Lapso de tempo de imagens de Mitose Depois de Transfection siRNA

As mudanças na organização celular e na dinâmica cromossômica que ocorrem durante a mitose são fortemente coordenadas para garantir a herança precisa do conteúdo genômico e celular. Neste artigo em vídeo, é mostrado um método para rastrear eventos característicos da mitose. O movimento cromossômico é monitorado em uma base celular individual usando linhas celulares que expressam proteínas marcadas com fluorescência.

A transfecção com irna é direcionada contra proteínas mitóticas, resulta em alterações do ciclo celular que podem ser visualizadas por imagens de lapso de tempo e quantificadas por análise de imagem. Olá, sou Douglas Mackey, do laboratório de Katie Oman no Huntsman Cancer Institute da Universidade de Utah. Hoje mostraremos um procedimento para obter imagens de células vivas à medida que progridem na mitose após a transfecção SIA.

Usamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar quaisquer efeitos que a interrupção de proteínas de interesse possa ter no momento da progressão mitótica. Então vamos começar. Prepare uma tampa de vidro com duas câmaras de laboratório de quatro paredes, adicionando 0,5 mililitros de fibronectina a cada uma.

Bem incubar por 10 a 15 minutos em temperatura ambiente. Enquanto isso, prepare complexos de RNAI max de irna e lábio para transfecção reversa. De acordo com as instruções do fabricante para cada câmara, use a quantidade recomendada para um poço de um prato de 24 poços.

Após 15 minutos, remova a fibronectina dos poços da lamínula com câmara. Em seguida, adicione 100 microlitros de complexos de irna a cada alíquota de poço 20.000 células em 500 microlitros para cada um. Bem, coloque as células na incubadora por 24 horas.

No dia seguinte, substitua a mistura de transfecção por um mililitro de meio de cultura de células regular e, em seguida, incube as células por mais 24 horas antes da aquisição da imagem. A configuração de aquisição de imagem consiste em uma incubadora de células personalizada que se encaixa na platina de um microscópio invertido, que é controlado por um software de aquisição de imagem. Para se preparar para a aquisição de imagens, certifique-se de que a incubadora esteja pré-avisada e equilibrada.

Em seguida, abra a tampa da incubadora e coloque as células com a tampa da câmara no adaptador. Use uma pequena quantidade de massa de modelar para mantê-lo no lugar. Feche a tampa e posicione toda a incubadora no microscópio stage, certificando-se de que a incubadora esteja firmemente no lugar.

Em seguida, usando metamorfose, configure o experimento selecionando a aquisição multidimensional de aplicativos na barra de menus do software. Isso abrirá uma janela na qual os parâmetros de imagem podem ser selecionados. Especifique onde salvar os arquivos de dados.

Em seguida, selecione os comprimentos de onda de campo claro e m cereja usando a objetiva de contraste de fase seca de quatro TX, concentre-se em um campo de células usando o software, ajuste a função de foco automático apenas para o canal de campo claro. Isso permitirá que o software foque automaticamente em cada posição do estágio antes de cada aquisição. Para o primeiro comprimento de onda, capture uma imagem Usando uma exposição de 50 milissegundos, ajuste o tempo de exposição para o mínimo necessário para ver uma boa imagem.

É essencial limitar a quantidade de exposição à luz para garantir a viabilidade celular sustentada. Como regra geral, isso pode ser melhor alcançado usando um filtro de densidade neutra e um tempo de exposição mais longo da câmera. Em vez de aumentar a força da iluminação.

Repita este procedimento para quaisquer comprimentos de onda adicionais. Em seguida, defina o tempo de exposição para cada canal. Em seguida, designe um intervalo de lapso de tempo de 15 minutos por oito horas em 15 posições de estágio.

Se uma resolução de tempo melhor for desejada, reduza o intervalo de tempo entre as aquisições. Lembre-se de que quanto mais posições de palco forem usadas, mais tempo levará para adquirir. Em cada intervalo de tempo, selecione e marque um número apropriado de posições de estágio para amostrar adequadamente a população de células.

A Metamor registrará as posições e retornará ao local designado para cada aquisição. Após o lapso de tempo, a exposição ao comprimento de onda, as informações de tempo e posição do estágio foram designadas. Selecione o botão de visualização na tela para confirmar se o software está controlando o equipamento adequadamente.

Depois de garantir que o sistema esteja funcionando, selecione o botão adquirir na tela para iniciar a aquisição. Observe a automação por meio de pelo menos uma rodada completa de aquisição para garantir que tudo esteja funcionando corretamente. Em seguida, sente-se e permita que o computador e o microscópio façam o trabalho.

Para revisar os dados, selecione aplicativos, revise dados multidimensionais na barra de menus, selecione a exibição de local do arquivo e selecione uma posição de estágio. Clique em carregar imagens para revisar a pilha de imagens dessa posição. Depois que as imagens forem carregadas, use o mouse para avançar pelos dados quadro a quadro.

Aqui são gerados filmes de células mitóticas usando metamorfose. Para fazer um filme no Metamorph, selecione stack make movie. Na barra de menus, selecione quais quadros usar a velocidade e o tipo de arquivo do filme.

Em seguida, selecione salvar para fazer uma montagem. Primeiro, salve os dados como um arquivo STK de pontos no metamorfo. Em seguida, abra a imagem J Abra o arquivo stk do ponto na imagem J e corte uma região de interesse marcando a região e selecionando o corte da imagem na barra de menus.

Em seguida, selecione pilhas de imagens. Fazer montagem especificar quais quadros incluir o tamanho e a forma da montagem. E se entre as bordas do quadro são desejadas.

Em seguida, clique em ok. Salve a montagem como um arquivo dot tiff. Finalmente, calcule o tempo em cada estágio da mitose, designando o quadro em que o primeiro sinal de condensação de DNA ou arredondamento celular é evidente, pois T é igual a prófase zero.

A prometáfase termina quando os cromossomos estão alinhados no equador, a metáfase prosseguirá até que o DNA comece a segregar a telófase anáfase. E, finalmente, a citocinese segue e as células começam a se achatar. Imagem de lapso de tempo de células hilares expressando sua pedra.

H dois BCFP é mostrado. Essas células foram transfectadas com irna controle e progridem normalmente ao longo do ciclo celular. Em comparação, as células que foram transfectadas com siRNAs direcionados contra a poragem nuclear NUP 1 53 deslocam alterações graves na progressão do MIT.

Acabamos de mostrar como configurar, executar e analisar um experimento de imagem de lapso de tempo para determinar o tempo de progressão mitótica das células após a transfecção. Ao fazer este procedimento, é importante ser o mais gentil possível com as células, mantendo a temperatura e as concentrações de CO2 adequadas e limitando a quantidade de luz à qual as células estão expostas. Então é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.