Name: Labeling fluorescentes de COS-7 expressando as proteínas SNAP tag-Fusion para imagens de células vivas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Aprenda a rotular proteínas com SNAP-tag em células COS-7 vivas para imagens fluorescentes. Este método permite visualizar dinâmicas proteicas em tempo real sem clonagens repetidas.

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Kai Johnsson Ivan Correa Andreas Brecht Katrin Müentener Chris Noren Luo dom Ming Xu Theodore Davis Salvatore Russello Aihua Zhang Inca Ghosh Elissa Maunus Nicholas Labarthe James MacFarland John Buswell Brenda Desmond James Ellard Don Comb

Chapeamento de células CHO-K1: <ol><li> Adicionar 50-100μl de células CHO-K1 que foram tripsinizados de acordo com protocolos padrão de 6ml de completo F-12K. </li><li> Mix suspensão celular por pipetagem cima e para baixo várias vezes, então alíquota 300 ml de suspensão de células tripsinizados a cada poço de uma câmara estéril 8-Lab-Tek II Chambered lamínula com # 1.5 borosilicato lamela câmaras (Nalgene Nunc Int;. Produto # 155409; Lote: 100808-8-0). </li><li> Incubar as amostras a 37 ° C CO, 5% 2 durante a noite. </li></ol> Transfecção transiente de células CHO-K1 com pSNAP-ADRB2 e pSNAP-H2B: <ol><li> Verifique as câmaras de cultura de células semeadas no dia anterior para procurar densidade celular e da saúde. </li><li> Rótulo o número apropriado de tubos de microcentrífuga. </li><li> Em uma capela de fluxo laminar, configurar misturas complexas transfecção acordo com a tabela de exemplo a seguir, usando 0,3 mg pSNAP-ADBR2 DNA Controle Plasmid ou 0,3 mg de pSNAP-H2B DNA Controle Plasmid, 1 ml de D2 TransPass e 1 ml de TransPass V por reação. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> plasmídeo </td><td> número de reações </td><td> l de soro livre de médio </td><td> mL de D2 TransPass </td><td> mL de TransPass V </td><td> mL de DNA plasmídeo </td><td> mL de D2/reaction TransPass </td><td> mL de TransPass V / reação </td><td> ng de DNA / reação </td><td> DNA conc. (Ng / mL) </td><td> mL de DNA plasmídeo / reação </td></tr><tr><td> SNAP-ADRb2 </td><td> 5 </td><td> 236,5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 3,5 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 300 </td><td> 472,34 </td><td> 0,7 </td></tr><tr><td> H2B SNAP- </td><td> 5 </td><td> 237 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 3 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 300 </td><td> 515,89 </td><td> 0,6 </td></tr><tr><td> Simulado </td><td> 5 </td><td> 240 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> Untransfected </td><td> 5 </td><td> 250 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr></tbody></table></li><li> Primeiro, misture o soro livre F-12K com o DNA adequado plasmídeo, em seguida, adicione o reagente TransPass Transfection D2, em seguida, adicionar o reagente TransPass Transfection V. Misture bem os componentes pipetando cima e para baixo suavemente várias vezes após a adição de cada reagente. </li><li> Incubar a reação em temperatura ambiente por 30 minutos. </li><li> Durante a incubação, lavar as células uma vez com 600 mL de meio DMEM completo e adicionar 450 mL de meio DMEM completo para cada amostra. </li><li> Adicionar 50 ul da mistura de transfecção complexo para cada amostra, lentamente e de forma gota a gota. </li><li> Incubar as amostras durante a noite a 37 ° C, 5% CO 2. </li></ol> SNAP-Cell Labeling Estrela TMR de células CHO-K1 transitoriamente transfectadas com pSNAP-ADRB2 e pSNAP-H2B: <ol><li> Remova cuidadosamente os meios de comunicação transfecção complexas a partir de cada amostra por sucção a vácuo. Lave as células duas vezes com 600 mL de completo F-12K e substituir a mídia em cada poço com 600 mL de completo F-12K. </li><li> Mix de mídia rotulagem dye, adicionando 995 mL de completo F-12K e 51 mL 0,6 mM SNAP-Cell substrato TMR-Star. A concentração final da SNAP-Cell TMR-Estrela deve ser de 3mm. Pipeta cima e para baixo várias vezes para misturar após a adição de substrato. </li><li> Remova cuidadosamente meios de crescimento a partir de amostras e adicionar 200 mL de mídia rotulagem corante a cada poço. Incubar as amostras a 37 ° C, 5% CO 2 por 30 minutos. </li><li> Enquanto as amostras são incubação, preparar solução Hoechst 33342 para a coloração nuclear das amostras através da mistura de 1 ml de Hoechst 33342, trihydrochloride, tri-hidratado (10 mg / ml solução em água, 16,2 mM solução; Sondas Invitrogen Molecular) em 10 ml de completo F-12K . </li><li> Remova a mídia de todas as amostras e adicionar 600 mL da solução de Hoechst diluir para cada amostra. Incubar as amostras a 37 ° C, 5% CO 2 por 5 minutos. </li><li> Lavar três vezes com amostras de 600 mL de completo F-12K. </li><li> Incubar as amostras a 37 ° C, 5% CO 2 por mais 30 minutos para permitir que fluoróforo unincorporated difundir para fora das células. </li><li> Após 30 minutos, altere os meios de comunicação nas amostras SNAP-Cell, uma última vez e vá para a imagem. </li><li> Imagem as células usando um microscópio Zeiss ApoTome Axiovert 200M fluorescente. </li></ol> Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/1876/1876fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Aqui estãoalguns resultados representativos das imagens fluorescentes por microscopia de fluorescência padrão de viver COS-7 células que estão expressando tag SNAP-fusões. Esta primeira imagem mostra ao vivo COS-7 células que expressam pSNAP-H2B (nuclear histona) marcada com SNAP-Cell TMR-Star. A construção pSNAP-H2B foi gerada usando o tag pSNAP-vetor (m). As células foram marcadas com SNAP-Cell TMR-Estrela por 30 minutos e contrastado com Hoechst 33342 (azul) para núcleos. A fluorescência rosa demonstra a sobreposição da fluorescência vermelha onde a proteína histona está presente, além da fluorescência azul indicando o núcleo. A expressão da proteína H2B é clara e facilmente identificados. <img src="/files/ftp_upload/1876/1876fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> <img src="/files/ftp_upload/1876/1876fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figuras 2 e 3. Essas duas imagens seguintes mostram ao vivo COS-7 transfectadas transitoriamente com células-pSNAP ADRβ2. As células foram marcadas com SNAP-Cell TMR-Star (vermelho) e contrastado com Hoechst 33342 (azul). A construção pSNAP-ADRβ2 foi gerada usando o tag pSNAP-vetor (m). As células foram marcadas com SNAP-Cell TMR-Estrela por 30 minutos e contrastado com Hoechst 33342 (azul) para núcleos. A fluorescência vermelha indica a presença de superfície celular ADRB2 proteína receptora de fluorescência azul, enquanto identifica o núcleo.

<ol><li>Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+biochemical+activities+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualizing biochemical activities in living cells.</a> Nat Chem Biol. 5, 63-65 (2009).</li>
<li>Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNAP-tag+Technologies%3A+Novel+Tools+to+Study+Protein+Function%5BTitle%5D)+AND+%22NEB+Expressions%22%5BJournal%5D)">SNAP-tag Technologies: Novel Tools to Study Protein Function.</a> NEB Expressions. 3.3, 1-3 (2008).</li>
</ol>

Os autores são empregados por New England Biolabs, que produz os reagentes e instrumentos utilizados neste artigo.

Há diversas variáveis ​​que afetam os resultados observados, tais como foco intensidade do laser, a capacidade de equipamentos, lentes usadas, etc A fotoestabilidade do fluoróforo determina a rapidez com que a fluorescência deve ser capturado antes de desaparecer. Este método de rotulagem proteína é versátil e adequada para muitas aplicações. SNAP-tag e CLIP tag tecnologias para a rotulagem específica de proteínas de fusão com sondas sintéticas permitem vários aspectos da função da proteína, incluindo uma variedade de processos dinâmicos em células vivas e em lisados ​​celulares. SNAP, CLIP, MCP e ACP-tag tecnologias oferecem versatilidade e simplicidade extraordinária para a imagem de proteínas em células vivas e fixos e para o estudo das proteínas in vitro. A criação de uma construção de um único gene produz uma proteína de fusão com a tag capaz de formar uma ligação covalente a uma variedade de grupos funcionais, incluindo fluoróforos, biotina, ou grânulos. A proteína de interesse devem ser clonados e expressos apenas uma vez e, em seguida, a fusão pode ser usado com uma variedade de substratos fluorescentes para diversas aplicações a jusante como a rotulagem de proteína simultânea no interior das células vivas, localização de proteínas e translocação, pulse-chase experimentos, estudos de internalização do receptor , rotulagem superfície seletiva de células, proteínas puxar para baixo os ensaios, a detecção de proteínas em SDS-PAGE, citometria de fluxo, de alto rendimento ensaios de ligação em placas de microtitulação, as experiências de interação biosensor, e FRET baseado em ensaios de ligação.

<table><tbody><tr><td>Células CHO-K1</td><td>ATCC</td><td>CCL-61</td><td></td></tr><tr><td>F-12K sem soro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa de câmara Lab-Tek II com lamínulas de borossilicato #1.5</td><td>Nalge Nunc international</td><td>155409</td><td>Lote: 100808-8-0</td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst 33342, tri-hidrocloreto, tri-hidratado (solução 10 mg/ml em água, solução 16,2 mM)</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>470519</td></tr><tr><td>Microscópio fluorescente Zeiss Apotome Axiovert 200M</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transpass V</td><td>New England Biolabs</td><td>M2561S</td><td>0030709</td></tr><tr><td>Transpass D2</td><td>New England Biolabs</td><td>M2554S</td><td>0060802</td></tr><tr><td>SNAP-Cell TMR Star</td><td>New England Biolabs</td><td>S9105S</td><td>0010811</td></tr><tr><td>Plasmídeo controle pSNAP-ADBR2</td><td>New England Biolabs</td><td>N9178S</td><td>0010811</td></tr><tr><td>Plasmídeo controle pSNAP-H2B</td><td>New England Biolabs</td><td>N9179S</td><td>0010811</td></tr></tbody></table>

labeling fluorescentes de cos-7 expressando as proteínas snap tag-fusion para imagens de células vivas

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag e CLIP tag-sistemas de rotulagem proteínas permitem o anexo, covalentes de moléculas específicas, incluindo corantes fluorescentes, a uma proteína de interesse em células vivas. Estes sistemas oferecem uma ampla seleção de substratos fluorescentes otimizado para uma faixa de instrumentação de imagem. Uma vez clonado e expresso, a proteína com a tag pode ser usada com uma variedade de substratos para inúmeras aplicações a jusante sem ter de clonar novamente. Há duas etapas para usar este sistema: a clonagem e expressão da proteína de interesse como uma fusão SNAP-tag, e rotulagem da fusão com o substrato SNAP-tag de escolha. O SNAP-tag é uma pequena proteína humana com base em O<sup&gt; 6</sup&gt;-Alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), uma proteína de reparo do DNA. SNAP tag rótulos são corantes conjugado com guanina ou chloropyrimidine grupos deixando através de um linker benzílico. Na reação de rotulagem, o grupo benzila substituído do substrato é covalentemente ligado ao SNAP-tag. CLIP-tag é uma versão modificada do SNAP-tag, projetado para reagir com benzylcytosine ao invés de derivados benzylguanine. Quando usado em conjunto com SNAP-tag, tag-CLIP permite a rotulagem ortogonais e complementares de duas proteínas simultaneamente nas mesmas celas.

SNAP-tag e CLIP tag-sistemas de rotulagem proteínas permitem o anexo, covalentes de moléculas específicas, incluindo corantes fluorescentes, a uma proteína de interesse em células vivas. Uma vez clonado e expresso, a proteína com a tag pode ser usada com uma variedade de substratos para inúmeras aplicações a jusante sem ter de clonar novamente.

Labeling fluorescentes de COS-7 expressando as proteínas SNAP tag-Fusion para imagens de células vivas

Os sistemas de marcação de proteínas SNAP-tag e CLIP-tag permitem a ligação covalente e específica de moléculas, incluindo corantes fluorescentes, a uma proteína de interesse...

SNAP e marcação com clip. Os sistemas de marcação proteica permitem a ligação covalente específica de praticamente qualquer molécula a uma proteína de interesse. O gene de interesse pode ser clonado no vetor em qualquer lado da marcação, sendo que a expressão do gene clonado resulta numa proteína de fusão com a marcação SNAP.O substrato da etiqueta SNAP é composto por duas partes: a benzoguinona, que é reconhecida pela etiqueta SNAP, e o grupo funcional. O grupo funcional pode ser biotina, uma microesfera ou um grupo fluorescente, disponíveis em diversas cores. Durante a reação de marcação, o grupo benzo substituído liga-se covalentemente à etiqueta SNAP, liberando guanina. Se um fluoróforo for acoplado à proteína desejada, o marcador emite fluorescência, permitindo a visualização da proteína em células vivas ou fixadas.Olá, sou Chris Provost do New England Bile Labs. Hoje vamos mostrar um procedimento para a imagem fluorescente de células COS sete vivas expressando proteínas de fusão com marcação Snap. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar onde as proteínas estão localizadas nas células.Então, vamos começar. Para preparar as células COS-7 para transfeção, trate-as com tripsina e coloque-as no gelo de acordo com protocolos padrão, e adicione 50 a 100 microlitros de células a seis mililitros de meio DMEM completo. Misture a suspensão celular pipetando para cima e para baixo várias vezes. Em seguida, distribua alíquotas de 300 microlitros da suspensão celular tripsinizada em cada poço de uma lâmina estéril com oito câmaras (Lab-Tek de duas câmaras), e incube as amostras a 37 graus Celsius, com 5% de dióxido de carbono, durante a noite. No dia seguinte.Verifique as câmaras de cultivo celular quanto à densidade e saúde das células. Rotule o número apropriado de tubos microcêntrifuga para as misturas dos complexos de transfeção. Em uma cabine de fluxo laminar.Prepare as misturas dos complexos de transfeção para cada reação. Utilize 0,3 microgramas de DNA plasmidial de fusão snap diluídos em meio livre de soro e um microlitro. Cada um dos plasmídeos controle dos reagentes de transfeção TPA D dois e TPA v está disponível para ensaiar a eficácia dos reagentes de transfeção.Recomendamos também incluir uma amostra mock transfectada e/ou uma amostra não ressecionada como controles negativos para cada mistura complexa. Primeiro, misture o DMEM sem soro com o DNA plasmidial apropriado. Em seguida, adicione o reagente de transfeção TPAs D dois, seguido pelo reagente de transfeção TPAs v.Emulsifique bem os componentes pipetando suavemente várias vezes para cima e para baixo após a adição de cada reagente e incube as reações à temperatura ambiente por 30 minutos. Durante a incubação, lave as células uma vez com 600 microlitros de DMEM completo e adicione 450 microlitros de DMEM completo a cada amostra. Quando a incubação estiver concluída, adicione lentamente, gota a gota, 50 microlitros da mistura do complexo de transfeção a cada amostra. Incube as amostras durante a noite a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono.No dia seguinte, as células cost sete transfectadas podem ser marcadas com o substrato Snap Cell TMR Star, iniciando este procedimento com 50 microlitros de DMSO adicionados ao substrato Snap Cell TMR Star e misturados por pipetagem para cima e para baixo, seguido de vortexagem por um minuto. Em seguida, remova cuidadosamente o meio dos complexos de transfeção de cada amostra por sucção a vácuo e lave as células duas vezes com 600 microlitros de DMEM completo.Em seguida, substitua o meio em cada poço por 600 microlitros de DMEM completo. Retorne as amostras ao incubador. Prepare o meio de marcação D adicionando 995 microlitros de DMEM completo e cinco microlitros de 0,6 milimolar.Pipete a solução estoque de TMR STAR para células para cima e para baixo várias vezes para misturar após a adição do substrato. A concentração final de TMR STAR para células deve ser de três micromolares. Remova cuidadosamente o meio de crescimento das amostras e adicione 200 microlitros de meio de marcação DIA a cada poço. Incube as amostras a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono, por 30 minutos. É nesta etapa que o grupo benzel no substrato de TMR se ligará covalentemente à etiqueta snap e liberará a quina, enquanto as amostras estão em incubação.Prepare a solução de HX para coloração nuclear das amostras. Misture um microlitro de Tri-Hidrocloreto HSED 3 33 42 TRI em 10 mililitros de DMEM completo. Quando a incubação estiver concluída, remova o meio de marcação de todas as amostras e adicione 600 microlitros da solução diluída de HX a cada amostra.Incube as amostras a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono por cinco minutos. Após cinco minutos, remova a solução diluída contendo o gancho de cada amostra e lave as amostras três vezes com 600 microlitros de DMEM completo. Após a lavagem final, adicione 600 microlitros de DMEM completo a cada amostra.Incube as amostras a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono, por mais 30 minutos para permitir que o Fluor não incorporado difunda para fora das células, o que é necessário para a marcação intracelular. Após 30 minutos, substitua o meio nas amostras de células snap pela última vez com 600 microlitros de DMEM completo. As células estão agora prontas para serem visualizadas usando um microscópio fluorescente Zeis AOME vert 200 M.Aqui estão alguns resultados representativos de imagem fluorescente utilizando microscopia fluorescente padrão de células CO sete vivas que expressam fusões de marcadores. Esta primeira imagem mostra células COS sete vivas expressando PNAP H dois B marcado com SNAP Cell TMR Star. A construção de PNAP H dois B foi gerada utilizando o vetor PNAP TAG M.As células foram marcadas com Snap Cell TMR Star por 30 minutos e contra-coloridas com Hoechst 33342 para os núcleos. A fluorescência rosa demonstra a sobreposição da fluorescência vermelha onde a proteína histona está presente. Além da fluorescência azul que indica o núcleo, a expressão da proteína H2B é clara e facilmente identificada.Essas duas próximas imagens mostram células cost seven vivas transfectadas temporariamente com pnap. Células A DR beta dois foram marcadas com snap cell, tmr, star, e contra-coloridas com HUX 3 33 42. O construto pnap A DR beta dois foi gerado utilizando o vetor PNAP TAG M.As células foram marcadas com Snap Cell TMR Star por 30 minutos e contra-coloridas com Hoechst 33342 para os núcleos. A fluorescência vermelha indica a presença da proteína do receptor da superfície celular A DR beta dois, enquanto a fluorescência azul identifica o núcleo. Acabamos de mostrar como realizar a imagem fluorescente de células vivas de cough seven expressando proteínas de fusão com marcação Snap Tag.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de adicionar o complexo de transfeção lentamente e gota a gota, bem como armazenar o substrato da etiqueta clivável a menos 20 graus Celsius, no escuro, quando não estiver em uso. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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