Identificação de fenótipos inibição do crescimento induzido pela expressão de Effectors Tipo III bacteriana em Yeast

Para iniciar este protocolo, selecione um vetor para a expressão do seu efetor bacteriano de interesse. Em levedura e linhagem de levedura, o vetor é então transformado em células de levedura. Em seguida, a expressão do efetor é induzida.

Células induzidas são lisadas para análise subseqüente por western blot para verificar a expressão do efetor. Após confirmar a expressão do efetor, as células são cultivadas e diluições seriadas de dez vezes são colocadas em meios repressores e indutores. Finalmente, após dois a três dias, o crescimento de levedura é analisado.

Olá, sou Do Solomon do laboratório do Dr. Guido Cesa do Departamento de Ciências Vegetais da Universidade de Tel Aviv. Hoje vamos mostrar um procedimento para a identificação de fenótipos de inibição do crescimento induzidos pela expressão de efetores bacterianos do tipo três em levedura. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a função de efetores do tipo três de bactérias patogênicas gram-negativas e é uma ferramenta que nos auxilia na identificação dos alvos TIC dos efetores.

Então vamos começar. Vários fatores importantes devem ser considerados e otimizados ao projetar um sistema de levedura apropriado para a expressão dos efetores do tipo três de interesse. O primeiro é o promotor que controla a expressão dos efetores.

Como os efetores bacterianos do tipo três podem ser tóxicos para células de levedura, um promotor induzível deve ser usado para controlar sua expressão. Neste experimento, utilizaremos o promotor GAL1. O segundo fator é o número de cópias do gene do efetor.

Altos níveis de expressão são alcançados quando o gene efetor é carregado por um plasmídeo de dois mícrons. A expressão intermediária é obtida utilizando um plasmídeo contendo centrômero, e a expressão baixa é alcançada quando o gene efetor é integrado no genoma de levedura por meio de recombinação homóloga. Um terceiro fator a ser considerado é a marcação com epítopo utilizada para verificar a expressão proteica em casos nos quais anticorpos contra o efetor de interesse não estão disponíveis.

As marcas frequentemente utilizadas são a hemaglutinina M HA ou a marca flag, para as quais existem anticorpos comerciais confiáveis. Sugerimos utilizar apenas uma cópia da marca para minimizar efeitos deletérios indesejados sobre a estrutura e a atividade da proteína efetora. Por último, mas não menos importante, a linhagem de levedura a ser utilizada para expressão deve ser compatível com o marcador selecionável do vetor de expressão.

Para cultivar células de levedura para transformação, escolha uma colônia de levedura de uma placa fresca e inocular três mililitros de YPD em um tubo de polipropileno de 15 mililitros. Coloque brevemente o tubo de cultura em um agitador rotativo e incubar durante a noite a 30 graus Celsius com rotação constante. Na manhã seguinte, remova a cultura do agitador rotativo e centrifugue a 800 Gs por cinco minutos à temperatura ambiente.

Após a centrifugação, remova completamente o sobrenadante e ressuspenda as células em um mililitro de tampão de ressuspensão Resus, misturando em vórtex na velocidade máxima por cerca de 10 segundos. Para cada plasmídeo a ser transformado e para uma transformação controle adicional, transfira 100 microlitros da suspensão celular para um tubo microfuga. Adicione cinco microlitros de DNA de esperma de salmão de fita simples e de 250 a 500 nanogramas de DNA plasmidial a cada tubo, exceto ao tubo controle.

Em seguida, adicione cuidadosamente 650 microlitros da solução de transformação a cada tubo e vortexie. Incube os tubos a 30 graus Celsius por 30 minutos em um agitador rotativo. Quando a incubação estiver concluída, adicione 70 microlitros de DMSO a cada tubo e misture invertendo os tubos de 10 a 15 vezes para evitar romper as células.

Não agite os tubos em vórtex. Coloque os tubos em um banho-maria pré-aquecido a 42 graus Celsius e incube por 15 minutos. Após 15 minutos, retire os tubos do banho-maria e coloque-os imediatamente no gelo por dois minutos.

Após os tubos terem esfriado, recolha as células por centrifugação e, em seguida, use uma pipeta para remover cuidadosamente o sobrenadante viscoso. Re-suspenda cada pellet em 150 microlitros de água estéril bidestilada e espalhe a suspensão celular em uma placa contendo o meio seletivo apropriado. Deixe as placas abertas por dois minutos e permita que sequem em uma cabine de fluxo laminar.

Em seguida, coloque as placas em um incubador a 30 graus Celsius por dois a três dias para cultivar as células de levedura. Para preparar um extrato proteico, inocular três mililitros do meio repressor apropriado com colônia de levedura de uma placa fresca e vortexar. No dia seguinte, colocar brevemente o tubo de cultura em um rolo a 30 graus Celsius.

Retire a cultura do rolo e centrifugue a 800 G por cinco minutos à temperatura ambiente, descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular. Em três mililitros de água destilada estéril (DDW), misture por vortex e centrifugue novamente; descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em três mililitros de água destilada estéril (DDW). Agora, transfira 200 microlitros da suspensão celular para um novo tubo de 15 mililitros contendo três mililitros do meio indutor apropriado, misturado por vortex.

Coloque o tubo em um agitador rotativo e incube durante a noite a 30 graus Celsius. Na manhã seguinte, transfira um mililitro da cultura, ou mais no caso de culturas de baixa densidade, para um tubo de microcentrífuga. Recolha as células por centrifugação a 800 Gs durante cinco minutos à temperatura ambiente. A partir daqui, trabalhe em uma cabine de segurança química para evitar a inalação de vapores tóxicos de etanol Beamer capto.

Remova cuidadosamente o sobrenadante utilizando uma pipeta e re-suspenda o pellet celular em 100 microlitros de solução de lise gelada. Misture vigorosamente por vortex e incube em gelo por 30 minutos. Durante a incubação de 30 minutos, determine o volume de ácido clorídrico normal seis necessário para titular 100 microlitros de tampão de lise até pH nove a 10.

Para fazer isso, adicione diferentes volumes de ácido clorídrico a 100 microlitros de tampão de lise em 10 tubos diferentes e verifique o pH da solução utilizando uma tira indicadora de pH ao final da incubação, adicionando o volume apropriado de ácido clorídrico ao lisado e misturando por vortex. Em seguida, adicione 50 microlitros de tampão amostral 3x ao lisado e misture por vortex. Fure um orifício na tampa do tubo de microcentrífuga com uma agulha e aqueça a solução de lisado em bloco de aquecimento por cinco minutos. Após a fervura, deixe a solução esfriar por dois minutos à temperatura ambiente.

Em seguida, vortexe a solução de lisado e centrifugue por 10 segundos. O lisado está agora pronto para análise imunológica do sangue para preparar as células para o ensaio de spotting. Incube culturas de três mililitros de cada linhagem conforme mostrado anteriormente no dia seguinte.

Prepare dois placas contendo meio sintético completo sem leucina. O meio de uma placa deve ser suplementado com 2% de glicose e o da outra placa com 2% de galactose e 1% de rafinose. Seque as placas em capela de fluxo laminar estéril à temperatura ambiente por 20 minutos.

Colete as células e re-suspenda cada pellet celular em três mililitros de água destilada estéril (DDW). Repita a etapa de centrifugação e re-suspenda as células novamente em três mililitros de água destilada estéril (DDW). Determine a densidade óptica ou DO de cada cultura e, em seguida, prepare suspensões celulares de um mililitro com uma DO 600 de um em tubos microficha estéreis.

Em seguida, prepare três diluições seriadas de dez vezes a partir de cada uma das suspensões celulares utilizando três microtubos estéreis contendo 900 microlitros de água destilada estéril. Coloque as placas secas sobre uma grade e, para cada ponto de cultura, aplique 10 microlitros das quatro diluições em sequência. Após a aplicação, deixe as placas abertas na câmara de fluxo laminar por vários minutos.

Quando as colônias estiverem secas, cubra as placas e coloque-as em uma estufa a 30 graus Celsius por dois a três dias. Agora mostraremos os resultados de um ensaio de spotting de levedura para detecção de inibição de crescimento. Fenótipos induzidos pela expressão de efetores do tipo três aqui, os efetores do tipo três, A-V-R-P-T-O hop, AA one one e AAV RE one da bactéria.

A via Pseudomona Riner do nosso tomate foi expressa a partir de um plasmídeo contendo centrômero em uma linhagem de levedura em meio repressor. Linhagens de levedura portadoras do plasmídeo para a expressão de A-V-R-P-T-O e HOP AA um um exibiram crescimento semelhante ao da linhagem controle contendo um vetor vazio. Enquanto isso, leveduras portadoras de AAV RE um apresentaram crescimento ligeiramente reduzido, provavelmente devido ao vazamento do promotor GAL um e à alta citotoxicidade de AV RE um. Em condições indutoras, a expressão de AV E um ou HOP AA um um causou um fenótipo de inibição drástica do crescimento, refletido pela ausência de colônias em qualquer diluição. Em contraste, a expressão de A-V-R-P-T-O não exerceu nenhum efeito inibidor do crescimento.

Acabamos de mostrar como identificar fenótipos de inibição do crescimento causados pela expressão de efetores bacterianos do tipo três em levedura. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de escolher cuidadosamente o vetor de expressão, bem como esta linhagem, já que ambos podem afetar drasticamente os resultados. Além disso, lembre-se de usar colônias recém-transformadas em todas as etapas do procedimento.

É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.