, seguidos por 30μl de metileno azul de um estoque de 1mg/ml em água estéril. Azul de metileno é um corante azul vital que se torne incolor no ambiente redutor do citoplasma, portanto, as células mortas podem ser identificados pela cor azul. </li><li> Pipeta ~ 6μl desta suspensão sobre uma lâmina de vidro limpa e coloque uma lamínula sobre a queda. Pressione a lamínula com cuidado para formar uma camada fina e uniforme de células entre as interfaces de vidro. </li><li> Divida a lamela em 9 quadrantes e tomar 3 imagens por quadrante, conforme indicado na figura. 2. O número de células / campo não deve ser maior que 30 células para permitir a quantificação precisa. Cada lamela pode ser trabalhada por aproximadamente 15 minutos antes que as bolhas de ar danificar a preparação. </li><li> Contar o número de células mostrando o fenótipo em estudo. O defeito divisão celular induzida sobre ENTH2 superexpressão leva à morte celular e, portanto, nós também contar o número de células mortas identificados pela cor azul. </li><li> Calcular a porcentagem de células fenotípicas. </li><li> Plotar os dados como mostrado na figura. 3. </li></ol> Visualização do fenótipo específico defeitos usando microscopia de fluorescência Divisão celular as células defeituosas, como visto em cima ENTH2 superexpressão, são muitas vezes caracterizados por defeitos da parede celular e mislocalization3 septina (visualizado como GFP fusão proteínas). A parede celular de levedura de brotamento podem ser facilmente visualizados através da coloração com calcofluor white (CFW), que se liga irreversivelmente a quitina na parede celular de levedura. <ol><li> Em todos os tempos ponto de 1ml, alíquotas da cultura em um tubo eppendorf estéril e as células da colheita por centrifugação a 2200 rpm por 5 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Ressuspender o pellet celular em 100μl de solução CFW 1mg/ml em água estéril e incubar por 5 minutos em temperatura ambiente no escuro. </li><li> Colheita de células por centrifugação e lavar 3 vezes com PBS 1X. </li><li> Ressuspender o sedimento em 100μl de 1X PBS e imagem sob o microscópio usando óptica UV (parede celular) e FITC filtro (GFP-septina) com ampliação de 100X. </li><li> Quantificar porcentagem de células com defeito da parede celular e mislocalization septina seguindo os passos 4-6 na seção B.2.1 </li></ol> B.3. Determinação do fenótipo de desenvolvimento no nível da célula única: Time-lapse de microscopia de vídeo. <ol><li> Limpar uma lâmina de vidro com uma depressão côncava com álcool 70% e deixar secar ao ar. </li><li> Ferva 0,06 g de agarose em 5ml meios seletivos falta de metionina em um tubo de vidro esterilizado no microondas até que a agarose se dissolva completamente. </li><li> 200μl rapidamente pipeta do agarose contendo mídia na depressão de slides e inverter uma outra lâmina de vidro limpa sobre ele, para que não se bolhas de ar ficam presos embaixo. </li><li> Quando o gel solidifica, mova o controle em cima sem problemas de distância da lâmina depressão, mantendo suas superfícies paralelas em todos os momentos. Isso garante que a superfície da cama agarose fique nivelada com a superfície da lâmina depressão. Limpe a região em torno da cama deslize agarose com um tecido delicado. O slide está pronto para uso. </li><li> Em tempo = 4 horas, 1 ml de transferência de células da cultura para um tubo eppendorf estéril e colheita por centrifugação a 2200 rpm por 5 minutos em temperatura ambiente. Nota: Recomenda-se um tempo mais tarde ponto de ser escolhido para garantir altos níveis de expressão da proteína para que o desenvolvimento fenótipo é garantida. As experiências-piloto são obrigados a detere tempos de indução em uma base caso a caso. </li><li> Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 100μl de produtos frescos faltam meios seletivos metionina. </li><li> Aplique vaselina nas bordas da lamínula. Em seguida, coloque uma gota de suspensão de células no centro da cama e espalhar uniformemente agarose pressionando suavemente uma lamela sobre eles. </li><li> Selar as bordas da lamínula com vaselina e corrigir a sua posição, alinhando as bordas com unha polonês. Aguarde até que a seca unha polonês. </li><li> Coloque o slide em um palco aquecida de um microscópio e escolher um campo que não contém mais de 10 células espaçadas adequadamente. Como as células se dividem, o campo vai ficar lotada com o tempo. </li><li> Ter uma imagem do campo a cada 5 minutos para a 5 horas. Progressão fenótipo pode ser estudado por montar as imagens em um filme usando software ImageJ ( <a name="cite">Rasband, WS, ImageJ, EUA National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, EUA, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997 -2005</a> ) </li></ol> Nota: Nós usamos microscópio Zeiss Axiovert 200M, Zeiss AxioCam MRM monocromática câmera digital e lente Carl Zeiss Axiovision software de aquisição de imagem (versão 4.4) para imagens de células vivas. Controle de temperatura é conseguida pela colocação de slides em um palco mantido aquecido a 30 ° C por 37 Pecon Tempcontrol dispositivo. A fim de evitar re-ajustar o foco repetidamente, é conveniente para programar o software de aquisição de imagem para adquirir automaticamente alguns z-stack imagens em todos os tempos ponto-e escolher a imagem com o melhor foco mais tarde, quando a montagem do filme. Alguns softwares de aquisição de imagem tem a opção de foco automático para experimentos curso do tempo. É conveniente usar essa opção em quando disponível. Células de levedura tipo selvagem crescem melhor a 30 ° C, portanto, de controle de temperatura é crítica. A fim de assegurar calor adequado, é útil para fornecer uma fonte externa de calor, além do estágio aquecida. Por exemplo, deixamos a luz transmitida branca do microscópio sobre para toda a duração da imagem. Também é fundamental para evitar bolhas de ar ao preparar a cama agarose e sanduíche de celular. O ar preso dentro da bolha se expande quando aquecida ao longo do tempo e tendem a levar as células de distância do campo que está sendo fotografada. Também é importante assegurar que as posições de células individuais dentro do campo não muda significativamente ao longo da duração do processo de imagem, especialmente durante a re-focalização tentativas. Plugins de estabilização de imagem estão disponíveis para ImageJ para corrigir pequenas mudanças na posição das células após o filme foi montado. ( <a href="http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html">http://www.cs.cmu.edu/ ~ kangli / / código Image_Stabilizer.html</a> ).

<ol><li>Rönicke, V., Graulich, W., Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+conditional+promoters+for+expression+of+heterologous+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Use of conditional promoters for expression of heterologous proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Enzymol. 283, 313-322 (1997).</li>
<li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGietz%2C+RD+%22High+efficiency+transformation+with+lithium+acetate+in+Molecular+Genetics+of+Yeast%3A+A+Practical+Approach%22">High efficiency transformation with lithium acetate in Molecular Genetics of Yeast: A Practical Approach</a>. , Oxford University Press Inc. New York. 121-134 (1994).</li>
<li>Mukherjee, D., Coon, B. G., Edwards, D. F., Hanna, C. B., Longhi, S. A., McCaffery, J. M., Wendland, B., Retegui, L. A., Bi, E., Aguilar, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yeast+endocytic+protein+Epsin+2+functions+in+a+cell-division+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The yeast endocytic protein Epsin 2 functions in a cell-division signaling pathway.</a> J Cell Sci. 122, 2453-2463 (2009).</li>
<li>Sherman, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSherman%2C+F+%22Getting+started+with+yeast+in+Guide+to+Yeats+genetics+and+Molecular+Biology%22">Getting started with yeast in Guide to Yeats genetics and Molecular Biology</a>. , Academic Press Inc. San Diego. 3-21 (1991).</li>
</ol>

Este protocolo descreve como monitorar o desenvolvimento de um fenótipo morfológico (célula de levedura capaz de se submeter a divisão celular propriamente dita) sobre superexpressão da proteína. Ao fazer este procedimento é importante para se lembrar de colher células de levedura por peletização na velocidade de centrifugação recomendada como velocidades mais rápidas podem danificar as células e os resultados obscuros. Azul de metileno e calcofluor branco deve ser adicionado ao vivo células pouco antes de imagens como ...

<table><tbody><tr><td>Nocodazol</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Metilênico a 1% (p/v)</td><td>Reagente</td><td>VWR international</td><td>VW6276-0</td><td></td></tr><tr><td>Calcoflúor Branco</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3543</td><td></td></tr><tr><td>Vaselina</td><td>Reagente</td><td>VWR international</td><td>VW3339-2</td><td></td></tr></tbody></table>

análise do desenvolvimento de um fenótipo morfológico como uma função da concentração de proteínas em levedura de brotamento

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Deleção do gene e superexpressão da proteína são métodos comuns para o estudo funções das proteínas. Neste artigo, descrevemos um protocolo para análise do desenvolvimento do fenótipo como uma função da concentração de proteína na população e de uma única célula em níveis<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;. Embora este protocolo é baseado na superexpressão de uma proteína, que pode facilmente ser adaptado para fenótipos morfológicos dependente supressão da expressão da proteína. Nosso laboratório está interessado em estudar as propriedades de sinalização do epsin endocítica adaptador de proteína. Para esse fim foi utilizada uma abordagem dominante negativo em que expressou a over-conservada<u&gt; E</u&gt; Psin<u&gt; N</u&gt; -<u&gt; T</u&gt; Erminal<u&gt; H</u&gt; Omology domínio (ENTH), a fim de interferir com as funções de endógenos epsin-2 (Ent2 ou YLR206W). Observamos que a superexpressão do domínio ENTH de Ent2 (ENTH2) em células de tipo selvagem levou a um defeito de divisão celular que é dependente do mislocalization de uma família de proteínas andaimes, septinas.

Deleção do gene e superexpressão da proteína são métodos comuns para o estudo funções das proteínas. Neste artigo, descrevemos um protocolo para análise do desenvolvimento do fenótipo como uma função da concentração de proteína na população e de uma única célula em níveis<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;.

Análise do desenvolvimento de um fenótipo morfológico como uma função da concentração de proteínas em levedura de brotamento

A deleção gênica e a superexpressão proteica são métodos comuns para estudar as funções das proteínas. Neste artigo, descrevemos um protocolo para a análise de ...

Este protocolo utiliza um promotor regulável que permite a expressão controlada de proteínas. Neste experimento, utilizamos um plasmídeo de alta cópia de dois mícrons que expressa o domínio N dois a partir de um promotor reprimível por metionina. Células de levedura selvagens são transformadas com este plasmídeo.Plasmídeos e transformantes são selecionados em placas sem uol. Após crescimento durante a noite. Em meio seletivo, as células são sincronizadas por interrupção do crescimento mediada pela ausência de cortisol.Por fim, a expressão é induzida pela transferência das células para meio sem metionina durante o experimento de curso temporal. A concentração proteica é monitorada por meio de western blotting e o desenvolvimento do fenótipo morfológico, por microscopia. Olá, sou Claudia do Departamento de Ciências Biológicas da Universidade Purdue.Sou de Bari Muji no alar e também no laboratório AL. Hoje vamos mostrar um procedimento para análise do desenvolvimento de um fenótipo morfológico em função da concentração de proteína no corpo indutor. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar os aspectos morfológicos e moleculares de um fenótipo de divisão celular observado após a superexpressão do domínio N dois da proteína adaptadora endocítica ausente dois.Então vamos começar. Este protocolo inicia-se com a construção de uma linhagem de levedura que expressará sua proteína de interesse. No nosso caso, transformamos a linhagem de levedura selvagem W 3 0 3 com DNA plasmidial de alta cópia que contém o gene nth dois sob o controle do promotor inibível por metionina; dois milimolares de metionina suprimem a atividade do promotor met 25.Embora o meio sem metionina permita expressão máxima, escolha seis colônias de uma placa contendo células recentemente transformadas e inocule em 50 mililitros de meio seletivo com 0,2 milimolar de metionina em um frasco cônico, incubando durante a noite a 30 graus Celsius com agitação a 200 RPM. Na manhã seguinte, estime a densidade celular medindo a densidade óptica do cultivo a 600 nanômetros. Transfira o equivalente a 20 OD a 600 nanômetros por mililitro de células para um tubo de centrífuga estéril e recolha por centrifugação.Re-suspenda as células em meio YPD por vortex para sincronizar o ciclo celular até uma concentração final de 15 microgramas por mililitro a partir de um estoque de um miligrama por mililitro em DMSO. Incube por quatro horas a 30 graus Celsius com agitação a 200 RPM. Após quatro horas, verifique a porcentagem de células arrestadas em mitose.Observando ao microscópio e contando o número de células com brotos de tamanho igual, prossiga para a próxima etapa. Apenas se a arrestação for superior a 90%, colete as células por centrifugação a 2200 RPM durante cinco minutos. Após três lavagens com água gelada, ressuspenda o pellet em meio seletivo sem metionina, com uma densidade celular de aproximadamente 0,5 OD a 600 nanômetros por mililitro.Transfira metade do volume das células para um novo tubo estéril e adicione metionina até uma concentração final de 0,2 milimolar. Isso servirá como controle para os efeitos devidos aos níveis basais de expressão proteica. Retorne ambas as culturas ao incubador a 30 graus Celsius.As células são analisadas quanto ao desenvolvimento do fenótipo a cada hora, durante seis horas, em cada momento. Transfira pontualmente um mililitro da suspensão celular de cada cultura para um tubo microcêntrifuga estéril e recolha as células por centrifugação, aspire o sobrenadante e re-suspenda o pellet em 70 microlitros de meio. Em seguida, adicione 30 microlitros de azul de metileno a partir de um estoque de um miligrama por mililitro em água estéril.Em seguida, pipete cerca de seis microlitros dessa suspensão sobre uma lâmina de vidro limpa e coloque uma lamínula sobre a gota. Pressione suavemente a lamínula para formar uma camada fina e uniforme de células entre as interfaces de vidro. Divida a lamínula em nove quadrantes e capture três imagens por quadrante.O número de células por campo não deve ser superior a 30 células para permitir uma quantificação precisa. Conte o número de células que apresentam o fenótipo em estudo, que, neste exemplo, são células de levedura brotando com brotos alongados e/ou concatenados que não conseguem se separar um do outro. Também contamos o número de células mortas, identificadas pela sua coloração azul, já que o defeito na divisão celular é induzido após nth.A superexpressão leva à morte celular para visualizar defeitos fenotípicos específicos em todos os momentos. Retire uma alíquota de um mililitro da cultura em um tubo microcêntrifuga estéril e recolha as células por centrifugação. Suspenda o pellet celular em 100 microlitros de solução de Calcofluor branco a um miligrama por mililitro em água estéril e incube por cinco minutos à temperatura ambiente no escuro.A coloração com branco de calcio permite a visualização da parede celular. Lave o precipitado três vezes com um volume de PBS. Suspendemos o precipitado final em 100 microlitros de PBS.Observe as células ao microscópio e adquira imagens em 100 x de magnificação utilizando óptica UV para visualizar a parede celular. Para visualizar septina marcada com GFP, adquira imagens utilizando um filtro FS E. Quantifique a porcentagem de células com defeitos na parede celular e deslocalização de septina utilizando o método mostrado anteriormente, dividindo a lamínula em nove quadrantes e obtendo três imagens por quadrante para contagem no vídeo de lapso de tempo. A microscopia de células individuais de levedura requer leitos de ágar embutidos em meio para a confecção do leito de ágar.Primeiro, limpe uma lâmina de vidro com depressão côncava usando álcool a 70% e deixe secar ao ar enquanto a lâmina está secando. Ferva 0,06 gramas de agros em cinco mililitros de meio seletivo sem metionina em um forno de micro-ondas até que o agros se dissolva completamente e rapidamente. Pipete 200 microlitros do meio contendo agros na lâmina.Pressione e inverta outro lâmina de vidro limpa sobre ela, certificando-se de que nenhuma bolha de ar fique aprisionada embaixo. Quando o gel solidificar, mova suavemente a lâmina de cima para longe da lâmina de depressão, mantendo sempre as superfícies paralelas. Isso garante que a superfície do leito de agarose fique nivelada com a superfície da lâmina de depressão.Limpe a região da lâmina ao redor do leito de agros com um tecido delicado. A lâmina está agora pronta para uso no tempo igual a quatro horas. Transfira um mililitro de células do cultivo para um tubo microcêntrifuga estéril e recolha por centrifugação.Aspire o sobrenatante e ressuspenda as células em 100 microlitros de meio seletivo fresco sem metionina. Aplique vaselina nas bordas da lamínula. Em seguida, coloque uma gota de suspensão celular no centro do leito de agros e espalhe uniformemente pressionando suavemente uma lamínula sobre ela.Selar as bordas da lamínula e fixar sua posição aplicando esmalte nas bordas. Após a secagem do esmalte, colocar a lâmina sobre a platina aquecida de um microscópio. Utilizamos um microscópio Zeiss Axio 200 M equipado com uma câmera digital monocromática Zeiss Axio camm, MRM, para escolher um campo que contenha não mais que 10 células adequadamente espaçadas, pois o campo ficará congestionado ao longo do tempo.À medida que as células se dividem, capture uma imagem do campo a cada cinco minutos durante cerca de cinco horas. Para evitar reajustar o foco repetidamente, programamos o software de aquisição de imagens para adquirir automaticamente algumas imagens de Zack em cada ponto temporal.A imagem com o melhor foco será selecionada posteriormente para montagem do filme, a fim de garantir calor adequado para as células; uma fonte externa de calor, além dos estágios aquecidos fornecidos por manter a luz branca transmitida do microscópio ligada durante toda a duração da aquisição de imagens, permite que a regressão do fenótipo seja estudada ao montar as imagens em um filme usando o software Image J. Aqui mostramos resultados representativos da superexpressão de nossa proteína de interesse. Nth dois.Primeiro, a expressão proteica da enésima proteína S2. Durante o período do experimento, lisados de células expressando HA-S2 foram analisados por meio de western blotting utilizando um anticorpo monoclonal anti-HA, conforme mostrado no imunoblot. Células cultivadas na presença de 0,2 milimolar de metionina apresentam expressão proteica mínima. No entanto, células cultivadas em meio sem metionina mostram um aumento constante na concentração de S2 ao longo do período do experimento.Em seguida, células cultivadas na presença ou ausência de metionina por seis horas foram analisadas, já que uma baixa concentração de nth dois é incapaz de induzir um fenótipo de divisão celular ou morte celular apenas. Uma baixa porcentagem de células está morta, conforme indicado por sua coloração azul após coloração com azul de metileno. Da mesma forma, o número de núcleos por célula, a organização da parede celular e dos septinas são normais, conforme esperado.Em contraste, a superexpressão de M dois leva a um defeito maciço na divisão celular e à morte celular, conforme demonstrado por longas cadeias de brotos alongados conectados que retêm a cor azul quando corados com azul de metileno. A maioria das células fenotípicas é multinucleada, conforme indicado pela coloração com DPI. A coloração com branco de calco demonstra acúmulos de manchas anormais na parede celular.Além disso, a septina está fortemente deslocalizada e desorganizada. A quantificação do fenótipo em função do tempo é mostrada neste gráfico, em que os círculos abertos representam zero milimolar de metionina e os círculos fechados representam 0,2 milimolar de metionina. Observamos aqui que, conforme a concentração de nth dois aumenta nas células ao longo do tempo, a porcentagem de células exibindo o fenótipo de divisão celular também aumenta.Células controle cultivadas em 0,2 mM de metionina mostram que o desenvolvimento do fenótipo é uma função da concentração elevada de proteína e não das condições de cultura celular. Por fim, o desenvolvimento do fenótipo após a superexpressão de Nth2 é registrado por microscopia de vídeo com lapso de tempo.Após quatro horas de nth, duas células com superexpressão exibem um fenótipo leve de divisão celular morfológica. Conforme o filme avança, observamos períodos anormais e prolongados de crescimento do broto apical, resultando em brotos muito alongados. Também observamos eventos de surgimento de novos brotos antes que um evento de separação celular tenha ocorrido.Além disso, observa-se que brotos surgem de diversas regiões da célula da mãe, dando origem a uma aparência ramificada. Acabamos de mostrar como caracterizar e analisar o desenvolvimento de um fenótipo morfológico em função da concentração de proteína na levedura brotante. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de ressuspender as células nas velocidades de centrifugação recomendadas, pois velocidades mais altas podem danificar as células.Também é importante lembrar de adicionar azul de metileno e cloreto logo antes da aquisição de imagens, pois são tóxicos para as células light east. Então, obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Biologia

Nós apresentamos um protocolo simples de se obter filmes de microscopia de fluorescência de crescimento de células de levedura, e um pacote de software baseado em GUI para extrair dados de séries temporais de uma única célula. A análise inclui linhagem automatizada e divisão atribuição tempo integrado com inspeção visual e curadoria manual de dados controladas.

Aquisição de fluorescência Filmes Time-lapse da levedura de brotamento e análise da dinâmica de células simples utilização de enxertos

A preparação de extractos de células de alta qualidade de levedura é um primeiro passo necessário para a análise de proteínas individuais ou proteomas inteiros. Aqui nós descrevemos um protocolo de homogeneização rápido, eficiente e confiável para as células de levedura de brotamento que foi otimizado para preservar as funções da proteína, interações e modificações pós-traducionais.

Brotando Yeast extração e purificação de proteínas para o estudo da função, interações e modificações pós-traducionais

Este artigo descreve um ensaio baseado no crescimento de leveduras para a determinação dos requisitos genéticos para a degradação de proteínas. Ele também demonstra um método para extração rápida de proteínas de levedura, adequado para western blotting para confirmar bioquimicamente os requisitos de degradação. Essas técnicas podem ser adaptadas para monitorar a degradação de uma variedade de proteínas.

Determinação baseado no crescimento e confirmação bioquímica de Requisitos Genéticos para a degradação de proteínas em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Fornecemos um método básico reprodutível para a microscopia de longo prazo do ciclo de vida sexual da levedura de fissão. Com pequenos ajustes descritos, o protocolo apresentado permite que a pesquisa se concentre em diferentes etapas do processo reprodutivo.

Microscopia de fissão de levedura Ciclo de Vida Sexual

Budding levedura é um modelo vantajoso para o estudo da dinâmica dos microtúbulos in vivo, devido às suas poderosas da genética e a simplicidade do seu citoesqueleto de microtúbulos. O protocolo a seguir descreve como transformar e cultura de células de levedura, adquirir imagens de microscopia confocal, e quantitativamente analisar a dinâmica dos microtúbulos em células de levedura viva.

Imagens de alta resolução e Análise de individuais Astral microtúbulos Dynamics em brotamento Yeast

Apresentamos um método para quantificar fenótipos de crescimento de células de levedura individuais à medida que crescem em colônias em meios sólidos usando microscopia de lapso de tempo denominada, avaliação de dobramento de uma célula de Living Arrays of Yeast (ODELAY). A heterogeneidade da população de células geneticamente idênticas que crescem em colônias pode ser observada e quantificada diretamente.

ODELAY: um método em larga escala para a quantificação multiparamétrica do crescimento de fermento

Regulamento translacional desempenha um papel importante no controle da abundância de proteína. Aqui, descrevemos um método de alta produtividade para análise quantitativa de tradução em brotamento levedura Saccharomyces cerevisiae.

Quantificação de todo o genoma de tradução no fermento Budding pelo Ribossoma perfilamento

Esta molécula fluorescência em situ da hibridação protocolo é otimizado para quantificar o número de moléculas de RNA em leveduras brotamento durante a meiose e crescimento vegetativo.

Única molécula fluorescência In Situ Hybridization (smFISH) análise em Budding fermento crescimento vegetativo e meiose

Aqui, apresentamos uma implementação de MATLAB de detecção automatizada e descrição quantitativa de gotas lipídicas em imagens de microscopia de fluorescência de fissão e brotamento de células de levedura.

Análise de conteúdo de gotas lipídicas em leveduras de fissão e brotamento usando processamento automatizado de imagens

Este manuscrito descreve um método para triagem de bibliotecas mutantes de Candida albicans de tamanho moderado para fenótipos de morfogênese durante a infecção ativa em um hospedeiro mamífero usando microscopia confocal não invasiva.

Uso de imagens in vivo para rastrear fenótipos de morfogênese em cepas mutantes de Candida albicans durante a infecção ativa em um hospedeiro mamífero

Este protocolo detalha dois métodos de parada do ciclo celular de levedura e liberação opcional, e elabora o uso de microscopia de fluorescência para estudar processos dependentes do ciclo celular em S. cerevisiae.

Manipulação e Análise de Processos Dependentes do Ciclo Celular em Leveduras de Brotamento

Aprenda a analisar o desenvolvimento de fenótipos em Saccharomyces cerevisiae em função da concentração de proteínas. Este protocolo utiliza promotor regulável para expressão controlada em níveis populacionais e de célula única.

Análise do desenvolvimento de um fenótipo morfológico como uma função da concentração de proteínas em levedura de brotamento

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