Name: Incorporação de plástico e secção de embriões Xenopus laevis (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 39 s
Description: Aprenda a preparar secções plásticas de embriões Xenopus laevis para imunofluorescência de alta resolução. Este método preserva a morfologia tecidual verdadeira e permite estudos detalhados de localização proteica.

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Fixação <ol><li> Transferência de embriões todo ou explantes dissecado em MEMFA ou 3,7% FA + PBS em um pequeno frasco de vidro de cintilação (Fisher cat # 03-339-25B). Incubar frasco na nutator na RT, somente por 2 horas, e não mais do que isso. Não deixe o embrião na FA por mais de duas horas. Mais incubação em FA fará o tecido embrionário mais difícil e resultar em uma penetração pobres de anticorpos no processo de detecção. </li><li> Aspirar a maioria das FA e adicionar fixador Dent até o topo do frasco (~ 4,5 ml). Inverta suavemente o frasco para algumas vezes para lavar os embriões em Dent, a troca com outro 4.5ml de fresco Dent, e incubar em -20 º C durante pelo menos 48 horas. Durante a noite não é suficiente. Essa etapa faz os embriões mais permeável para o anticorpo. Embriões pode ser mantido nesta condição por várias semanas. </li></ol> Imunofluorescência <ol><li> Reidratar a amostra. Incubar em uma série graduada de metanol, como segue: <table style="width: 171px; height: 119px;" border="0" cellpadding="3"><tbody><tr><td> 75% MeOH / H 2 O </td><td> 10min </td></tr><tr><td> 50% MeOH / PBS </td><td> 10min </td></tr><tr><td> 25% MeOH / PBS </td><td> 10min </td></tr><tr><td> PBS </td><td> 10min </td></tr><tr><td> PBS </td><td> 10min </td></tr></tbody></table> </li><li> Faça agarose 1,5% / PBS placas com 60 milímetros pratos de plástico. Despeje PBS em cima do agarose depois tornou-se sólido. </li><li> Hemi-secção da embriões: Coloque os embriões em uma placa de agarose 1,5% / PBS. Agarre um embrião com um par de fórceps e corte-o ao meio através do centro do embrião usando uma lâmina fina. Escolha os que você tem com sucesso cortado ao meio com um plano de corte reto. <img src="/files/ftp_upload/old/188_2008_7_10_3/188_figure-01.jpg" alt="Figura 1" width="591" height="193" /> </li><li> Transferir os embriões bisected em um frasco de cintilação de vidro com PBT. Intercâmbio com 4,5 ml de soro de cabra 20% + PBT. Incubar a RT por 2 horas em um nutator (bloqueio). </li><li> Preparar uma diluição adequada do anticorpo primário em PBT. 0,5 ml de amostras por isso é necessário. Por exemplo, eu usei 1 / 200 de diluição de coelho anti-C-caderina PAB para estudar a localização subcelular de C-caderina em 5 milímetros seções de plástico. </li><li> Aspirar a solução de bloqueio e adicionar 0,5 ml do anticorpo diluído primária. Colocar os frascos na posição de stand-up em um tubo de suporte de isopor. Incubar overnight a 4 º C em um nutator. </li><li> Remover o anticorpo diluído primário (este anticorpo diluído primárias podem ser salvas e reutilizadas nos próximos 1-2 semanas). Lavar com 4.5ml de PBT por 4 vezes (40-60 minutos cada) em temperatura ambiente. </li><li> Intercâmbio com 0,5 ml da diluição 1 / 100 de Biotina-conjugado anticorpo secundário em PBT. Incubar overnight a 4 º C em um nutator. Cobrir os frascos com papel alumínio para proteger da luz biotina. </li><li> A partir deste ponto, deve ser tomado cuidado para proteger a amostra da luz ou seja, manter os frascos em algumas tampa ou papel alumínio. </li><li> Remover o anticorpo Biotina-secundário (este também pode ser reutilizado nos próximos 1-2 semanas). Lavar com ou 4.5ml de PBT por 4 vezes (40-60 minutos cada) em temperatura ambiente. </li><li> Intercâmbio com 0,5 ml de 1 / 200 de diluição de fluorescência-rotulados (FITC, Texas-vermelho, etc) Estreptavidina em PBT. Incubar overnight a 4 º C em um nutator. </li><li> Remova a estreptavidina (este pode ser reutilizado, também). Lavar com 4.5ml de PBT por 3 vezes (15-30 minutos cada) em temperatura ambiente. </li><li> Fixar os embriões em 4,5 ml de 3,7% FA + PBS por 30 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Lavar com 4,5 ml de PBS duas vezes. </li><li> Desidratar a amostra. Incubar em uma série graduada de etanol, como segue: <table style="width: 172px; height: 80px;" border="0"><tbody><tr><td> 30% EtOH / H 2 O </td><td> 10 min </td></tr><tr><td> 50% EtOH / H 2 O </td><td> 10 min </td></tr><tr><td> 75% EtOH / H 2 O </td><td> 10 min </td></tr><tr><td> 100% EtOH </td><td> 10 min </td></tr></tbody></table> </li><li> O espécime pode ser armazenada em 100% EtOH a 4 º C com uma capa para protegê-lo da luz. </li></ol> Infiltração <ol><li> Faça Technovit mix infiltração 7100. Eu costumo tomar 15ml do líquido de base em um tubo de 50ml cónico, juntar 150mg de endurecedor I e misturá-lo balançando em um nutator por 15 minutos. Esta mistura de infiltração pode ser mantido a 4 ° C por até um mês. </li><li> Infiltrar-se na amostra com a mistura de infiltração por troca com uma série graduada de infiltração Technovit combinação mix / EtOH, como segue: <ol><li> 50% Technovit / EtOH - 1 hora </li><li> 100 Technovit% - 1 hora </li><li> 100 Technovit% - durante a noite </li></ol></li><li> O specimen pode ser armazenado no mix de infiltração de 100% para até um mês a 4 º C. Colocar uma cobertura sobre as amostras para protegê-los da luz. </li></ol> Incorporação <ol><li> Faça Technovit mix incorporação de 7100: Take 0.75ml do mix de infiltração em um tubo de 1,5 ml e adicione 50 ml de endurecedor II. Misturá-lo por vezes invertendo o tubo várias. </li><li> Usando uma pipeta de plástico, tomar um espécime infiltrado overnight em 0,5 ml fino tubo de PCR parede. Remover a maior parte do sobrenadante. </li><li> Adicionar 0,25 ml da mistura de incorporação feito na etapa 1 desta seção, &quot;Incorporação&quot;, com o modelo. Orientar o embrião bisected para fazer o plano de dissecção virado para a parte inferior do tubo, suavemente empurrando com uma agulha de dissecção maçante-ponta (madeira de manusear a agulha de dissecação). </li><li> Feche a tampa e incubar o tubo em um lugar escuro por aproximadamente quatro horas para permitir que o plástico polimerizar. </li><li> Faça Technovit mix 3040. Tomar 1 grama do pó a um prato de pesagem, e adicionar 0,5 ml do líquido. Imediatamente, misture o pó e líquido utilizando um bluetip. Despeje em cima do spacimen endurecido. Este Technovit amarelo 3040 irá impedir o bloco inteiro de plástico de sair do tubo. </li></ol> Seccionamento <ol><li> Limpe Histoknife H com xileno (EtOH muitas vezes não é bom o suficiente) e configurá-lo em seu micrótomo. Ângulo da lâmina de aproximadamente 45 °. Limpe a área de palco na frente da lâmina com xilol, também, porque a limpeza desta área é fundamental para a qualidade de fatias seccionadas. </li><li> Cortar a lateral do tubo e descasque a ponta fora de usar uma faca de papelão. <img src="/files/ftp_upload/old/188_2008_7_10_5/188_figure-02.jpg" alt="Figura 2" width="818" height="243" /> </li><li> Definir a amostra no suporte chuck do micrótomo. </li><li> Anexar um &quot;press-selar&quot; isolante de silício em um copo de slides para fazer uma câmara de montagem para fatias seção. Pressione firmemente o isolador para o slide na bancada limpa e olhar do outro lado para certificar-se que o isolante é completamente ligado sem-bolhas de ar. Despeje limpa e morna dH 2 O (~ 40 ° C) para a piscina no slide utilizando uma pipeta Pasteur, até o nível onde ele pode ser visto que a superfície da água torna-se plana, e não côncavo ou convexo em forma. </li><li> Comece a fazer fatias seção. Para estudos de imunofluorescência, faço 5 fatias seção mm. Em amostras de hibridização in situ, a espessura das fatias pode ser ajustado na faixa de ~ 3-8 mm, dependendo da finalidade e as intensidades dos sinais. </li><li> Realizar as fatias seção do palco na frente da lâmina para a câmara de montagem com água, utilizando um pincel pequeno. Segure o pincel com uma fatia no topo da piscina de água e soltar a fatia para a água batendo-a com uma agulha de dissecção maçante-ponta. A fatia vai expandir em uma forma circular, assim que atinge a superfície da água. </li><li> Quando a maioria da área de superfície da água da câmara de montagem é repleta de fatias seção, sugam quase metade da água com uma pipeta Pasteur. Incubar as lâminas em uma noite quente de slides para tornar a amostra completamente seca. </li><li> Counter-mancha com 1 ml de DAPI (0.1mg/ml em TE) durante cinco minutos. Aspirar DAPI e secar a amostra. </li><li> Remova o isolante de borracha de silicone do slide. Agora podem ser tiradas da amostra. Conservar a amostra a 4 ° C, protegido da luz. </li></ol>

Anticorpo primário contra o antígeno ou epítopo etiquetas: Faça uma diluição adequada em PBT. Biotina conjugado anticorpo secundário: biotina vários fornecedores vendem anticorpos conjugados.

incorporação de plástico e secção de embriões xenopus laevis

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Perfis plásticos manter morfologia do tecido verdadeiro em seções de tecido fino que pode ser imunocoloração com fluorescentes anticorpos secundários, tornando este método mais útil do que seções parafina ou congelados para muitos tipos de tecido. O método para a coloração, a incorporação de plástico, e secção é demonstrada neste vídeo.

Incorporação de plástico e secção de embriões Xenopus laevis

Olá, meu nome é Sochi Ota. Sou cientista pós-doutoranda no laboratório do Dr. Ken Cho, do Departamento de Biologia do Desenvolvimento e Celular da Universidade da Califórnia, Irvine. Hoje, mostrarei a vocês o preparo de seções simples de embrião de Xenopus.Este procedimento inclui a bissecção de embriões de rã em estágio avançado de desenvolvimento, coloração com anticorpo contra a molécula de interesse, infiltração em plástico e obtenção de cortes plásticos de cinco mícrons. Este procedimento pode ser utilizado para estudar imunofluorescência, imunohistoquímica ou hibridização in situ com imagens de resolução muito elevada. Ok, essas são as pequenas ferramentas práticas que utilizo para o corte plástico de embriões, para mais de 10 embriões.Esta é uma pinça metálica com ponta em delta e esta, número um, pode ser usada para orientar o embrião no plástico. E número dois, pode ser usada juntamente com este pincel para transferir o embrião do micrótomo para a superfície de montagem. Este é um isolante de borracha de silicone, que coloco na superfície da lâmina e que forma um menisco de água onde posso montar as fatias de embriões seccionados em plástico.Agora estou mostrando como bisseccionar o embrião, embrião fixado para ensaios como hibridização in situ ou detecção por imunofluorescência. E para cortar o embrião ao meio, uso esta grade de corte muito fina, que pode ser comprada em mercearias. Acho que sim, há embriões fixados com 3,7% de formaldeído durante a noite.E isso depende do propósito, a forma como você faz a fixação. Esta é feita durante a noite inteira. Para hibridização por incisão, você pode optar pela fixação durante a noite, mas para detecção por imunofluorescência, na qual se detecta a proteína no interior do embrião, não recomendo uma fixação muito prolongada.E prefiro fazer a fixação com formaldeído a 3,7% por apenas duas horas para minimizar a influência na localização subcelular da proteína e também evitar uma superfixação, permitindo uma boa penetração do anticorpo durante a etapa de detecção. Ok, agora estou dissecando este embrião através do corte da parede blastular no lado esquerdo e no lado direito. Agora vejo que este é um embrião em estágio 11, no qual o primórdio ovariano se estende por completo desde o lado dorsal até o lado ventral, mas é um embrião bi.E vamos dar uma olhada nesta peça do lado direito. Você observa o blastopo em ambos os lados dorsal e ventral, mas o lado dorsal é mais evidente porque essa invaginação está claramente alcançando a região mais profunda no interior do embrião, em comparação com o lado ventral. Portanto, esta é uma boa peça, bem dividida, para estudar ambos os lados, dorsal e ventral.No interior do embrião, neste embrião dissecado, vou utilizar a detecção por imunofluorescência de proteína expressa no interior do embrião. E para imunofluorescência ou imunohistoquímica, você usa um anticorpo específico para detecção. Mas o problema é que o anticorpo não penetra muito bem no interior do embrião.Portanto, se você usar embrião inteiro, não poderá saber. Não é possível estudar o padrão de expressão de suas proteínas no embrião. Mas, utilizando este embrião pré-bissectado, é possível estudar qual é o padr inflammção celular no interior profundo do embrião.Ah, o embrião corado já foi fixado em formaldeído a 3,7%, desidratado em etanol e infiltrado no plástico, chamado tecnovil 7,100. Este kit contém três partes: esta parte líquida principal e este pó, chamado endurecedor um. E este líquido chamado endurecedor dois.Primeiro, misturo a parte principal e o endurecedor na proporção de 100 para 1, o que vai resultar na mistura de infiltração. Essa mistura é um líquido no qual infiltro este embrião. E ela ainda está líquida, de modo que não vai endurecer ainda.E estes embriões são deixados nesta mistura de infiltração durante a noite para garantir que as amostras de embrião fiquem completamente incluídas neste plástico. Agora, tomo uma das amostras de embrião com uma pipeta de transferência e a transfiro para um tubo fino de 0,5 MPCL, que utilizo como molde de inclusão. Em seguida, removo o líquido em excesso deste embrião.E agora, este embrião já está pronto para ser embutido no plástico de polimerização. Para preparar o plástico de polimerização, você mistura esta mistura de infiltração com este tubo de endurecedor na proporção de 15 para 1. Por exemplo, se eu usar 750 microlitros desta mistura de infiltração em um tubo, devo adicionar também 50 microlitros deste endurecedor para iniciar a polimerização do plástico; depois de adicioná-lo, ops, feche a tampa e misture suavemente assim.E você não deve fazer vórtex porque o oxigênio é o inibidor da reação de polimerização. Adicione aproximadamente 250 microlitros dessa mistura ao embrião. E esta etapa de polimerização leva quase quatro horas; portanto, você não precisa se apressar em absoluto.Após adicionar primeiro este plástico polimerizante, você pode movê-lo para cima e para baixo para fazer o embrião flutuar no plástico. Agora, utilizo esta pinça de metal para movimentar o embrião e orientá-lo de modo que a superfície de corte do embrião fique na parte inferior deste molde de inclusão. Em seguida, feche a tampa, pois o oxigênio é um inibidor da reação de cura, e deixe por quatro horas para permitir a reação de polimerização.Depois disso, este é um HUD já inserido na amostra. Você coloca um tipo de cola nesta amostra para garantir que esta parte plástica dura não saia desse molde. Este é um outro plástico que atua como cola para essa finalidade, chamado techno 30 40.E estou misturando este pó e líquido com 2, 2, 1 aqui sendo 0,6 grama deste pó. Então vou adicionar 300 microlitros deste líquido, misturá-los rapidamente e este plástico endurece bastante rápido. Portanto, esta é uma etapa em que você precisa ser um pouco firme antes de despejar isso sobre esta amostra já endurecida.Isso é suficiente. Feche a tampa. Eu fico assim.E isso levará aproximadamente de 30 a 60 minutos para endurecer. E esta é a que está pronta para ser utilizada. Primeiro, corto a ponta do molde com uma faca de papelão, removendo essa parte da ponta deste molde.Agora, o embrião embutido está exposto. Também cortei essa tampa, pois não preciso dela. Agora pego esta lâmina de tain Roy, quero dizer, não a agulha, mas a lâmina de tain Roy, que é mais dura do que a lâmina de aço inoxidável comum usada para cortes de parafina.Mergulho brevemente isso em Xin para limpá-lo. Coloque isso no suporte da lâmina e remova o excesso de zaine. Às vezes, limpo também esta área com zaine, porque a limpeza dessa região é absolutamente importante.Agora está pronto para o corte em seções. Antes de iniciar o corte, preparo a câmara de montagem. Esta é a lâmina de vidro.E por cima disso, estou colocando esta borracha de silicone e empurrando firmemente por toda a volta, para que não haja qualquer vazamento. Coloque isso no aquecedor de lâminas e despeje esta água limpa para formar a nossa piscina. Adicione tanta água quanto necessário até atingir a superfície inundada.E isso é importante porque essa superfície de água alagada proporciona uma distribuição uniforme da tensão superficial da água, o que é essencial para fazer a seção se estender de maneira igual. Agora estou realizando a secção, mas antes disso uso esta máscara porque cada pedaço da seção é tão leve, tão leve que minha respiração pode derrubá-lo do estágio. Por isso uso esta máscara.E agora inicie o fatiamento. Depois de obter um certo número de fatias sobre a platina, pegue-as com um pincel e mova-as lentamente para cima desta câmara em forma de montanha, batendo levemente no pincel para que as fatias caiam na água pela ação da gravidade. Assim que tocarem a água, elas se estenderão formando um pedaço circular na superfície da água.Como está aquela luz após a secagem durante a noite. Agora está assim e assim. Agora a amostra está pronta para contato com DPI para DNA nuclear.Em seguida, você pode analisar ao microscópio. Hoje demonstrei a preparação de cortes plásticos utilizando embrião de rã na fase tardia de gástrula. Este procedimento é bastante útil para estudar subestruturas celulares ou a localização de proteínas, que não podem ser analisadas usando a técnica de inclusão em parafina, e também é aplicável, em geral, mesmo para hibridização in situ.Esta seção plástica também permite, mesmo com hibridização residual, que este procedimento forneça um nível muito mais alto dessas imagens do que amostras de seção parafinada ou congelada.

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