Análise do desenvolvimento de um fenótipo morfológico como uma função da concentração de proteínas em levedura de brotamento

Este protocolo utiliza um promotor regulável que permite a expressão controlada de proteínas. Neste experimento, usamos um plasmídeo de dois mícrons de alta cópia que expressa o domínio N dois de um promotor repressível de metionina. As células de levedura do tipo selvagem são transformadas com isso.

Plasmídeos e transformantes são selecionados em placas sem uol. Após o crescimento durante a noite. Em meios seletivos, as células são sincronizadas por nenhum crescimento mediado por cortisol. Prender.

Finalmente, e a expressão é induzida pela transferência de células para meios sem metionina durante o experimento do curso do tempo. A concentração de proteínas é monitorada por western blotting e o desenvolvimento do fenótipo morfológico por microscopia. Olá, sou Claudia no Departamento de Ciências Biológicas da Universidade de Purdue.

Eu sou de Bari Muji no alar e eu sou e também no laboratório AL. Hoje vamos mostrar um procedimento para análise do desenvolvimento de um fenótipo morfológico em função da concentração de proteína na indução corporal. Usamos este procedimento em nosso laboratório para estudar os aspectos morfológicos e moleculares de um fenótipo de divisão celular observado após a superexpressão do domínio N dois da proteína adaptativa endocítica ausente de dois.

Então vamos começar. Este protocolo começa com a construção de uma cepa de levedura que expressará sua proteína de interesse. Em nosso caso, transformamos a cepa de levedura do tipo selvagem W 3 0 3 com DNA de plasma de alta cópia que contém nth dois sob o controle do promotor repressível de metionina dois milimolares suprime a atividade do promotor 25.

Embora o meio sem metionina permita a expressão máxima, pegue seis colônias de uma placa contendo células recém-transformadas e inocule em 50 mililitros de meio seletivo com metionina 0,2 milimolar em um frasco cônico, incube durante a noite a 30 graus Celsius com agitação a 200 RPM na manhã seguinte. Estime a densidade celular medindo a densidade óptica da cultura em 600 nanômetros. Transferir o equivalente a 20 OD 600 nanômetros por mililitro de células para um tubo de centrífuga estéril e colher por centrifugação.

Suspenda novamente as células em meio YPD por vórtice para sincronizar o aole do ciclo celular a uma concentração final de 15 microgramas por mililitro de um estoque de um miligrama por mililitro em DMSO. Incubar durante quatro horas a 30 graus Celsius com agitação a 200 RPM. Após quatro horas, verifique a porcentagem de células presas na mitose.

Visualizando ao microscópio e contando o número de células com botões de tamanhos iguais, prossiga para a próxima etapa. Somente se a parada for superior a 90%Colha as células por centrifugação a 2200 RPM por cinco minutos. Após três lavagens com água gelada, resus, suspenda o pellet em meio seletivo sem metionina a uma densidade celular de cerca de 0,5 OD 600 nanômetros por mililitro.

Transfira metade do volume das células para um novo tubo estéril e adicione metionina a uma concentração final de 0,2 milimolar. Isso servirá como um controle para os efeitos devido aos níveis basais de expressão de proteínas. Retorne ambas as culturas para a incubadora de 30 graus Celsius.

As células são analisadas quanto ao desenvolvimento do fenótipo a cada hora por seis horas de cada vez. Transfira um mililitro de suspensão celular de cada cultura para um tubo de microfuga estéril e colha as células por centrifugação, aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 70 microlitros de meio. Em seguida, adicione 30 microlitros de azul de metileno de um estoque de um miligrama por mililitro em água estéril.

Em seguida, pipete cerca de seis microlitros desta suspensão em uma lâmina de vidro limpa e coloque uma lamínula sobre a gota. Pressione a lamínula suavemente para formar uma fina camada uniforme de células entre as interfaces de vidro. Divida a lamínula em nove quadrantes e tire três imagens por quadrante.

O número de células por campo não deve ser superior a 30 células para permitir uma quantificação precisa. Conte o número de células que mostram o fenótipo em estudo, que neste exemplo são células de levedura brotando com botões alongados e/ou concatenados que não conseguem se separar uns dos outros. Também contamos o número de células mortas identificadas por sua cor azul desde o defeito de divisão celular induzido em nth.

Duas superexpressões levam à morte celular para visualizar defeitos específicos do fenótipo a cada vez. Aponte alíquota de um mililitro de cultura em um tubo de microfuga estéril e colha as células por centrifugação reus. Suspenda o pellet celular em 100 microlitros de um miligrama por mililitro, aqueça a solução branca em água estéril e incube por cinco minutos em temperatura ambiente no escuro.

A coloração com branco calcior permite a visualização da parede celular e. Lave o pellet três vezes com um XPBS. Suspendemos o pellet final em 100 microlitros de PBS.

Observe as células ao microscópio e adquira imagens com ampliação de 100 x usando óptica UV para visualizar a parede celular. Para visualizar as imagens de aquisição de septina marcadas com GFP usando um filtro FS E, quantifique a porcentagem de células com defeitos na parede celular e localização incorreta da septina usando o método mostrado anteriormente, dividindo a lamínula em nove quadrantes e tirando três imagens por quadrante para contagem de vídeo TimeLapse. A microscopia de células de levedura individuais requer leitos agros incorporados em meios para fazer um leito agros.

Primeiro limpe uma lâmina de vidro com uma depressão côncava com 70% de álcool e deixe-a secar ao ar enquanto a lâmina está secando ao ar. Ferva 0,06 gramas de agros em cinco mililitros de meios seletivos sem metionina no micro-ondas até que o agros se dissolva completamente rapidamente. Pipetar 200 microlitros dos meios agros contendo na lâmina.

Depressão e inverta outra lâmina de vidro limpa sobre ela, certificando-se de que nenhuma bolha de ar fique presa embaixo. Quando o gel solidificar, mova a lâmina na parte superior suavemente para longe da lâmina de depressão, mantendo suas superfícies paralelas o tempo todo. Isso garante que a superfície do leito de agros esteja nivelada com a superfície da lâmina de depressão.

Limpe a região da lâmina ao redor do leito agros com um lenço delicado. O slide agora está pronto para uso em um tempo igual a quatro horas. Transfira um mililitro de células da cultura para um tubo de microfuga estéril e colha por centrifugação.

Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 100 microlitros de meios selectivos frescos sem metionina. Aplique vaselina nas bordas da lamínula. Em seguida, coloque uma gota de suspensão celular no centro do leito agros e espalhe uniformemente pressionando suavemente uma lamínula sobre ela.

Sele as bordas da lamínula e fixe sua posição forrando as bordas com esmalte. Quando o esmalte estiver seco, coloque a lâmina em um palco aquecido de um microscópio. Usamos um microscópio Zeiss Axio 200 M equipado com uma câmera digital monocromática Zeiss Axio camm, MRM para escolher um campo que não contenha mais de 10 células espaçadas adequadamente, pois o campo ficará lotado com o tempo.

À medida que as células se dividem, tire uma imagem do campo a cada cinco minutos por cerca de cinco horas. Para evitar reajustar o foco repetidamente. Programamos o software de aquisição de imagens para adquirir automaticamente algumas imagens Zack em todos os momentos.

A imagem com o melhor foco será selecionada posteriormente para a montagem do filme, a fim de garantir o calor adequado para as células, uma fonte externa de calor, além dos estágios aquecidos fornecidos por deixar a luz branca transmitida do microscópio ligada durante toda a duração da regressão do fenótipo da imagem, pode ser estudada montando as imagens em um filme usando o software Image J. Aqui mostramos resultados representativos de superexpressão de nossa proteína de interesse. Enésimo dois.

Primeiro, a expressão da proteína do enésimo dois. Durante o decorrer do experimento foram determinados lisados de células que expressam HA, dois foram analisados por western blotting usando um anticorpo monoclonal anti HA, conforme mostrado pelas células imunoblot cultivadas na presença de 0,2 milimolar de metionina com expressão proteica mínima. No entanto, as células cultivadas em meios sem metionina mostram um aumento consistente na concentração de S dois ao longo do experimento.

Em seguida, foram analisadas células cultivadas na presença ou ausência de metionina por seis horas, uma vez que uma concentração baixa de n-ésimos dois é incapaz de induzir apenas um fenótipo de divisão celular ou morte celular. Uma baixa porcentagem de células está morta, conforme indicado por sua cor azul, após a coloração com azul de metileno. Da mesma forma, o número de núcleos por célula, a parede celular e a organização das septinas são normais como esperado.

Em contraste, a expressão excessiva de M dois leva a um defeito maciço de divisão celular e morte celular, conforme demonstrado por longas cadeias de botões alongados conectados que retêm a cor azul quando corados com azul de metileno. A maioria das células fenotípicas é multinucleada, conforme indicado pela coloração DPI. A coloração branca de calcior demonstra acúmulos das manchas anormais da parede celular.

Além disso, a septina é grosseiramente mal localizada e desorganizada. A quantificação do fenótipo em função do tempo é mostrada neste gráfico, onde os círculos abertos representam zero milimolar de metionina e os círculos fechados representam 0,2 milimolar de metionina. Vemos aqui que, à medida que a concentração de enésimos dois se acumula nas células ao longo do tempo, a porcentagem de células que mostram o fenótipo de divisão celular também aumenta.

Células de controle cultivadas a 0,2. A milimetionina mostra que o desenvolvimento do fenótipo é uma função da concentração elevada de proteínas e não devido às condições de cultura de células. Finalmente, o desenvolvimento do fenótipo após a enésima superexpressão de dois é capturado por microscopia de vídeo com lapso de tempo.

Após quatro horas de enésima, duas células de superexpressão mostram um fenótipo de divisão celular morfológica leve. À medida que o filme avança, vemos períodos anormais e prolongados de crescimento dos botões apicais, dando origem a botões muito alongados. Também vemos eventos de surgimento de novos botões antes que um evento de separação celular ocorra.

Além disso, observa-se que os botões emergem de várias regiões da célula da mãe, dando origem a um ramo para aparecer. Acabamos de mostrar como caracterizar e analisar o desenvolvimento de um fenótipo morfológico em função da concentração de proteínas na lista de brotamento. Ao fazer este procedimento, é importante lembrar de acariciar as células nas velocidades de centrifugação recomendadas, pois velocidades mais rápidas podem danificar as células.

Também é importante lembrar de adicionar azul de metileno e cloreto antes da imagem, pois são tóxicos para as células do leste claro. Então, obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.