Name: Lapso de tempo de imagens de Mitose Depois de Transfection siRNA (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-06T18:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Aprenda a realizar imagens de lapso de tempo da mitose em células de mamífero após transfecção com siRNA. Este método permite quantificar alterações na progressão mitótica e dinâmica cromossômica em tempo real.

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Este trabalho foi financiado pela American Cancer Society (PF-07-103-01-CSM), o National Institutes of Health (R01 e P30 GM61275 CA042014), a Leucemia and Lymphoma Society, eo Huntsman Cancer Foundation.

transfecção siRNA e preparação celular <ol><li> Prepare um 4-bem LabTek II lamela chambered adicionando 0,5 mL de fibronectina (10μg/mL) a cada poço que será usado. Incubar por 10-15 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Prepare siRNA / Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) complexos para reverter transfecção de acordo com as instruções do fabricante s. Use a quantidade recomendada para um poço de um prato de 24 poços por câmara a ser utilizada (100μL total). Um produto análogo / protocolo de transfecção siRNA pode ser substituído. </li><li> Remova a fibronectina dos poços da lamela câmaras. Adicionar 100μL de siRNA / Lipofectamine complexos RNAiMAX a cada poço que será usado. </li><li> Alíquota de 20 mil histona H2B-mCherry células que expressam (em 500μL) por poço contendo mistura de transfecção. </li><li> Permitir que as células incubar por ~ 24 horas antes de substituir a mistura de transfecção com 1 mL de meio de cultura de células regulares. </li><li> Células incubar mais 24 horas antes da aquisição da imagem (48 horas pós-transfecção). </li></ol> Configuração do microscópio e de aquisição de imagem <ol start="7"><li> Há três partes principais para a configuração de aquisição de imagem: 1) uma célula incubadora que se encaixa no palco microscópio e mantém um ambiente úmido constante de 37 ° C, e 5% CO 2, 2) um microscópio invertido equipado com um palco automatizado, automatizado obturadores de fluorescência e campo claro, e rodas de filtros automáticos e 3) um pacote de software que integra e controla o palco, persianas, e rodas de filtros. Em nossa configuração de imagem, usamos um celular personalizado incubadora de OKO Lab que pode ser usado com o II LabTek chambered lamínula. O palco, persianas, e rodas de filtros são controladas pelo software Metamorph Dica:. O Laboratório OKO fase superior do sistema de incubadora inclui adaptadores para uma variedade de placas diferentes, prato, ou tamanhos lamela. </li><li> Posição do LabTek II lamela chambered na incubadora, abrindo a tampa da incubadora pré-aquecido e equilibrado, colocando a lamela chambered no adaptador, e segurando no lugar com massa de modelar. Deixar a tampa do lamela câmaras para que o meio de cultura celular não vai secar. Feche a tampa e posicione a incubadora inteira no palco microscópio, assegurando que a incubadora é mantida firmemente no lugar. </li><li> Usando Metamorph, configure seu experimento, selecionando &quot;Apps / Aquisição Multidimensional&quot; na barra de menus do software. Isso fará com que uma janela na qual você pode selecionar a freqüência ea duração do timelapse, o tempo de exposição para cada cor (se fazendo várias configurações), o número ea localização das posições de estágio, eo número de z-seções (se ) desejado. Selecione onde deseja salvar os arquivos de dados Dica:. Se estiver usando outro software que não Metamorph, as funções podem ser ligeiramente diferentes, mas o conceito geral é o mesmo. Micromanager, um software de código aberto baseado em aquisição ImageJ que seja compatível com a maioria das configurações de hardware, é uma excelente alternativa. </li><li> . Para efeitos do presente protocolo, iremos adquirir imagens em dois comprimentos de onda (claro e mCherry) a cada 15 minutos para 8 horas a 15 posições estágio Dica: Se a resolução melhor momento é desejada, então você pode encurtar o intervalo de tempo entre as aquisições, no entanto , as posições menos estágio pode ser usado, e células mitóticas, assim, menos estarão disponíveis para análise. É importante quando considerando os intervalos de tempo para ter em conta o tempo necessário para a roda de filtros para alternar entre conjuntos de filtros. </li><li> Determine o tempo de exposição ideal para cada comprimento de onda pela primeira foco em um campo de células com uma iluminação de campo claro. No software, ajustar a função de focagem automática apenas para o canal de campo claro (isso vai permitir que o software de focagem automática em cada posição palco antes de cada aquisição) Dica:. Usamos um 40x objetivo de contraste de fase e seco para dar excelente resolução, sem a necessidade de petróleo . Outros objetivos podem ser usados ​​dependendo da resolução óptica desejada. </li><li> Mude para o comprimento de onda mCherry e encaixe uma imagem usando a 50 msec exposição. Ajustar o tempo de exposição ao mínimo necessário para ver uma boa imagem. É essencial para limitar a quantidade de exposição à luz para garantir a viabilidade celular sustentável. Como regra geral, esta pode ser alcançada usando um filtro de densidade neutra (para reduzir o fluxo de luz de excitação) e um maior tempo de exposição da câmera ao invés de aumentar a força de iluminação. Repita este procedimento para qualquer comprimentos de onda adicionais para serem usados ​​Dica:. Para determinar a longo prazo a viabilidade celular em uma determinada exposição para a sua experiência, você pode visualizar o número total de imagens de uma célula pode sobreviver ao longo dos timelapse desejado adaptando temporariamente o espaçamento timepoint de minutos para segundos (ou seja, 10 min. torna-se 10 segundos). Se suas células sobrevivem 100-200 exposições (ou onúmero apropriado), então sua exposição é muito bem. Se não, reduzir a sua luz de excitação, tempo de exposição, ou o número total de imagens para simular sua experiência completa. </li><li> Em seguida, selecione e marca um número adequado de posições estágio para que você possa obter uma amostragem adequada da população celular. Metamorph irá gravar as posições e vai voltar lá para cada aquisição Dica:. Eu geralmente tentar encontrar posições em que há uma abundância de células a imagem, mas não tantos que eles são muito densos. Além disso, é importante selecionar posições suficiente para que você terá uma boa chance de observar um grande número de células progredindo através de mitose. </li><li> Afinal timelapse, tempo de exposição de comprimento de onda, e informações sobre a posição estágio foram gravadas, selecione a opção &quot;Preview&quot; botão na tela para determinar se o software está controlando o equipamento adequadamente. </li><li> Quando estiver satisfeito, selecione a opção &quot;Adquirir&quot; botão na tela para começar a aquisição. Depois sentar e permitir que o computador e microscópio para fazer o trabalho Sugestão:. Observe a automação através de pelo menos uma rodada cheia de aquisição para garantir que tudo está funcionando corretamente. </li></ol> Processamento de imagem e análise <ol start="16"><li> Após a aquisição for concluída, o próximo passo é transferir os dados de imagem em uma forma que é mais fácil de manusear. Para efeitos do presente protocolo, vou demonstrar primeiro como gerar filmes com Metamorph, então, como para gerar montagens de imagens utilizando o programa ImageJ. O formato será útil para fins de quantificação. </li><li> O primeiro passo é rever os dados. Para fazer isso, selecione &quot;Dados de Aplicativos / Revisão Multidimensional&quot; na barra de menu. Selecione o local de seus arquivos, em seguida, selecione &quot;View&quot;. Isto irá permitir que você reveja a pilha de imagens de cada posição etapa individualmente. Selecione a posição estágio desejado, depois em &quot;Load Images&quot;. Você será capaz de avançar através dos dados de quadro a quadro. </li><li> Para essas posições estágio em que as células passam por mitose (conforme determinado pelo DNA e morfologia celular), você pode fazer filmes e montagens usando Metamorph, ou com outros programas como o ImageJ (disponível gratuitamente através do NIH). </li><li> Para fazer um filme em Metamorph, selecione &quot;Processo / Save filme&quot; na barra de menu. Você será capaz de selecionar quais quadros de usar, a velocidade e tipo de arquivo do filme. Em seguida, selecione &quot;Salvar Filme&quot;. </li><li> Para fazer uma montagem, eu salvo a pilha imagem como um arquivo stk., Que pode ser usado em outros programas como o ImageJ. </li><li> Abra o arquivo no ImageJ e avançar os quadros até encontrar uma célula passando por mitose. . Recortar a área ao redor da célula e selecione &quot;Image / Duplicate&quot; Dica: Certifique-se de duplicar todos os quadros. </li><li> Para fazer uma montagem, selecione &quot;Image / Pilhas / Make Montage&quot; na barra de menu. Aqui você pode especificar os quadros que você deseja incluir, o tamanho ea forma da montagem, e se você quer fronteiras entre os frames. Selecione essas e clique em &quot;Ok&quot;. .. Salvar a montagem como um arquivo tif e qualquer outro tratamento em qualquer ImageJ ou Adobe Photoshop Dica: Alterar arquivos montagem do formato de 16 bits usado por Metamorph a 8 bits formato para o processamento de imagem mais fácil. </li><li> Para calcular o tempo em diferentes estágios de mitose, determinar t = 0 (primeiro sinal de condensação de DNA ou arredondamento das células), contar o número de quadros até cromossomos estão alinhados no equador (tempo em prófase / prometáfase), até quadros cromossomos começam a segregar (tempo em metáfase) e quadros até que as células começam a se achatar (anáfase / telófase / citocinese). O tempo calculado em cada fase mitótica depende do intervalo de tempo entre cada quadro. </li></ol> Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/1878/1878fig1tmb.jpg" border="0" /> A figura 1 ilustra os resultados de um experimento típico transfecção controle siRNA usando uma linhagem de células HeLa expressar histona H2B-mCherry. Este método tem sido utilizado de forma eficaz para quantificar tempo mitótico, revelando um inesperado papel para o Nup153 nucleoporin no sincronismo da mitose final 1. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1878/1878fig1.jpg">clique aqui</a> para ver uma versão ampliada da figura 1.

<ol><li>Mackay, D. R., Elgort, S. W., Ullman, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nucleoporin+Nup153+has+separable+roles+in+both+early+mitotic+progression+and+the+resolution+of+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The nucleoporin Nup153 has separable roles in both early mitotic progression and the resolution of mitosis.</a> Mol Biol Cell. 20, 1652-1660 (2009).</li>
<li>Khodjakov, A., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+division+process+in+living+tissue+culture+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging the division process in living tissue culture cells.</a> Methods. 38, 2-16 (2006).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2, 905-909 (2005).</li>
<li>Meraldi, P., Draviam, V. M., Sorger, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+and+checkpoints+in+the+regulation+of+mitotic+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Timing and checkpoints in the regulation of mitotic progression.</a> Dev Cell. 7, 45-60 (2004).</li>
<li>Mora-Bermudez, F., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+structural+dynamics+of+chromosomes+in+living+cells+by+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Measuring structural dynamics of chromosomes in living cells by fluorescence microscopy.</a> Methods. 41, 158-167 (2007).</li>
<li>Prosser, S. L., Fry, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+of+the+centrosome+cycle+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging of the centrosome cycle in mammalian cells.</a> Methods Mol Biol. 545, 165-183 (2009).</li>
<li>Malureanu, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BubR1+N+terminus+acts+as+a+soluble+inhibitor+of+cyclin+B+degradation+by+APC%2FC%28Cdc20%29+in+interphase%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">BubR1 N terminus acts as a soluble inhibitor of cyclin B degradation by APC/C(Cdc20) in interphase.</a> Dev Cell. 16, 118-131 (2009).</li>
<li>Anderson, D. J., Hetzer, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reshaping+of+the+endoplasmic+reticulum+limits+the+rate+for+nuclear+envelope+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reshaping of the endoplasmic reticulum limits the rate for nuclear envelope formation.</a> J Cell Biol. 182, 911-924 (2008).</li>
<li>Beaudouin, J., Gerlich, D., Daigle, N., Eils, R., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+envelope+breakdown+proceeds+by+microtubule-induced+tearing+of+the+lamina%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear envelope breakdown proceeds by microtubule-induced tearing of the lamina.</a> Cell. 108, 83-96 (2002).</li>
<li>Marcus, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+spindle+behavior+using+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Visualization of spindle behavior using confocal microscopy.</a> Methods Mol Med. 137, 125-137 (2007).</li>
<li>Steigemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aurora+B-mediated+abscission+checkpoint+protects+against+tetraploidization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Aurora B-mediated abscission checkpoint protects against tetraploidization.</a> Cell. 136, 473-484 (2009).</li>
<li>Draviam, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+genomic+screen+identifies+a+role+for+TAO1+kinase+in+spindle-checkpoint+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A functional genomic screen identifies a role for TAO1 kinase in spindle-checkpoint signalling.</a> Nat Cell Biol. 9, 556-564 (2007).</li>
<li>Neumann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+RNAi+screening+by+time-lapse+imaging+of+live+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput RNAi screening by time-lapse imaging of live human cells.</a> Nat Methods. 3, 385-390 (2006).</li>
<li>Stegmeier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaphase+initiation+is+regulated+by+antagonistic+ubiquitination+and+deubiquitination+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Anaphase initiation is regulated by antagonistic ubiquitination and deubiquitination activities.</a> Nature. 446, 876-881 (2007).</li>
</ol>

Com os recentes avanços na tecnologia de imagem e proteína fluorescente, imagens ao vivo tornou-se um aspecto de análise de rotina celular 2. Uma variedade de GFP (e suas variantes outra cor 3)-tagged proteínas são amplamente disponíveis e relativamente fáceis de construir e pode ser usado para controlar um número de marcas, incluindo a divisão celular DNA / dinâmica cromossomo 4, 5, 6 duplicação centrossoma, ciclina B dinâmica 7, desagregação envelope nuclear e remontagem 8, 9, a formação do fuso mitótico 10, e vários estágios de citocinese 11. Tagged proteínas pode ser usado sozinho ou em combinação, quando os espectros de excitação / emissão de etiquetas fluorescentes são compatíveis, permitindo a coordenação entre os eventos específicos a serem avaliados. Se a resolução espacial maior e / ou temporal é / são desejada, microscopia confocal de varredura se varredura a laser, disco giratório, ou ressonância pode ser utilizado, bem como a lista de opções sofisticadas de microscopia, com cada vez maior a resolução continua a crescer. Imagens ao vivo da mitose em células de mamíferos também foi adaptado para uso em alto rendimento RNAi e telas de pequena molécula 12-14. Assim, enquanto uma experimentos iniciais s usando esta técnica pode ser relativamente simples, as possibilidades de construção desta estratégia são extensas.

<table><tbody><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Invitrogen</td><td>13778-075</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de vidro coberta Lab Tek II (4 poços)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>12-565-337</td><td>Outros tamanhos de câmara estão disponíveis</td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora celular de estágio</td><td>OKO Lab</td><td></td><td>Pode-se usar qualquer câmara apropriada</td></tr><tr><td>Microscópio invertido automatizado de fluorescência</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td>Pode-se usar qualquer microscópio apropriado</td></tr><tr><td>Pacote de software</td><td>Metamorph</td><td></td><td>Pode-se usar qualquer software apropriado</td></tr></tbody></table>

lapso de tempo de imagens de mitose depois de transfection sirna

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Mudanças na organização celular e dinâmica cromossomo que ocorrem durante a mitose são fortemente coordenada para garantir a herança precisa do conteúdo genômico e celular. Hallmark eventos da mitose, como o movimento de cromossomos, podem ser facilmente rastreados em uma base de células individuais usando lapso de tempo de microscopia de fluorescência de linhas de células de mamíferos expressar específicas proteínas GFP. Em combinação com RNAi baseado esgotamento, este pode ser um método poderoso para identificar o estágio (s) da mitose, onde os defeitos ocorrem após os níveis de uma proteína particular, têm sido reduzidos. Neste protocolo, apresentamos um método básico para avaliar o efeito de esgotar uma proteína mitótica potencial regulatório sobre o momento da mitose. Células são transfectadas com siRNA, colocados em uma câmara de incubação em estágio superior, e fotografada usando um microscópio de fluorescência automatizado. Descrevemos como usar o software para criar uma experiência de lapso de tempo, como o processo de sequências de imagens para fazer qualquer imagem estática-montagens ou filmes, e como quantificar e analisar o timing das etapas mitóticas usando uma linha de células expressando-mCherry tagged H2B histonas. Finalmente, discute considerações importantes para a concepção de um experimento de lapso de tempo. Esta estratégia é complementar a outras abordagens e oferece as vantagens de 1) sensibilidade a mudanças na cinética que pode não ser observada quando se olha para as células de uma população e 2) Análise da mitose sem a necessidade de sincronizar o ciclo celular utilizando tratamentos medicamentosos. A informação visual a partir de experimentos de imagem, não só permite que as fases sub-da mitose de ser avaliado, mas também pode fornecer uma visão inesperada que não seria aparente a partir da análise do ciclo celular por FACS.

Aqui nós descrevemos um protocolo básico para a imagem e quantificar o tempo de mitose de células vivas de tecidos de mamíferos cultura após transfecção siRNA.

Lapso de tempo de imagens de Mitose Depois de Transfection siRNA

As alterações na organização celular e na dinâmica cromossômica que ocorrem durante a mitose são rigorosamente coordenadas para garantir a herança precisa do genoma e...

As alterações na organização celular e na dinâmica dos cromossomos que ocorrem durante a mitose são rigorosamente coordenadas para garantir a herança precisa do conteúdo genômico e celular. Neste artigo em vídeo, é apresentado um método para acompanhar eventos marcantes da mitose. O movimento dos cromossomos é monitorado em nível individual de células, utilizando linhagens celulares que expressam proteínas marcadas com fluorescência.A transfeção com irna direcionada contra proteínas mitóticas resulta em alterações no ciclo celular que podem ser visualizadas por meio de imagens com lapso de tempo e quantificadas por análise de imagem. Olá, sou Douglas Mackey do laboratório de Katie Oman no Instituto de Câncer Huntsman da Universidade de Utah. Hoje vamos mostrar um procedimento para imagens de células vivas enquanto avançam pela mitose após transfeção com SIA.Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar quaisquer efeitos que a interrupção de proteínas de interesse possa ter sobre o tempo de progressão mitótica. Então, vamos começar. Prepare um lamínula com quatro paredes e duas câmaras adicionando 0,5 mililitros de fibronectina a cada uma.Incube bem por 10 a 15 minutos em temperatura ambiente. Enquanto isso, prepare os complexos irna e lip RNAI max para transfeção reversa. De acordo com as instruções do fabricante para cada câmara, utilize a quantidade recomendada para uma poça de uma placa de 24 poços.Após 15 minutos, remova a fibronectina dos poços do lamínula com câmara. Em seguida, adicione 100 microlitros de complexos de irna a cada poço, distribuindo alíquotas de 20.000 células em 500 microlitros para cada um. Coloque as células no incubador por 24 horas.No dia seguinte, substitua a mistura de transfeção por um mililitro de meio de cultura celular regular e, em seguida, incube as células por mais 24 horas antes da aquisição de imagens. O sistema de aquisição de imagens consiste em um incubador celular personalizado que se encaixa na platina de um microscópio invertido, o qual é controlado por um software de aquisição de imagens. Para se preparar para a aquisição de imagens, certifique-se de que o incubador foi pré-aquecido e equilibrado.Em seguida, abra a tampa do incubador e coloque as células com a tampa da câmara no adaptador. Use uma pequena quantidade de massa de modelar para mantê-la no lugar. Feche a tampa e posicione todo o incubador sobre a platina do microscópio, garantindo que o incubador esteja firmemente fixado.Em seguida, utilizando o MetaMorph, configure o experimento selecionando aplicativos de aquisição multidimensional na barra de menus do software. Isso abrirá uma janela na qual os parâmetros de imagem podem ser selecionados. Especifique onde salvar os arquivos de dados.Em seguida, selecione os comprimentos de onda em campo claro e mCherry utilizando o objetivo de contraste de fase a seco TX 40x, foque em um campo de células usando o software e ajuste a função de autofoco apenas para o canal de campo claro. Isso permitirá que o software realize o autofoco em cada posição do estágio antes de cada aquisição. Para o primeiro comprimento de onda, capture uma imagem usando um tempo de exposição de 50 milissegundos, ajustando o tempo de exposição ao mínimo necessário para visualizar uma boa imagem.É essencial limitar a quantidade de exposição à luz para garantir a viabilidade celular sustentada. Como regra geral, isso pode ser melhor alcançado utilizando um filtro de densidade neutra e um tempo de exposição da câmera mais longo, ao invés de aumentar a intensidade da iluminação.Repita este procedimento para quaisquer comprimentos de onda adicionais. Em seguida, defina o tempo de exposição para cada canal. Depois, estabeleça um intervalo de tempo de 15 minutos durante oito horas em 15 posições do estágio.Se uma resolução temporal melhor for desejada, reduza o intervalo de tempo entre as aquisições. Lembre-se de que quanto mais posições do estágio forem utilizadas, mais tempo levará para adquirir. Em cada intervalo de tempo, selecione e marque um número apropriado de posições do estágio para amostrar adequadamente a população celular.O Metamor registrará as posições e retornará ao local designado para cada aquisição. Após a exposição com intervalo de tempo e comprimento de onda definidos, as informações de tempo e posição da platina foram estabelecidas. Selecione o botão de visualização na tela para confirmar que o software está controlando adequadamente os equipamentos.Após garantir que o sistema está funcionando, selecione o botão de aquisição na tela para iniciar a aquisição. Observe a automação por pelo menos uma rodada completa de aquisição para assegurar que tudo esteja funcionando corretamente. Em seguida, relaxe e permita que o computador e o microscópio realizem o trabalho.Para revisar os dados, selecione aplicativos, revise dados multidimensionais na barra de menu, selecione a visualização da localização do estágio e, em seguida, selecione uma posição do estágio. Clique em carregar imagens para revisar a pilha de imagens dessa posição. Após o carregamento das imagens, use o mouse para avançar pelos quadros de dados um a um.Aqui são gerados filmes de células em mitose usando o Metamorph. Para criar um filme no Metamorph, selecione pilha e depois criar filme. Na barra de menu, selecione quais quadros usar, a velocidade e o tipo de arquivo do filme.Em seguida, selecione salvar para criar um mosaico. Primeiro, salve os dados como um arquivo .STK no MetaMorph. Depois, abra o ImageJ, abra o arquivo .stk no ImageJ e recorte uma região de interesse marcando a região e selecionando imagem recortar na barra de menu.Em seguida, selecione as pilhas de imagens. Crie um mosaico especificando quais quadros incluir, o tamanho e a forma do mosaico, e se desejam-se bordas entre os quadros.Em seguida, clique em OK. Salve o mosaico como um arquivo .tiff. Por fim, calcule o tempo em cada fase da mitose, designando o quadro em que o primeiro sinal de condensação do DNA ou arredondamento celular for evidente como T igual a zero para prófase.A prometáfase termina quando os cromossomos se alinham no equador; em seguida, a metáfase prossegue até que o DNA comece a se separar na anáfase e telófase. Por fim, ocorre a citocinese e as células começam a se achatas. Imagens de lapso de tempo de células hilar que expressam his stone.H duas BCFP é mostrado. Essas células foram transfectadas com irna controle e progridem normalmente ao longo do ciclo celular. Em comparação, células que foram transfectadas com siRNAs direcionados contra a porina nuclear NUP 1 53 exibem alterações graves na progressão da MIT.Acabamos de mostrar como configurar, executar e analisar um experimento de imagem com lapso de tempo para determinar o momento da progressão mitótica de células após transfeção com RNAi. Ao realizar este procedimento, é importante ser o mais cuidadoso possível com as células, mantendo a temperatura e as concentrações de CO2 adequadas e limitando a quantidade de luz à qual as células são expostas. É isso aí.Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

time-lapse-imaging-of-mitosis-after-sirna-transfection

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

FRET baseado jornalistas estão cada vez mais utilizados para monitorar atividades quinase e fosfatase em células vivas. Aqui nós descrevemos um método de como usar FRET baseado jornalistas para avaliar o ciclo de dependentes de células alterações na fosforilação alvo.

Atividades de monitoramento quinases e fosfatases através do ciclo celular por raciométrica FRET

Fonte: Daniele, F., et. al TIRFM e sondas GFP sensíveis ao pH para avaliar a dinâmica da vesícula do neurotransmissor em células de neuroblastoma SH-SY5Y: imagem celular e análise de dados. J. Vis. Exp. (2015). Este vídeo demonstra a imagem de células de neuroblastoma humano usando um microscópio de fluorescência de reflexão interna total (TIRF) para visualizar vesículas sinápticas marcadas com fluoróforo. As células são focadas primeiro no modo de epifluorescência. Os ajustes são então feitos...

Imagem celular usando microscopia de fluorescência de reflexão interna total

Neural mitose de células progenitoras é um parâmetro crítico da neurogénese. Muito do nosso entendimento da mitose progenitor neural é baseado na análise de tecido fixo. Imagens ao vivo em fatias de cérebro de embriões é uma técnica versátil para avaliar a mitose com resolução temporal e espacial de alta em um ambiente controlado.

Imagens ao vivo da mitose no desenvolvimento Cortex embrionárias de camundongos

Aqui, apresentamos o monitoramento em tempo real de migração celular em um ensaio de cicatrização de feridas utilizando empobrecido TIP60 MCF10A mama células epiteliais. A implementação de técnicas de imagem de viver-pilha em nosso protocolo nos permite analisar e visualizar o movimento de célula única em tempo real e ao longo do tempo.

Imagens ao vivo de migração de células epiteliais da mama após o esgotamento de transiente de TIP60

Apresentamos um protocolo para sincronização de timidina duplo de células HeLa, seguido de análise utilizando microscopia confocal de alta resolução. Esse método é a chave para a obtenção de grande número de células que proseguem sincronicamente de fase S de mitose, permitindo estudos sobre funções mitóticas das proteínas multifunctional que também possuem funções de interfase.

Combinando células mitóticas sincronização e microscopia Confocal de alta resolução para estudar o papel das proteínas Multifunctional ciclo celular durante a mitose

O protocolo descreve rotulagem específica de nucleóides mitocondriais com uma mancha de gel de DNA comercialmente disponível, aquisição de série de lapso de tempo de células rotuladas ao vivo por microscopia de iluminação estruturada de super resolução (SR-SIM) e rastreamento automático do movimento nucleóide.

Rotulagem específica de nucleóides mitocondriais para microscopia estruturada de iluminação com lapso de tempo

Aqui nós apresentamos um protocolo para avaliar a dinâmica da formação do eixo e da progressão mitotic. Nossa aplicação da imagem latente do lapso de tempo permite que o usuário identifique pilhas em vários estágios do mitosis, controle e identifique defeitos mitotic, e analise a dinâmica do eixo e o Fate mitotic da pilha em cima da exposição às drogas antimitotic.

Imagem latente viva da pilha para avaliar a dinâmica do sincronismo da metafase e do Fate da pilha depois das perturbações mitotic do eixo

Este protocolo ilustra um sistema de dimerização de proteínas quimicamente induzido para criar condensados na cromatina.  Demonstra-se a formação de corpo nuclear de leucemia promielolítica (PML) em telômeros com dimerizadores químicos. O crescimento, a dissolução, a localização e a composição são monitoradas com imagem de células vivas, imunofluorescência (IF) e fluorescência na hibridização situ (FISH).

Condensados de proteína induzidas por dimerização química em telômeros

Este protocolo apresenta um novo sistema genético repórter e a configuração experimental para detectar transcrição em quebras de dupla cadeia de DNA com sensibilidade de molécula única.

Imagem de células vivas da atividade transcricional no DNA Double-Strand Breaks

A microscopia de lapso de tempo é uma ferramenta valiosa para estudar a meiose em leveduras em brotamento. Este protocolo descreve um método que combina sincronização do ciclo celular, microscopia de lapso de tempo e depleção condicional de uma proteína-alvo para demonstrar como estudar a função de uma proteína específica durante a segregação cromossômica meiótica.

Uso de microscopia Time-Lapse e Depleção Nuclear Específica de Estágio de Proteínas para Estudo da Meiose em S. cerevisiae

O protocolo descreve um ensaio de hibridização de imunofluorescência em tandem com tecido embebido em parafina fixado em formalina para detectar e quantificar microRNA e proteínas multiplexadas simultaneamente.

Amplificação e reconhecimento de microRNA por meio de hibridização in situ de ácido nucleico bloqueado como um novo método de detecção e quantificação

Aprenda a realizar imagens de lapso de tempo da mitose em células de mamífero após transfecção com siRNA. Este método permite quantificar alterações na progressão mitótica e dinâmica cromossômica em tempo real.

Lapso de tempo de imagens de Mitose Depois de Transfection siRNA

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