Identificação de fenótipos inibição do crescimento induzido pela expressão de Effectors Tipo III bacteriana em Yeast

Para iniciar este protocolo, selecione um vetor para a expressão de seu efetor bacteriano favorito. Na levedura e na cepa de levedura, o vetor é então transformado em células de levedura. A próxima expressão do efetor é induzida.

As células induzidas são lisadas para análise subsequente de western blot para verificar a expressão do efetor. Depois de confirmar a expressão das células efetoras, cresce e dez vezes, a diluição em série é detectada em meios repressores e indutores. Finalmente, após dois a três dias, o crescimento da levedura é analisado.

Olá, sou Do Solomon do laboratório do Dr. Guido Cesa no Departamento de Ciências Vegetais da Universidade de Tel Aviv. Hoje mostraremos um procedimento para a identificação de fenótipos de inibição de crescimento induzidos pela expressão de efetores bacterianos tipo três em leveduras. Utilizamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar a função dos efetores tipo três de bactérias gram-negativas patogênicas e é uma ferramenta que nos auxilia na identificação dos alvos efetores da TIC.

Então vamos começar. Vários fatores importantes devem ser considerados e otimizados ao projetar um sistema de levedura apropriado para a expressão dos efetores do tipo três de interesse. O primeiro é a expressão motriz do promotor dos efetores.

Como os efetores bacterianos do tipo três podem ser tóxicos para as células de levedura, um promotor induzível deve ser usado para controlar sua expressão. Usaremos o promotor GAL one neste experimento. O segundo fator é o número de cópias do gene efetor.

Altos níveis de expressão são alcançados quando o gene efetor é transportado por um plasmídeo de dois mícrons. A expressão intermediária é obtida usando um centrômero contendo plasmídeo, e a baixa expressão é alcançada quando o gene efetor é integrado ao genoma da levedura por recombinação homóloga. Um terceiro fator a ser considerado é a marcação de epítopo usada para verificar a expressão da proteína nos casos em que os anticorpos contra o efetor de interesse não estão disponíveis.

As etiquetas comumente usadas são M, hemaglutinina, HA ou sinalização, para as quais anticorpos comerciais confiáveis estão disponíveis. Sugerimos o uso de apenas uma cópia da etiqueta para minimizar os efeitos deletérios indesejados na estrutura e atividade da proteína efetora. Por último, mas não menos importante, a estirpe de levedura a utilizar para a expressão deve ser trópica em relação ao marcador seleccionável do vector de expressão.

Para cultivar células de levedura para transformação, escolha uma colônia de levedura de um prato fresco e inocule três mililitros de YPD em um vórtice de tubo de polipropileno de 15 mililitros. Coloque brevemente o tubo de cultura em um rolo e incube durante a noite a 30 graus Celsius com rotação constante. Na manhã seguinte, retirar a cultura do rolo e centrifugar a 800 Gs durante cinco minutos à temperatura ambiente.

Após centrifugação, remova completamente o sobrenadante e ressuspenda as células em um mililitro de tampão de suspensão Resus misturado por vórtice na velocidade máxima por cerca de 10 segundos. Para cada plasmídeo a ser transformado e uma transformação de controle adicional, transfira 100 microlitros da suspensão celular para um tubo de microfuga. Adicione cinco microlitros de esperma de salmão de fita simples, DNA e 250 a 500 nanogramas de DNA plasmático a cada tubo, exceto ao tubo de controle.

Em seguida, adicione 650 microlitros de solução de transformação a cada tubo e vórtice. Incube os tubos a 30 graus Celsius por 30 minutos em um rolo. Quando a incubação estiver completa, adicione 70 microlitros de DMSO a cada tubo e misture invertendo os tubos 10 a 15 vezes para evitar quebrar as células.

Não vórtice os tubos. Coloque os tubos em um banho-maria pré-aquecido a 42 graus Celsius e incube por 15 minutos. Após 15 minutos, retire os tubos do banho-maria e coloque-os imediatamente no gelo por dois minutos.

Depois que os tubos esfriarem, colha as células por centrifugação e, em seguida, use um pipetador Para remover cuidadosamente o sobrenadante viscoso. Ressuspenda cada pellet em 150 microlitros de água bidestilada estéril e espalhe a suspensão celular em uma placa com o meio seletivo apropriado. Deixe as placas abertas por dois minutos e deixe-as secar em uma capela de fluxo laminar.

Depois disso, coloque as placas em uma incubadora de 30 graus Celsius por dois a três dias para cultivar células de levedura. Para preparar um extrato de proteína, inocular três mililitros do meio repressor apropriado com colônia de levedura de uma placa fresca e vórtice. Coloque brevemente o tubo de cultura em um rolo a 30 graus Celsius no dia seguinte.

Retirar a cultura do rolo e centrifugar a 800 Gs durante cinco minutos à temperatura ambiente, rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento da célula. Em três mililitros de DDW estéril misturado por centrífuga de vórtice, novamente, descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em três mililitros de DDW estéril. Agora transfira 200 microlitros da suspensão celular para um novo tubo de 15 mililitros contendo três mililitros do meio indutor apropriado misturado por vórtice.

Coloque o tubo em um rolo e incube durante a noite a 30 graus Celsius na manhã seguinte. Transfira um mililitro da cultura ou mais para culturas de baixa densidade para um tubo de microcentrífuga. Colha as células por centrifugação a 800 Gs por cinco minutos em temperatura ambiente a partir daqui, trabalhe em uma capela para evitar a respiração de vapores tóxicos de capto etanol Beamer.

Remova cuidadosamente o sobrenadante usando um pipetador e suspenda novamente o pellet celular em 100 microlitros de solução de lise gelada. Misture vigorosamente por vórtice e incube no gelo por 30 minutos. Durante a incubação de 30 minutos, determine o volume de seis ácidos clorídricos normais necessários para titular 100 microlitros de tampão de lise a pH de nove a 10.

Para fazer isso, adicione vários volumes de ácido clorídrico a 100 microlitros de tampão de lise em 10 tubos diferentes e verifique o pH da solução usando uma tira indicadora de pH no final da incubação no volume apropriado de ácido clorídrico para o lisado e misture por vórtice. Em seguida, adicione 50 microlitros de três x tampão de amostra ao lisado e misture por punção de vórtice, um orifício na tampa do tubo de micro fuga com uma agulha e ferva a solução de lisado no bloco de aquecimento por cinco minutos. Após fervura, deixe a solução esfriar por dois minutos em temperatura ambiente.

Em seguida, vórtice a solução lisada e gire para baixo por 10 segundos. O lisado agora está pronto para análise imunosanguínea para preparar as células para o ensaio de spotting. Cultive três culturas de mililitros de cada cepa, conforme mostrado anteriormente no dia seguinte.

Prepare duas placas contendo meio sintético completo sem leucina. O meio de uma placa deve ser complementado com 2% de glicose e o da outra placa com 2% de actose e 1% de rafinose. Seque as placas em uma capela de fluxo laminar estéril em temperatura ambiente por 20 minutos.

Colha as células e ressuspenda cada pellet celular em três mililitros de DDW estéril. Repita a etapa de centrifugação e ressuspenda as células novamente em três mililitros de DDW estéril. Determine a densidade óptica ou DO de cada cultura e, em seguida, prepare suspensões de células de um mililitro com um OD 600 de um em tubos de microfichas estéreis.

Em seguida, prepare três diluições seriais de dez vezes de cada uma das suspensões celulares usando três microtubos estéreis cheios de 900 microlitros de DDW estéril. Coloque as placas secas em uma grade e, para cada ponto de cultura, 10 microlitros da diluição de quatro em uma fileira. Após a mancha, deixe as placas abertas no capô por alguns minutos.

Quando as manchas estiverem secas, cubra as placas e coloque-as em uma incubadora de 30 graus Celsius por dois a três dias. Agora mostraremos os resultados de um ensaio de mancha de levedura para detecção de inibição de crescimento. Fenótipos induzidos pela expressão de efetores do tipo três aqui, os efetores do tipo três, A-V-R-P-T-O hop, AA um e AAV RE um da bactéria.

O caminho de Pseudomona Riner do nosso tomateiro foi expresso a partir de um centrômero contendo plasmídeo em uma cepa de levedura em cepas de levedura repressoras de meio carreador de plasmídeo para a expressão de A-V-R-P-T-O e HOP AA; uma exibiu crescimento semelhante à cepa controle contendo um vetor vazio. Enquanto a levedura portadora de AAV RE um apresentou um crescimento ligeiramente reduzido, provavelmente devido ao vazamento do promotor GAL um e à alta citotoxicidade do AV RE, sob condições indutoras a expressão de AV E um ou HOP AA um causou um fenótipo drástico de inibição do crescimento refletido pela falta de colônias em qualquer diluição. Em contraste, a expressão de A-V-R-P-T-O não exerceu nenhum efeito inibidor do crescimento.

Acabamos de mostrar como identificar fenótipos de inibição de crescimento causados pela expressão de efetores bacterianos tipo três em leveduras. Ao fazer este procedimento, é importante lembrar de escolher cuidadosamente o vetor de expressão, bem como esta cepa, pois ambos podem afetar drasticamente os resultados. Além disso, lembre-se de usar essas colônias recém-transformadas em todas as etapas do procedimento.

Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.