Incorporação de plástico e secção de embriões Xenopus laevis

Perfis plásticos manter morfologia do tecido verdadeiro em seções de tecido fino que pode ser imunocoloração com fluorescentes anticorpos secundários, tornando este método mais útil do que seções parafina ou congelados para muitos tipos de tecido. O método para a coloração, a incorporação de plástico, e secção é demonstrada neste vídeo.

Olá, meu nome é Sochi ota. Sou cientista de pós-doutorado no laboratório do Dr. Ken Cho no Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento da Universidade da Califórnia. Irv I Hoje, vou mostrar-lhe a preparação da seção simpl do embrião de xenopus.

Este procedimento inclui a bissecção da coloração de embriões de rã em estágio gasoso tardio com anticorpo contra a molécula de interesse, infiltrar-se no plástico e fazer uma mesma seção de plástico de cinco mícrons. Este procedimento pode ser utilizado para estudar a imunofluorescência, imuno-histoquímica ou hibridização in situ com imagem de altíssima resolução. Ok, essas são as pequenas ferramentas úteis que eu uso para seccionamento de plástico de embriões de mais de 10 embriões.

Esta é uma pinça de metal com ponta delta e esta, número um, pode ser usada para orientar o embrião em plástico. E número dois, isso pode ser usado junto com este pincel para transferir o embrião do micrótomo para a superfície de montagem. Este é um isolante de borracha de silicone, que coloco na superfície da lâmina e que faz uma extração de água onde posso montar as fatias de embriões seccionados de plástico.

Agora estou mostrando como dividir o embrião, embrião fixo para o ensaio como hibridização do instituto ou detecção de imunofluorescência. E para cortar a metade do embrião, eu uso essa grade de deserto muito ultrafina, que você pode comprar no supermercado. Eu acho que sim, há embriões fixos fixando a célula 3,7% alta formal durante a noite.

E é assim que você conserta depende do propósito. Isso é corrigido da noite para o dia. Para fins de hibridização de incisão, você pode optar pela fixação durante a noite, mas para a detecção de imunofluorescência, que você detecta a proteína dentro do embrião, não recomendei uma fixação muito longa.

E prefiro fazer a fixação de altura de 3,7% por apenas duas horas para minimizar a influência na localização subcelular da proteína e também evitar a fixação excessiva para permitir a boa penetração do anticorpo durante a etapa de detecção. Ok, agora estou dissecando esse embrião através da parede de explosão cortando o lado esquerdo e o lado direito. Então agora eu vejo que isso tem embrião de estágio 11, onde o PO está todo o caminho do lado dorsal para o lado ventral, mas bi um embrião.

E vamos dar uma olhada nessa peça da mão direita. Você vê o po bloso tanto no lado dorsal quanto no lado ventral, mas o lado dorsal é óbvio porque essa invaginação está claramente chegando ao fundo do embrião em comparação com o lado ventral. Portanto, esta é uma boa peça, uma boa peça dividida ao meio para estudar o lado dorsal e ventral.

Dentro do embrião, esse embrião dissecado, vou usar a detecção de imunofluorescência da proteína expressa dentro do embrião. E para imunofluorescência ou imuno-histoquímica, você usa anticorpo específico de anticorpo para detecção. Mas o problema é que o anticorpo não penetra muito bem no interior do embrião.

Então, se você usar embrião de montagem inteira, embrião de montagem inteira, você não pode saber. Você não pode estudar o padrão de expressão de suas proteínas no embrião. Mas usando este embrião pré-dividido, você pode estudar qual é o padrão de expressão na célula no interior do embrião.

Ah, o embrião manchado já foi fixado em 3,7% de formaldeído desidratado em etanol e infiltrado no plástico, que é chamado de techno 7, 100. E este kit contém três partes, que é essa parte principal líquida e esse pó, que é chamado de endurecedor. E esse líquido chamado endurecedor dois.

Primeiro eu misturo essa parte principal e endurecedor com 100 para um reio, o que vai te dar essa mistura de infiltração. E é isso que é, isso é um líquido, ao qual estou infiltrado neste embrião. E isso ainda é líquido, então não vai endurecer ainda.

E esta é a amostra de embriões deixada nesta mistura de infiltração durante a noite para garantir que a amostra de embrião seja completamente resumida neste plástico. Agora eu pego este embrião de amostra com pipeta de transferência e transfiro para um tubo de parede fina de 0,5 MPCL, que uso como molde de incorporação. Então, deste embrião, removo o excesso de líquido.

E agora este embrião, este embrião já está pronto para ser incorporado no plástico endurecido. Para fazer o plástico endurecido, você mistura essa mistura de infiltração com esse tubo endurecido a 15 para um. Então, por exemplo, se eu pegar 750 microlitros dessa mistura de infiltração para sustentar o tubo, devo adicionar 50 microlitros desse endurecedor também para iniciar a polimerização do plástico depois de adicioná-lo, opa, feche a tampa e misture suavemente assim.

E você não deve fazer vórtice porque o oxigênio é o inibidor da reação de polimerização. Adicione aproximadamente 250 microlitros desta mistura ao embrião. E essa etapa de polimerização leva quase quatro horas que você deveria, você não precisa se apressar.

Depois de adicionar este plástico polimerizante primeiro, você pode canalizá-lo para cima e para baixo para fazer, fazer o embrião flutuar no plástico. E agora eu pego essa pinça de metal ed para empurrar o embrião para orientá-lo de modo que a superfície de corte do embrião chegue ao fundo desse molde de incorporação. Em seguida, feche a tampa porque o oxigênio é um inibidor da reação de cura e deixe-a por quatro horas para permitir a reação de ização.

Depois disso, este é um rebanho HUD já na amostra. Você coloca uma espécie de cola nessa amostra para garantir que essa parte dura de plástico não saia desse molde. Este é o, este é um outro plástico que funciona como uma cola para esse fim chamado techno 30 40.

E estou misturando esse pó e líquido com 2, 2, 1 aqui está 0,6 grama desse pó. Então, vou adicionar 300 microlitros desse líquido, depois misturá-lo rapidamente e esse plástico endurece muito rapidamente. Então, essa é uma parte, você tem que ser um pouco duro e depois despejar isso nessa amostra já ouvida.

Isso é bom o suficiente. Feche a tampa. Eu pareço assim.

E isso levará aproximadamente 30 a 60 minutos para ficar duro. E este é o que está pronto para ser acionado. Primeiro, cortei a ponta do molde com uma faca de papelão, retirei essa parte da ponta desse molde.

Então, agora esse embrião embutido está exposto. E também cortei essa tampa porque não preciso dela. Agora eu pego essa agulha Roy, quero dizer, não a lâmina Roy da agulha, que é mais dura do que a lâmina de mancha normal usada para seccionamento de parin.

Eu mergulho isso brevemente no Xin para torná-lo limpo. Defina isso para o, coloque isso no porta-lâmina e limpe o excesso de zaine. E às vezes eu limpo essa área com zaine também porque a limpeza dessa área é absolutamente importante.

Agora está pronto para seccionamento. Antes de começar a seccionar, montei a câmara de montagem. Então, isso é vidro deslizante.

E, além disso, estou colocando essa borracha de silicone e empurrando o agricultor até o fim para que não haja vazamento. E coloque isso no aquecedor de slides e despeje essa água medicinal limpa para fazer nossa piscina. E coloque o máximo de água para fazer você chegar até chegar à superfície da água da inundação.

E isso é importante porque essa superfície de água de inundação fornece distribuição igual da tensão superficial da água, o que é importante para fazer com que a seção se estenda igualmente. Agora estou seccionando, mas antes de fazer isso eu uso essa máscara porque cada pedaço de seção é tão leve, tão leve e meu, meu peito pode explodir para longe do palco. Então eu uso essa máscara.

E agora comece a seccionar. Depois de colocar um certo número de peças de seção no palco, você pega isso com um pincel e se move lentamente em cima dessa câmara de montanha e bate nesse pincel para fazer com que essas peças entrem na água por gravidade. E assim que pousam na água, eles se estendem para formar uma peça circular na superfície da água.

Como está essa luz depois de secar durante a noite. Agora é parecido com isso e isso. Agora a amostra está pronta para entrar em contato com o DPI para DNA nuclear.

E então você pode estudar sob o microscópio. Hoje mostrei a vocês a preparação da seção plástica usando embrião de rã em estágio gasoso tardio. Este procedimento é bastante útil para estudar subcélulas ou localização de proteínas, que não podem ser estudadas usando a técnica de incorporação entre parênteses e também isso em geral, mesmo para hibridização residual.

Esta seção de plástico também oferece até mesmo hibridização residual, este procedimento pode fornecer imagens de nível muito mais alto do que a amostra de seção parênesis ou congelada.